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編譯：伊安，編輯：景行、江舜堯。

原創(chuàng)微文，歡迎轉(zhuǎn)發(fā)轉(zhuǎn)載。

原名：Dynamic transcriptome analysis unveils key proresolving factors of chronic inflammatory arthritis

譯名：轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示慢性炎癥性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵調(diào)控因子

期刊：Journal of Clinical Investigation

IF：11.864

發(fā)表時(shí)間：2020年8月

通訊作者：Wan-Uk Kim

通訊作者單位：韓國(guó)加圖立大學(xué)

DOI號(hào)：10.1172/JCI126866

1.建立CIA模型，對(duì)不同病理時(shí)期關(guān)節(jié)組織進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，并通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)不同病理時(shí)期促炎、抗炎細(xì)胞因子mRNA表達(dá)；

2. qRT-PCR、IHC、Western blotting檢測(cè)滑膜組織中Itgb1、Ywhaz、Rps3 mRNA、蛋白表達(dá)；

3. qRT-PCR、流式、Western blotting檢測(cè)T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞亞群中Itgb1、Ywhaz、Rps3 mRNA、蛋白表達(dá)；

4. qRT-PCR檢測(cè)tgb1、Ywhaz、Rps3對(duì)FLSs促炎細(xì)胞因子的影響；

5. ELISA分別檢測(cè)有無(wú)抗風(fēng)濕藥干預(yù)CIA小鼠血清中Ywhaz水平；

6. qRT-PCR等檢測(cè)Ywhaz對(duì)CIA小鼠的治療作用。

為了描述CIA模型的炎癥反應(yīng)，研究人員向老鼠尾部注射CFA和CII后進(jìn)行關(guān)節(jié)炎評(píng)分，來(lái)監(jiān)測(cè)隨時(shí)間變化CIA模型關(guān)節(jié)炎的臨床嚴(yán)重程度。結(jié)果與之前研究類(lèi)似：關(guān)節(jié)炎在4周時(shí)開(kāi)始誘發(fā)， 9周達(dá)到高峰，但在15周時(shí)自然消退（圖1A）。為了驗(yàn)證炎癥的消退，在免疫前（非免疫）和免疫后的誘導(dǎo)期（6周）、高峰期（9周）和消退期（15周）對(duì)關(guān)節(jié)組織中促炎細(xì)胞因子(Ptgs2、Il6、Il1b)和抗炎細(xì)胞因子（Il-4、Il-10、Tgfb1）的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)（圖1B）。研究發(fā)現(xiàn)Ptgs2、Il-6、Il-1b mRNA表達(dá)水平在高峰期明顯高于非免疫期和誘導(dǎo)期。相反，Ptgs2、Il-6的mRNA表達(dá)水平在高峰期和消退期之間顯著降低，表明炎癥受到抑制。同時(shí)，Il-4、Il-10、Tgfb1 mRNA表達(dá)水平在消退期較非免疫期和誘導(dǎo)期顯著上調(diào)，表明抗炎反應(yīng)增強(qiáng)，消退期Il-4、Il-10、Tgfb1的表達(dá)水平分別是免疫前的3.7、11.4和7.0倍，也是誘導(dǎo)期的3.0、2.5和2.6倍，而且仍然顯著高于高峰期。接下來(lái)對(duì)誘導(dǎo)、高峰和消退期的CIA小鼠關(guān)節(jié)組織進(jìn)行了基因表達(dá)譜分析。已知消退期的相關(guān)基因參與抑制免疫細(xì)胞浸潤(rùn)、吞噬凋亡的免疫細(xì)胞和巨噬細(xì)胞激活或組織修復(fù)（補(bǔ)充 圖1A）。此外，用CIBER-SORT方法對(duì)在CIA進(jìn)展過(guò)程中的不同免疫細(xì)胞活性動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Tregs和M2巨噬細(xì)胞在消退期顯著增加(P<0.05)，這2種免疫細(xì)胞的相關(guān)基因表達(dá)水平的增加得到證實(shí)(補(bǔ)充圖1、B和C，以及補(bǔ)充表1和2)。結(jié)果表明，與其他免疫細(xì)胞相比，Tregs和M2巨噬細(xì)胞在CIA進(jìn)展過(guò)程中的活性顯著增加(P<0.05)，2個(gè)標(biāo)志免疫細(xì)胞抑制的基因上升驗(yàn)證了這一點(diǎn)(補(bǔ)充 圖1B、1C，補(bǔ)充 表1、 2)。所有數(shù)據(jù)支持了研究人員系統(tǒng)分析的有效性。

2  免疫細(xì)胞分子機(jī)制與CIA治療相關(guān)

為了鑒定和表征與CIA消退相關(guān)基因，研究人員接下來(lái)對(duì)高峰期與誘導(dǎo)期（(P/I)）和誘導(dǎo)期和消退期與高峰期(R/P)的差異表達(dá)基因（DEGs）進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)了P/I 和R/P中各有1795和1881個(gè)差異表達(dá)基因（補(bǔ)充 表3）。然后，選擇了6個(gè)DEG簇（C1-C6），在消退期顯示上調(diào)的是C3、 C5，下調(diào)的是C2、 C4，同時(shí)它們?cè)诟叻迤谏险{(diào)或下調(diào)，并在消退期趨于平穩(wěn)(圖1C和補(bǔ)充 表4)。GO生物學(xué)過(guò)程（GOBP）富集分析表明，C3和C5分別代表T細(xì)胞分化/活化和巨噬細(xì)胞(NF-κB信號(hào))功能，C6代表巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞的活化(P<0.05)。(圖1D，補(bǔ)充 圖2A，補(bǔ)充 表5)。參與T細(xì)胞功能的DEG網(wǎng)絡(luò)模型顯示，在CIA進(jìn)展過(guò)程中，TGF-β、JAK/STAT、TCR信號(hào)被激活(補(bǔ)充圖2B)。qRT-PCR分析證實(shí)有4個(gè)基因在消退期上調(diào)，它們與TGF-β (Smad4)、JAK/STAT (Foxp3)、TCR (Malt1 和 Nfatc3)信號(hào)通路相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等在內(nèi)的多種免疫細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路共同促進(jìn)了CIA模型關(guān)節(jié)炎的消退。

3  網(wǎng)絡(luò)分析治療CIA的關(guān)鍵調(diào)控因子

為了識(shí)別CIA消退相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控因子，研究人員通過(guò)蛋白-蛋白相互作用從P/I和R/P比較中構(gòu)建出包含2836個(gè)DEG的網(wǎng)絡(luò)模型（補(bǔ)充 表6）。然后根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)：(a)在消退期相關(guān)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的中心分子（P＜0.05） (b) 與激活T細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞的功能相關(guān)的分泌抗炎因子（補(bǔ)充注釋2、圖3，補(bǔ)充表7、8)），選擇了3個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子——C3中的整合素β1亞基（Itgb1）、酪氨酸3/色氨酸5單加氧酶激活蛋白ζ（Ywhaz），C5中核糖體蛋白S3 (Rps3)。接下來(lái)通過(guò)qRT-PCR證實(shí)了Itgb1、Rps3、Ywhaz在R/P上調(diào)（圖 2A）。通過(guò)免疫組化（圖 2B）和Western blotting（圖 2C）檢測(cè)其蛋白在滑膜組織中的表達(dá)，結(jié)果表明滑膜組織中3種蛋白的表達(dá)水平在消退期明顯高于高峰期。Itgb1、Rps3、Ywhaz在CIA大鼠模型中的表達(dá)增加(圖 2D)，表明它們與CIA消退期相關(guān)。

圖2. CIA消退的關(guān)鍵調(diào)控因子。（A-B）qRT-PCR、免疫組化分別檢測(cè)關(guān)鍵調(diào)控因子Itgb1、Ywhaz、Rps3 mRNA和蛋白的表達(dá)；（C）Western blot檢測(cè)小鼠滑膜組織中Itgb1、Ywhaz、Rps3蛋白表達(dá)；（D）Western blotting檢測(cè)P、R期大鼠滑膜組織中Itgb1、Rps3、Ywhaz蛋白表達(dá)。

4  Itgb1、Rps3、Ywhaz在Tregs和M2巨噬細(xì)胞中的顯著表達(dá)

接下來(lái)實(shí)驗(yàn)是確定消退期哪些免疫細(xì)胞Itgb1、Rps3、Ywhaz表達(dá)增加，研究人員推測(cè)消退期Itgb1、Rps3、Ywhaz表達(dá)上調(diào)可能是由于表達(dá)這些基因的免疫細(xì)胞被激活。為了解決這個(gè)問(wèn)題，研究人員對(duì)B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或T細(xì)胞激活后3種關(guān)鍵調(diào)控因子表達(dá)是否上調(diào)進(jìn)行研究。當(dāng)分別用抗CD3+抗CD28抗體、抗IgM抗體和脂多糖(LPS)處理CD4+和CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞時(shí)，流式結(jié)果顯示Itgb1、Rps3、Ywhaz表達(dá)上調(diào)(補(bǔ)充圖 4A)。與siRNAs處理的CD4+T細(xì)胞對(duì)照組相比，靶基因siRNAs處理的CD4+T細(xì)胞中調(diào)控因子的表達(dá)顯著降低，證實(shí)了所用抗體的特異性(補(bǔ)充圖4B)。

基因表達(dá)分析顯示T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞亞群，特別是Treg細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞與CIA消退密切相關(guān)。因此，首先研究了T細(xì)胞亞群和這3個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子的關(guān)系。在CD4+T輔助細(xì)胞(Th)的多種亞型中，Treg在抑制慢性炎癥中起重要作用。因此，研究人員檢測(cè)了4種CD4+T輔助細(xì)胞亞型(Th1、Th2、Th17和Treg；補(bǔ)充 圖5)中3種關(guān)鍵調(diào)控因子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在這4種細(xì)胞亞型中均表達(dá)(圖3 A-C)。然而，通過(guò)流式和qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Itgb1、Rps3、Ywhaz在Tregs細(xì)胞中表達(dá)最高；Th17細(xì)胞其次(圖 3A-C)。值得注意的是，Ywhaz在tregs細(xì)胞中的高度表達(dá)，并且其表達(dá)高于Th17細(xì)胞(圖3 A-C)。Western blot分析也證實(shí)Itgb1、Rps3、Ywhaz蛋白在Tregs細(xì)胞中的表達(dá)高于Th1細(xì)胞(圖3D)。有趣的是，最近研究證明Ywhaz是存在外泌體中最常見(jiàn)的10種蛋白之一，來(lái)自腫瘤細(xì)胞外泌體的Ywhaz可傳遞到腫瘤浸潤(rùn)性T細(xì)胞，降低它的抗腫瘤活性。為了研究外泌體Ywhaz，研究人員分離出Tregs細(xì)胞的外泌體，并證明了Ywhaz蛋白與外泌體標(biāo)志的CD63共表達(dá)，這表明Ywhaz有可能從Tregs向鄰近的免疫細(xì)胞進(jìn)行外泌體傳遞(圖3e)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明這3種關(guān)鍵調(diào)控因子可能與Tregs細(xì)胞有關(guān)，有利于促進(jìn)CIA炎癥消退。

巨噬細(xì)胞是參與炎癥發(fā)展或消退的另一種重要的免疫細(xì)胞，根據(jù)周?chē)h(huán)境的不同，巨噬細(xì)胞可分化為促炎巨噬細(xì)胞(M1)或抗炎巨噬細(xì)胞(M2)。為了確定Itgb1、Rps3、Ywhaz是否在巨噬細(xì)胞中表達(dá)，研究人員首先用CD68和每個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子的雙重免疫熒光染色檢測(cè)了它們?cè)诨ぞ奘杉?xì)胞中的表達(dá)。研究人員觀察到CD68和關(guān)鍵調(diào)控因子在細(xì)胞上共定位表達(dá)（圖 4），表明CIA關(guān)節(jié)中的滑膜巨噬細(xì)胞表達(dá)Itgb1、Rps3、Ywhaz。通過(guò)免疫熒光染色，研究人員還比較了滑膜組織中M1和M2型巨噬細(xì)胞的分布。在消退期和高峰期滑膜巨噬細(xì)胞CD68均有表達(dá)，但在消退期(數(shù)據(jù)未顯示)，M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因Arg1與滑膜巨噬細(xì)胞基因CD68共表達(dá)更加頻繁 (數(shù)據(jù)未顯示)，這證實(shí)M2型巨噬細(xì)胞與關(guān)節(jié)炎消退相關(guān)。接下來(lái)，研究人員對(duì)這3個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子在M0型巨噬細(xì)胞分化的M1和M2中是否存在差異表達(dá)進(jìn)行研究(補(bǔ)充 圖6)。qRT-PCR和Western blotting結(jié)果顯示M2型巨噬細(xì)胞Itgb1、Rps3、Ywhaz的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于M0和M1型巨噬細(xì)胞(圖4、B和C)。此外，它們?cè)贛1型巨噬細(xì)胞中的mRNA水平顯著(P<0.01)低于M0型巨噬細(xì)胞(圖4B)，盡管這種差異表達(dá)模式在蛋白水平上不那么明顯。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，3種潛在的關(guān)鍵調(diào)控因子Rps3和Ywhaz優(yōu)先表達(dá)于抗炎的M2型巨噬細(xì)胞，而不是促炎的M1型巨噬細(xì)胞，因此M2型巨噬細(xì)胞可能參與了CIA的消退。

圖3. T細(xì)胞中3個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子Itgb1、Ywhaz、Rps3的表達(dá)。（A）檢測(cè)小鼠CD4 + T輔助細(xì)胞未分化和分化亞型中3種調(diào)控因子mRNA表達(dá)；（B-C）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T輔助細(xì)胞亞型中Itgb1、Rps3、Ywhaz蛋白的表達(dá)；(D) Western blot檢測(cè)Th1細(xì)胞和Tregs中Itgb1、Rps3、Ywhaz蛋白表達(dá)；（E）Western blot 檢測(cè)Treg細(xì)胞裂解液和外泌體中Ywhaz、Bcl2、CD63蛋白表達(dá)。

圖4. 巨噬細(xì)胞中3個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子Itgb1、Ywhaz、Rps3的表達(dá)。（A）檢測(cè)CD68與3個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子共表達(dá)；（B-C）用qRT-PCR和Western blotting分別檢測(cè)未分化(M0)和分化的M1和M2巨噬細(xì)胞中3種關(guān)鍵調(diào)控因子mRNA和蛋白的表達(dá)。

5  Itgb1、Rps3、Ywhaz調(diào)控促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生

基于研究之前的發(fā)現(xiàn)，Itgb1、Rps3、Ywhaz主要表達(dá)于免疫抑制細(xì)胞，包括Tregs和M2巨噬細(xì)胞，接下來(lái)研究通過(guò)使用RA相關(guān)效應(yīng)細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞和成纖維樣滑膜細(xì)胞(FLSs)進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證Itgb1、Rps3、Ywhaz的抗炎活性。在LPS刺激的小鼠脾細(xì)胞中，重組蛋白Itgb1、Rps3、Ywhaz呈劑量依賴(lài)性抑制促炎細(xì)胞因子IL-6和或TNF的產(chǎn)生（圖 5A）。在腹腔巨噬細(xì)胞中，重組蛋白Itgb1、Rps3、Ywhaz也能呈劑量依賴(lài)性地抑制LPS誘導(dǎo)的IL-6和TNF mRNA和/或蛋白表達(dá)的增加(圖5、B和C)。相反，在LPS刺激的腹腔巨噬細(xì)胞中，重組蛋白Itgb1、Rps3、Ywhaz則能促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子IL-10 mRNA和蛋白表達(dá)（圖 5D）。研究人員還證實(shí)，這些重組蛋白的加入對(duì)細(xì)胞增殖沒(méi)有顯著影響(補(bǔ)充 圖7)。與其對(duì)巨噬細(xì)胞的作用相比，重組蛋白Ywhaz對(duì)抗CD-3抗體+抗CD-28抗體刺激的CD+4 T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和IL-17沒(méi)有直接影響(數(shù)據(jù)未顯示)。

接下來(lái)對(duì)阻斷Itgb1、Rps3、Ywhaz表達(dá)是否能夠增加促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生進(jìn)行檢測(cè)。與siRNA處理的腹膜巨噬細(xì)胞對(duì)照組相比，敲除Itgb1、Rps3、Ywhaz的siRNAs增加了腹腔巨噬細(xì)胞IL-6和TNF mRNA表達(dá)水平(圖5e，補(bǔ)充 圖8)。此外，用抗Rps3或抗Ywhaz抗體處理后，腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6和TNF增加(圖5F)，表明內(nèi)源性Rps3和Ywhaz的減少促進(jìn)了促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

FLSs是RA中參與關(guān)節(jié)破壞的代表性效應(yīng)細(xì)胞，是侵襲性血管翳的主要組成部分。接下來(lái)檢測(cè)Itgb1、Rps3、Ywhaz在FLSs是否能夠產(chǎn)生抗炎活性，結(jié)果表明在LPS刺激的小鼠FLSs中，重組蛋白Itgb1、Rps3、Ywhaz呈劑量依賴(lài)性抑制IL-6 mRNA和蛋白的表達(dá)，（圖5G ），FLSs的增殖未產(chǎn)生顯著變化（補(bǔ)充 圖7）。相反，與腹腔巨噬細(xì)胞一樣，Itgb1、RPS3、Ywhaz基因的敲除促進(jìn)了FLSs中IL-6和/或IL-8的表達(dá)(圖5H，補(bǔ)充 圖8)，表明Itgb1、Rps3、Ywhaz的抗炎功能不僅限于巨噬細(xì)胞，而且在FLSS中也很明顯。

綜上所述，這些結(jié)果表明Itgb1、Rps3、Ywhaz可能通過(guò)抑制RA激活的效應(yīng)細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞和FLSs)中促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和/或促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生而具有抗炎活性。

圖5. 關(guān)鍵調(diào)控因子促進(jìn)抗炎反應(yīng)。（A-C）Itgb1、Rps3、Ywhaz誘導(dǎo)的IL-6、TNF mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)；（D）3個(gè)調(diào)控因子誘導(dǎo)IL-10 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)；（E）敲除Itgb1、Rps3、Ywhaz導(dǎo)致IL-6、TNF表達(dá)增加；（F）抗Rps3或抗Ywhaz單抗干預(yù)6或12小時(shí)促進(jìn)IL-6、TNF的產(chǎn)生；（G）Itgb1、Rps3、Ywhaz重組蛋白分別干預(yù)小鼠FLSs 6h后，IL-6 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)；（H）qRT-PCR檢測(cè)Itgb1、Rps3、Ywhaz siRNA轉(zhuǎn)染的FLSs IL-6、IL-8 mRNA水平。

6  Ywhaz作為治療關(guān)節(jié)炎的潛在診斷靶點(diǎn)

研究人員的最終目的是確定Itgb1、Rps3、Ywhaz是否可以分別作為預(yù)測(cè)關(guān)節(jié)炎消退和抑制關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的診斷和治療靶點(diǎn)。因?yàn)閺闹行暮蜻x分子中挑選出Itgb1、Rps3、Ywhaz具有分泌特性（補(bǔ)充 圖3A），研究人員推測(cè)這3種關(guān)鍵調(diào)控因子可以在體液(如血清和尿液)中被檢測(cè)到，同時(shí)能反映關(guān)節(jié)炎的消退狀態(tài)。為了驗(yàn)證這一假說(shuō)，研究人員對(duì)血清中Itgb1、Rps3、Ywhaz的水平在CIA的高峰和消退階段是否存在差異進(jìn)行檢測(cè)。雖然血清中Itgb1 Rps3水平?jīng)]有差異(補(bǔ)充 圖9)，但血清中Ywhaz水平在消退期明顯升高(圖6A)，表明它可以作為慢性關(guān)節(jié)炎解決的替代標(biāo)志物。這些結(jié)果再加上Ywhaz在消退期滑膜以及免疫抑制相關(guān)的Tregs和M2巨噬細(xì)胞中表達(dá)升高的發(fā)現(xiàn)，促使研究人員研究Ywhaz是否可以反映關(guān)節(jié)炎的消退情況。最后，首先將RA患者(n = 65)根據(jù)疾病活動(dòng)度(DAS28-ESR)分為3組(低、中、高活動(dòng)度)（補(bǔ)充 表9）。然后研究人員比較了三組患者血清和尿液樣本中Ywhaz的豐度。預(yù)處理前后Ywhaz水平在三組間無(wú)顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，當(dāng)對(duì)連續(xù)使用抗風(fēng)濕藥物治療4-6個(gè)月后（n=60），尿液中ΔYwhaz水平(治療前-治療后Ywhaz水平)在反應(yīng)良好組(n=23)顯著升高，在反應(yīng)中度組(n=12)無(wú)明顯變化，在無(wú)反應(yīng)組(n=25)下降(圖6B)。然而它在血清中無(wú)變化。研究人員發(fā)現(xiàn)使用甲氨喋呤、羥基氯喹、來(lái)氟米特、他克莫司和包括TNF-阻斷劑在內(nèi)的生物制劑后，各組間Ywhaz表達(dá)無(wú)差異（數(shù)據(jù)未展示）?？偟膩?lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明Ywhaz代表人類(lèi)慢性炎癥的消退，尿液中Δywhaz的水平可作為反映RA消退的替代指標(biāo)。

圖6. Ywhaz是反映小鼠CIA和人RA消退的分泌型生物標(biāo)志物。（A）ELISA檢測(cè)小鼠血清中Ywhaz蛋白在高峰期和消退期的水平；（B）比較抗風(fēng)濕藥物治療前和治療4至6個(gè)月后Ywhaz蛋白表達(dá)。

7  Ywhaz過(guò)度表達(dá)對(duì)CIA具有抑制作用

在這3個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子中， Ywhaz最能反映小鼠和人慢性炎癥的消退，這提示Ywhaz可能是治療RA的有效靶點(diǎn)。因此，研究人員試圖在體內(nèi)研究過(guò)表達(dá)Ywhaz是否能改善炎癥反應(yīng)和關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。為此，研究人員檢測(cè)了腺病毒介導(dǎo)的GFP標(biāo)記的Ywhaz基因(Ad-Ywhaz)對(duì)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和CIA小鼠關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的影響(圖7A)。正如預(yù)期的那樣，與空腺病毒載體(Ad-Con)對(duì)照組相比，GFP標(biāo)記的Ad-Ywhaz局部轉(zhuǎn)移到關(guān)節(jié)后，小鼠滑膜組織中Ywhaz的mRNA和蛋白表達(dá)水平在第3天(第33天)顯著提高。免疫后第1、2、3天(初次免疫后第31、32、33天)，熒光成像和qRT-PCR顯示關(guān)節(jié)GFP熒光和mRNA表達(dá)水平明顯高于肺和肝臟(圖7D，7 E)，實(shí)際上，GFP在肝和肺中的表達(dá)可以忽略不計(jì) (圖7D，7E)。在關(guān)節(jié)內(nèi)注射GFP后第1、2和3天(初次免疫后第31、32和33天)，GFP在關(guān)節(jié)內(nèi)的熒光和mRNA表達(dá)水平也明顯高于肺和肝臟(圖7D，7E)，但實(shí)際上GFP在肝臟和肺中的表達(dá)可忽略不計(jì)。相比之下，作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)靜脈注射Ad-Ywhaz后，肝臟和/或肺的GFP水平明顯高于關(guān)節(jié) (補(bǔ)充圖10)?？偠灾?，這些數(shù)據(jù)表明，大量Ad-Ywhaz-GFP積累在注射的關(guān)節(jié)中，消除了人們對(duì)其在關(guān)節(jié)注射過(guò)程中可能溢出或溢出的擔(dān)憂。

在第33天，小鼠滑膜組織中TNF mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(P < 0.01)，而Ywhaz mRNA表達(dá)水平則顯著上調(diào)(圖7B)。此外，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，關(guān)節(jié)內(nèi)注射Ad-Ywhaz可抑制LPS或抗CD3+抗CD28抗體刺激的淋巴細(xì)胞和脾細(xì)胞中IL-6、TNF和/或IL-17的蛋白表達(dá)水平(補(bǔ)充 圖11)，證實(shí)Ywhaz在體內(nèi)抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。最后，研究人員觀察了Ywhaz過(guò)度表達(dá)的治療效果。首次免疫CII后第30天和第37天關(guān)節(jié)內(nèi)注射兩次Ad-Ywhaz(圖7A)，與Ad-Con相比(圖8A)，Ad-Ywhaz明顯抑制了CIA的進(jìn)展(圖8A)。在52天的組織學(xué)分析中，研究人員還觀察到使用Ad-Ywhaz后小鼠關(guān)節(jié)的滑膜炎癥和關(guān)節(jié)破壞顯著減少(圖 8B)。此外，Ywhaz過(guò)表達(dá)顯著(P<0.05)抑制關(guān)節(jié)組織中IL-6和TNF以及血清中抗CII抗體的水平(圖8C 、8D)。在相同條件下，經(jīng)LPS或抗CD3+抗CD28抗體刺激的淋巴細(xì)胞和脾細(xì)胞中的IL-6、TNF、IL-17的產(chǎn)生可以因?yàn)锳d-Ywhaz而減輕(圖8E，8F)。因?yàn)閅whaz是一種分泌蛋白，Ad-Ywhaz可能具有潛在作用。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明Ywhaz過(guò)表達(dá)具有局部和潛在的全身效應(yīng)，并可能通過(guò)體內(nèi)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生下調(diào)來(lái)改善CIA。

綜上所述，這些結(jié)果證實(shí)Ywhaz作為中心分子，在消退相關(guān)的分子網(wǎng)絡(luò)中能夠反映慢性炎癥消退的動(dòng)態(tài)變化，表明它具有治療慢性關(guān)節(jié)炎的巨大潛力。

圖7. 向小鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射GFP標(biāo)記的Ad-Ywhaz后Ywhaz、GFP的表達(dá)。（A）建立CIA小鼠模型和用腺病毒載體治療小鼠的示意圖；（B-C）Ywhaz、Il-6和TNF mRNA表達(dá)；(D-E) GFP成像。

圖8. Ad-Ywhaz對(duì)CIA小鼠的抑制作用。（A）CIA小鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射Ad-Ywhaz或Ad-Con關(guān)節(jié)炎評(píng)分；（B）Ad-Ywhaz抑制CIA小鼠足部腫脹和關(guān)節(jié)慢性炎癥；（C）Ad-Ywhaz降低CIA小鼠血清中anti-CII Ab的水平；（D）Ad-Ywhaz或Ad-Con治療52天后CIA小鼠滑膜組織中Ywhaz和促炎細(xì)胞因子(Il-6、TNF)的mRNA表達(dá)；（E-F）Ad-Ywhaz降低促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。

識(shí)別新的抗炎細(xì)胞因子不僅有助于衡量炎性關(guān)節(jié)炎的消退狀態(tài)，而且對(duì)于了解消退過(guò)程的基本分子機(jī)制也是至關(guān)重要的。通過(guò)分析CIA進(jìn)展過(guò)程中滑膜組織的動(dòng)態(tài)基因表達(dá)譜，研究人員確定了與CIA消退密切相關(guān)的3個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子Itgb1、Rps3、Ywhaz?；谝陨蠈?shí)驗(yàn)結(jié)果，證明了Ywhaz在關(guān)節(jié)炎消退過(guò)程中的診斷和治療意義：(a) CIA消退期滑膜組織Ywhaz表達(dá)增加；(b) Ywhaz在T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，特別是Treg細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞中顯著表達(dá);(c)在培養(yǎng)的脾細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和滑膜成纖維細(xì)胞中，Ywhaz過(guò)表達(dá)和敲除分別激活抗炎和促炎反應(yīng)；(d) 3種調(diào)控因子中Ywhaz在CIA消退期的血清中，以及治療反應(yīng)良好的RA患者尿液中表達(dá)升高；關(guān)節(jié)周?chē)⑸銩d-Ywhaz可改善CIA。總的來(lái)說(shuō)，通過(guò)對(duì)滑膜組織進(jìn)行系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組分析，研究人員發(fā)現(xiàn)了之前未確認(rèn)的炎癥性關(guān)節(jié)炎解決的關(guān)鍵調(diào)控因子。

在這項(xiàng)研究中，作為炎癥消退的關(guān)鍵候選樞紐分子，基于描述DEG消退相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)模型在2836個(gè)DEG中確定了85個(gè)樞紐分子（補(bǔ)充 注釋2，圖3A）。這85個(gè)樞紐分子包括在消退期上調(diào)的37個(gè)分子，它們可以像3個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子一樣，作為CIA消退的潛在調(diào)控因子。為了了解37個(gè)樞紐分子的功能特征，研究人員對(duì)這些基因進(jìn)行了GOBP富集分析，發(fā)現(xiàn)它們主要與細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、蛋白酶穩(wěn)定、氧化應(yīng)激和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的應(yīng)答有關(guān)(尤其是對(duì)cAMP和TGF- TGF信號(hào)的反應(yīng))（補(bǔ)充 圖12A）。在此之前，大量的報(bào)告已經(jīng)證實(shí)了這些過(guò)程與炎癥的消退之間相關(guān)。例如，TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、T細(xì)胞增殖、中性粒細(xì)胞凋亡等都與炎癥消退相關(guān)。此外，這3個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子分別參與細(xì)胞黏附和遷移(Itgb1)、翻譯（Rps3）和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Ywhaz)。結(jié)合之前的報(bào)道，本研究的數(shù)據(jù)表明37個(gè)上調(diào)的樞紐分子可作為炎癥消退的潛在調(diào)控因子。

為了發(fā)現(xiàn)可用來(lái)預(yù)測(cè)或誘導(dǎo)RA活動(dòng)消退的關(guān)鍵調(diào)控因子，研究人員通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)3種分泌型調(diào)控因子（Itgb1、Rps3、Ywhaz）的功能進(jìn)行了檢測(cè)。雖然這3種分泌型調(diào)控因子的抗炎作用還沒(méi)有完全被了解，但是之前的一些研究已經(jīng)表明了它們之間的潛在聯(lián)系具有抑制慢性炎癥的作用。例如，表達(dá)在RA患者FLSs細(xì)胞質(zhì)膜上的Itgb1通過(guò)誘導(dǎo)Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡抑制細(xì)胞增生。Rps3被幾種癌細(xì)胞株以同源二聚體的形式分泌，將其轉(zhuǎn)導(dǎo)到皮膚細(xì)胞能夠通過(guò)抑制NF-κB和MAPK活性來(lái)改善小鼠的耳部水腫。Ywhaz也可以由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌，其抑制會(huì)增加鱗狀癌細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子。此外，在腹膜炎、葡萄膜炎和干燥綜合征的動(dòng)物模型中從Ywhaz中提取的分泌肽(PEPITEM)能夠抑制CD3+T細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移。與以前的研究結(jié)果相比，研究人員的結(jié)果通過(guò)證明Itgb1、Rps3、Ywhaz的細(xì)胞來(lái)源和作用靶點(diǎn)，以及Ywhaz的體內(nèi)調(diào)控活性，進(jìn)一步全面地了解了Itgb1、Rps3、Ywhaz的抗炎作用。

RA治療中新出現(xiàn)的問(wèn)題和挑戰(zhàn)之一是在體液中鑒定出用于預(yù)測(cè)疾病狀態(tài)的新的可替代標(biāo)志物。前期是通過(guò)降低包括ESR和CRP在內(nèi)的促炎標(biāo)志物來(lái)表征RA的消退，但有時(shí)它們不能反映RA的變化，尤其是在患者存在抗-IL-6抗體受體時(shí)。此外目前還沒(méi)有臨床實(shí)驗(yàn)表明可溶性或抗炎細(xì)胞因子可以反映RA患者的預(yù)后情況。在這里，本研究驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)顯示在CIA消退期間血清中ywhaz水平升高（圖 6A），與治療前相比，RA治療后反應(yīng)良好患者的尿中Ywhaz水平顯著升高，而在無(wú)反應(yīng)患者組顯著降低(圖6B)，雖然尿液比其他體液更穩(wěn)定，但還不清楚為什么Ywhaz水平的這種變化在尿液中很明顯，而在血清中不明顯。鑒于Ywhaz主要由Tregs和M2巨噬細(xì)胞產(chǎn)生(圖 3、4)，Ywhaz水平的增加可能反映了這種抑制性細(xì)胞類(lèi)型的數(shù)量增加與慢性關(guān)節(jié)炎的改善成比例。研究人員推測(cè)尿液Ywhaz的變化可以作為替代標(biāo)志物，與先前已知的生物標(biāo)志共同為RA消退提供一個(gè)獨(dú)特的預(yù)測(cè)窗口，需要進(jìn)一步的大規(guī)模研究明確這一問(wèn)題。

TNF或IL-6的阻斷已被有效地應(yīng)用于RA的治療。然而，這些藥物會(huì)增加感染傳染病的風(fēng)險(xiǎn)，并且在治療結(jié)束后不太可能恢復(fù)免疫耐受。此外，IL-4、IL-10和IL-1等抗炎細(xì)胞因子已被認(rèn)為是潛在的候選標(biāo)志物，但在臨床研究中它們未能治療RA。因此，除了目前臨床使用的抑制促炎反應(yīng)的藥物，如何鑒定出能夠增強(qiáng)抗炎和抑炎作用的新的候選藥物的需求尚未得到滿足。本研究發(fā)現(xiàn)為Itgb1、Rps3、Ywhaz通過(guò)阻斷促炎細(xì)胞因子和趨化因子(包括IL-6、TNF和IL-8)的產(chǎn)生而抑制巨噬細(xì)胞和滑膜成纖維細(xì)胞的效應(yīng)功能提供了證據(jù)。Ywhaz對(duì)促炎細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)似乎不依賴(lài)于PEPITEM肽序列，因?yàn)镻EPITEM與整個(gè)Ywhaz蛋白不同，未能抑制脾細(xì)胞和FLSs中IL-6的產(chǎn)生(補(bǔ)充 圖13)。此外，關(guān)節(jié)內(nèi)Ywhaz基因的過(guò)度表達(dá)大大減少了CIA的發(fā)生，而無(wú)論是腹腔注射還是關(guān)節(jié)內(nèi)注射PEPITEM 100μg，每周2次，共3周，均無(wú)療效(數(shù)據(jù)未示出)。Tak-en的研究結(jié)果表明，這3種調(diào)控因子(尤其是Ywhaz)可單獨(dú)或與抗炎藥聯(lián)合應(yīng)用于RA的治療，以期在促進(jìn)抗炎的同時(shí)誘導(dǎo)體內(nèi)平衡修復(fù)。綜上所述，本研究數(shù)據(jù)表明，這3種關(guān)鍵調(diào)控因子(特別是Ywhaz)可以單獨(dú)或與抗炎藥聯(lián)合使用，以期在促進(jìn)抗炎的同時(shí)，誘導(dǎo)修復(fù)體內(nèi)平衡。

具有抑炎作用的脂質(zhì)介質(zhì)，包括脂氧素、溶血素和保護(hù)素，已被證明可以抑制促炎細(xì)胞的功能。它們由M2巨噬細(xì)胞合成和釋放，在多種細(xì)胞表達(dá)，同時(shí)中能夠從多方面發(fā)揮抑炎作用。這些抑炎脂質(zhì)介質(zhì)也促進(jìn)抑制性免疫細(xì)胞的功能，增加treg的生成和/或使巨噬細(xì)胞向抑炎巨噬細(xì)胞極化。與抑炎脂質(zhì)介質(zhì)類(lèi)似，Itgb1、Rps3、Ywhaz在Tregs和M2巨噬細(xì)胞中高表達(dá)，并被證明直接作用于RA的多種效應(yīng)細(xì)胞，如脾細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和滑膜成纖維細(xì)胞(圖 5)，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)和/或促進(jìn)抗炎反應(yīng)。這些數(shù)據(jù)表明，Itgb1、Rps3、Ywhaz可能與促炎脂質(zhì)介質(zhì)結(jié)合，可作為類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎消退的治療或診斷的分子標(biāo)志物(補(bǔ)充 圖12B)。需要進(jìn)一步大規(guī)模臨床研究來(lái)澄清這個(gè)問(wèn)題。

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