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編譯：小友，編輯：Emma、江舜堯。

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1. Cav1重新分配到晚期LE/MVB，以在外泌體中進(jìn)行分類

Cav1的內(nèi)在化受到了嚴(yán)格的調(diào)控。盡管通常認(rèn)為內(nèi)吞的Cav1會(huì)降解，但不能排除其他情況，我們分析了原釩酸鈉處理后內(nèi)源性Cav1的運(yùn)輸動(dòng)力學(xué)，原釩酸鈉通過(guò)保護(hù)酪氨酸14磷酸化誘導(dǎo)Cav1內(nèi)在化。原釩酸鹽的暴露會(huì)增加Cav1的磷酸化和與LE和MVB的共定位（分別為抗溶血雙磷脂酸[LBPA]和抗CD63免疫染色；圖1A和圖S1 A），同樣，當(dāng)細(xì)胞暴露于EDTA時(shí)，很大一部分Cav1會(huì)重新定位于LE/MVB區(qū)域，從而通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞脫離而誘導(dǎo)Cav1內(nèi)吞。RNAi介導(dǎo)的聚合酶I和轉(zhuǎn)錄釋放因子(PTRF/Cavin-1)的缺失是維持小窩穩(wěn)定所必需的一種重要的Cav1外殼成分，也影響了Cav1的部分定位(盡管低于顯著閾值)，并增加了Cav1的磷酸化（圖S1 C），高分辨率顯微鏡檢查證實(shí)了在MVB腔內(nèi)存在Cav1，與外泌體標(biāo)記CD63共定位（圖1 B）。通過(guò)人為地?cái)U(kuò)大內(nèi)體，可以清楚地觀察到位于MVB內(nèi)腔內(nèi)囊泡（ILVs）的Cav1的離散斑塊（圖1C和圖S1D），這些觀察結(jié)果表明，MVB是內(nèi)吞Cav1的去向之一。

磷酸化經(jīng)常觸發(fā)相鄰受體殘基的后續(xù)泛素化。我們分析了Cav1突變體的亞細(xì)胞分布，其中泛素受體賴氨酸殘基被精氨酸取代（圖1 D，上圖），Cav1 N端賴氨酸的突變會(huì)破壞Cav1泛素化，其構(gòu)建體很好地修飾了外部擴(kuò)大的Rab5內(nèi)體膜/MVB；然而，N端賴氨酸簇(K5-57R和K5-176R突變體)的突變破壞了Cav1進(jìn)入ILVs的過(guò)程(圖1 D)，這與這些突變體與CD63的總體共定位程度較低有關(guān)（圖S1E），相比之下，C末端賴氨酸殘基（K65-176R）的突變不會(huì)影響Cav1在MVB中的定位能力（圖1 D）。磷酸化在Cav1突變體中沒(méi)有顯著改變（圖1 E），這增強(qiáng)了將Cav1分選為MVB的兩步機(jī)制的概念：磷酸化首先引起Cav1向內(nèi)MVB膜的內(nèi)在化，泛素化作用作為Cav1進(jìn)入ILV的檢查點(diǎn)。

為了評(píng)估定位于ILV的Cav1庫(kù)的外泌體分類，我們分析了來(lái)自不同細(xì)胞系密度梯度純化的外泌體。內(nèi)源性Cav1主要與Tsg101隔開(kāi)，證實(shí)外泌體可以攜帶Cav1（圖1 F），在PTRF耗盡的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEFs）中，Cav1對(duì)外泌體的分選得到了增強(qiáng)，相反，N末端泛素化突變體表現(xiàn)出外泌體分類受損（圖1 G）。這些數(shù)據(jù)表明，很大一部分內(nèi)化的Cav1以泛素依賴性方式分選到MVB內(nèi)腔，有利于其摻入外泌體，這一過(guò)程在所有被測(cè)表達(dá)Cav1的細(xì)胞系中都是基本的。

圖1 內(nèi)部化的Cav1被分類為外泌體

（A）用原釩酸鈉（NaV; 2 h）處理后的WT MEF中的Cav1（紅色）和LBPA（綠色）的共聚焦圖像。白色箭頭：質(zhì)膜定位的Cav1。灰色箭頭：Cav1重新定位到核周區(qū)域（比例尺，25 μm）。圖表顯示了Cav1-LBPA共定位的Pearson相關(guān)系數(shù)。誤差線：平均值±SD；n = 80個(gè)單元格。蛋白印跡：原釩酸鈉處理過(guò)的細(xì)胞中的磷酸Cav1（pCav1）和總Cav1。（B）Cav1-CD63共定位。右面板顯示了MVB隔室的高分辨率圖像（比例尺，1 μm）。（C）Cav1在表達(dá)Rab5（Q79L）的COS7細(xì)胞中的分布（比例尺，10 μm）。右：內(nèi)體的縮放視圖（比例尺，2.5 μm）。（D）上圖：被分析的Cav1構(gòu)建體的示意圖。標(biāo)出了泛素化目標(biāo)賴氨酸殘基（Ub）和突變?yōu)榫彼岬臍埢╔）。下圖：用Rab5（Q79L）轉(zhuǎn)染的COS7細(xì)胞的共聚焦分析（綠色），并顯示了Cav1構(gòu)建體（比例尺，10 μm）。圖表：Cav1變體的內(nèi)體腔定位（內(nèi)部，INT；白色）相對(duì)于內(nèi)體膜（外圍，MEMB；灰色），以總內(nèi)體定位的百分比表示。誤差棒是平均值±SD；n> 20個(gè)內(nèi)體。（E）在WTCav1（pCav1），泛素化靶賴氨酸突變體和不可磷酸化的Y14FCav1中原釩酸鈉誘導(dǎo)的磷酸化的蛋白印跡分析。（F）Cav1包含在成纖維細(xì)胞（MEF）衍生的外泌體中。外泌體蛋白的代表性蛋白印跡浮在連續(xù)的蔗糖梯度（0.25–2 M）上。收集各個(gè)1 ml餾分，蛋白沉淀后將其上樣到電泳凝膠上，并分析Cav1和外泌體標(biāo)記Tsg101。紅色矩形突出顯示了帶有可檢測(cè)量的外泌體標(biāo)記物Tsg101（3-7）的級(jí)分。（G）表達(dá)HA標(biāo)記的Cav1泛素化突變體的COS7細(xì)胞的細(xì)胞裂解物和外泌體的蛋白印跡分析。CNTRL，對(duì)照；不適用。對(duì)于所有圖形，*，P <0.05；**，P<0.01；***，P ＜0.001。

2. Cav1通過(guò)調(diào)節(jié)MVB膽固醇含量調(diào)節(jié)外泌體生物發(fā)生

調(diào)控MVB膜的構(gòu)造和組織能夠產(chǎn)生不同的ILV和外泌體種群。我們研究了Cav1是否在外泌體生物發(fā)生中發(fā)揮積極作用，蛋白印跡檢測(cè)了相同細(xì)胞數(shù)純化的總外泌體，蔗糖密度梯度沉降（圖2A和2B，下半部分；圖3D），結(jié)果表明，Cav1KO成纖維細(xì)胞的外泌體生成未受到損害，并顯示出更高的外泌體分泌率（圖2A和2B，A的上部）以及物理特性（Nanosight技術(shù)，透射EM [TEM]；圖2C和2D）。我們?cè)赪T成纖維細(xì)胞中鑒定了兩個(gè)大小不同的外泌體亞群，而Cav1KO成纖維細(xì)胞產(chǎn)生了均勻的小外泌體群體（圖2C和2D）。

Cav1結(jié)合膽固醇并組織專門(mén)的膜組織結(jié)構(gòu)域。我們研究了Cav1是否通過(guò)調(diào)節(jié)MVB上的膽固醇水平來(lái)促進(jìn)外泌體異質(zhì)性，盡管WT和Cav1KO成纖維細(xì)胞之間的LBPA陽(yáng)性結(jié)構(gòu)數(shù)目沒(méi)有差異，但Cav1KO細(xì)胞中的MVB面積和filipin強(qiáng)度（代表平均膽固醇含量）明顯更高（圖2 E）。在WT細(xì)胞中，siRNA缺失的Cav1重現(xiàn)了這種表型（圖S2 A），用U18666A處理可促進(jìn)膽固醇在LE/MVB隔室中的積累，也增加了外泌體分泌，同時(shí)減少了WT細(xì)胞中的外泌體異質(zhì)性（圖2 F）。

ILV中包含大部分MVB膽固醇。我們通過(guò)過(guò)表達(dá)組成型活性Rab5（Q79L）證實(shí)了膽固醇在內(nèi)體中蓄積（圖S2 B），為了確認(rèn)Cav1KO MVB中膽固醇含量的變化是否引起外泌體膜重組，我們從WT細(xì)胞（對(duì)照或經(jīng)U18666A處理）或Cav1KO細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體中分離了耐冷脂筏（外泌體DRM）。Flotillin-1是外泌體和液序（液體有序）域的標(biāo)記，在Cav1KO細(xì)胞（餾分1-8）或經(jīng)U18666A處理的WT細(xì)胞（餾分1-6）中顯示出更廣泛的分布，相比之下，未處理的WT細(xì)胞外泌體中的flotillin積累僅限于餾分1至3（圖2 G），反映出Cav1KO來(lái)源的外泌體中高度有序的膜含量增加。對(duì)外泌體制劑的脂質(zhì)組學(xué)分析證實(shí)，PS中，特別是PS（18：0/18：1）物種中有大量富集，與先前的數(shù)據(jù)一致，值得注意的是，來(lái)自WT細(xì)胞的外泌體始終表現(xiàn)出較高相對(duì)數(shù)量的磷脂酸、磷脂酰肌醇和LBPA(已知在ILV的生物發(fā)生和動(dòng)力學(xué)中發(fā)揮相關(guān)作用)，與Cav1KO外泌體相比，外泌體則相反地顯示出膽固醇含量的增加，這與在Cav1KO細(xì)胞LE/ MVB室中觀察到的膽固醇積累相一致。（圖S2 C）。這些結(jié)果表明，Cav1通過(guò)充當(dāng)LE/MVB處的“膽固醇變阻劑”來(lái)調(diào)節(jié)外泌體的生物發(fā)生，賦予該區(qū)域可塑性，并使不同的外泌體群體分離。

圖2 Cav1通過(guò)調(diào)節(jié)MVB膽固醇含量來(lái)調(diào)節(jié)外泌體的生物發(fā)生

（A-G）外泌體是從Cav1WT和Cav1KO成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液中分離出來(lái)的。（A）上圖：來(lái)自相等細(xì)胞數(shù)的外泌體中指定蛋白的蛋白印跡。下圖：Western印跡顯示Cav1和Tsg101在連續(xù)蔗糖梯度上漂浮的外泌體中的分布。（B）相對(duì)于細(xì)胞數(shù)量的外泌體顆粒的定量。誤差是平均值±SD；n =10。（C）左：WT和Cav1KO成纖維細(xì)胞外泌體制劑的Nanosight分布圖，顯示出WT衍生外泌體的形態(tài)和大小異質(zhì)性更高。右：在WT和Cav1KO成纖維細(xì)胞中鑒定的兩個(gè)外泌體群體的定量。誤差棒是平均值±SEM；n =10。（D）WT和Cav1KO外泌體的代表性TEM（比例尺，200 nm）。從WT和Cav1KO成纖維細(xì)胞來(lái)源的外泌體的TEM測(cè)量分布分布。（E）WT，Cav1KO和U18666A處理過(guò)的Cav1WT成纖維細(xì)胞（比例尺，20 μm）的菲林染色（灰色）和LBPA（綠色）。下半部分顯示縮放視圖（比例尺，6 μm）。右圖顯示了MVB（上部）和總MVB面積（下部）中filipin平均熒光強(qiáng)度的定量分析。誤差棒是平均值±SD；n =3。（F）每個(gè)細(xì)胞的外泌體產(chǎn)量。誤差棒是平均值±SD；n = 4（左）和未經(jīng)處理（對(duì)照）且經(jīng)U18666A處理的野生型成纖維細(xì)胞外泌體制劑的Nanosight分布圖（右）。（G）在TritonX-100存在的外泌體中蔗糖密度梯度級(jí)分的蛋白印跡，所述外泌體由未經(jīng)處理的WT和Cav1KO成纖維細(xì)胞以及經(jīng)U18666A處理的WT成纖維細(xì)胞產(chǎn)生。圖表顯示了抗洗滌劑和非抗洗滌劑膜（DRM）中的弗洛替林（Flot1）的比例。誤差棒是平均值±SD；n =3。對(duì)于所有圖形，*，P<0.05；**，P <0.01；***，P ＜0.001。

3. Cav1促進(jìn)將特定ECM貨物分類為外泌體

我們定量了WT和Cav1KO成纖維細(xì)胞的蛋白組及其相應(yīng)的外泌體制劑，該分析確定了一個(gè)亞蛋白組，該亞蛋白組在WT和Cav1KO全細(xì)胞裂解液中同樣豐富，但其成分根據(jù)Cav1基因型的不同而不同地分類為外泌體（圖3A，左），在閾值| Zq | > 1.5的Cav1KO外泌體中，有152種蛋白比WT外泌體中的蛋白豐富，而163種缺乏。相互作用網(wǎng)絡(luò)和功能注釋富集分析表明，WT來(lái)源的外泌體顯著富集了ECM組分（包括TnC, fibronectin[FN],nidogen, emilin, EDIL3, 硫酸乙酰肝素蛋白聚糖）和內(nèi)體/內(nèi)膜系統(tǒng)組件（圖3 A，右上圖；圖3B；圖S2 D；和數(shù)據(jù)S1）；相反，在Cav1KO外泌體中觀察到DNA/RNA結(jié)合和伴侶蛋白（例如組蛋白）的顯著富集（圖3A，右下圖；圖3B；圖S2D；和數(shù)據(jù)S1）。與我們支持Cav1KO MVB中膽固醇含量增加的數(shù)據(jù)一致，盡管Cav1KO全細(xì)胞裂解物中這些蛋白的豐度降低，但各種膜聯(lián)蛋白家族成員的Cav1KO外泌體含量大大增加（圖3 C）。膜聯(lián)蛋白是Ca²⁺依賴性蛋白，可以結(jié)合富含膽固醇的膜，提供脂質(zhì)聚類活性，并且可能構(gòu)成一種機(jī)制，以適應(yīng)Cav1KO外泌體中膽固醇過(guò)量的現(xiàn)象。

所選蛋白的差異性外泌體分類通過(guò)外泌體組分（圖S2 G和圖S3 I）和碘克沙醇密度梯度（圖3 D）的蛋白印跡分析得到驗(yàn)證。如圖3D所示，外泌體標(biāo)記物和貨物的分布顯著相關(guān)。TnC（Zq = 3.02）是一種涉及發(fā)育，干細(xì)胞小生境形成和侵襲性腫瘤轉(zhuǎn)移的ECM蛋白，TnC在WT衍生的外泌體中很顯著，但在Cav1KO外泌體中卻不存在（數(shù)據(jù)S1）。TnC在成纖維細(xì)胞和U251細(xì)胞（分泌TnC的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系；圖S2 E）的MVB中與Cav1共定位，跨越不同腫瘤細(xì)胞系（乳腺癌，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和黑色素瘤）的Cav1敲低（KD）顯示了在Cav1KOMEF中觀察到TnC分泌減弱的表型（圖S2，S2H和S2I），這支持Cav1調(diào)節(jié)跨不同細(xì)胞類型的外泌體生物發(fā)生和ECM貨物分選，并且是外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊的重要調(diào)節(jié)劑。

圖3 Cav1將蛋白貨物指定為外泌體

（A）在兩個(gè)親代細(xì)胞群體（細(xì)胞裂解液，黃色陰影）中均表達(dá)且在外泌體中差異表達(dá)的蛋白的層次分析表示。藍(lán)色：WT外泌體中上調(diào)的蛋白；紅色：在Cav1KO外泌體中上調(diào)的蛋白。右側(cè)的圖形顯示了STRING網(wǎng)絡(luò)分析。上圖：在Cav1WT MEF衍生的外泌體中上調(diào)的鑒定蛋白之間的相互作用。突出顯示的組與ECM成分（藍(lán)色）和細(xì)胞外囊泡/外泌體生物發(fā)生以及溶酶體成分（綠色）有關(guān)。下圖：在Cav1KO MEF衍生的外泌體中上調(diào)的鑒定蛋白之間的相互作用。突出顯示的組與組蛋白（紅色）和DNA / RNA結(jié)合（橙色）有關(guān)。（B）WT和Cav1KO成纖維細(xì)胞（上圖）或組蛋白相關(guān)蛋白（下圖）產(chǎn)生的外泌體之間ECM蛋白豐度發(fā)生顯著變化的細(xì)胞外蛋白的聚集熱圖。（C）比較由Cav1KO和WT成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體中annexin亞型富集的熱圖。（D）Western印跡分析顯示Cav1和定量蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定的一些蛋白在WT和Cav1KO衍生的外泌體中漂浮在Optiprep（碘克沙醇）密度梯度上的分布。Tsg101，Alix和flotillin-1用作外泌體標(biāo)記，GM130包括作為陰性對(duì)照。

4. 外泌體的生物發(fā)生/分泌調(diào)節(jié)ECM沉積

我們檢查了外泌體遞送的ECM成分是否可以引發(fā)從頭開(kāi)始的ECM沉積。缺乏Cav1的成纖維細(xì)胞比WT細(xì)胞沉積的TnC纖維基質(zhì)更少（圖4 A），在U18666A處理的細(xì)胞中，TnC纖維的沉積也減少了（圖4B和4C；以及圖S3 B），TnC沉積減少與Cav1缺陷細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)TnC積累有關(guān)；在用U18666A處理的細(xì)胞中這種作用不太明顯，可能反映了較高的TnC降解速率（圖4B）。在源自Cav1KO和Cav1KD MEF或U18666A處理的WT MEF的外泌體中，TnC含量較低（圖4 D和圖S2 F），我們使用兩種不同的外泌體分泌抑制劑來(lái)評(píng)估外泌體對(duì)細(xì)胞外TnC纖維沉積的貢獻(xiàn)：二甲基阿米洛利（dmA；H+/Na+和Na+/ Ca2+通道抑制劑）和GW4869（中性鞘磷脂酶[nSMase]-2抑制劑）。WT成纖維細(xì)胞的凈外泌體釋放在GW4869和dmA的作用下有所降低（圖S3A），這與TnC纖維沉積受損有關(guān)（圖4E），兩種處理均導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)TnC聚集體的積累（圖4 E和圖S3 C）。通過(guò)減少了外來(lái)體分泌抑制劑暴露，也減少了Cav1KO外泌體中代表性不足的另一個(gè)關(guān)鍵ECM成分FN的沉積（圖3 B，圖S3 I和數(shù)據(jù)S1），而GW4869的作用更強(qiáng)（圖4F ），盡管在U18666A處理后未觀察到明顯差異（圖S3 K），在初級(jí)CAF中也證實(shí)了外泌體分泌與ECM沉積的相關(guān)性，其中外泌體的釋放在很大程度上被GW4869抑制，而dmA實(shí)際上沒(méi)有作用（圖S4A）。因此，TnC和纖連蛋白（FN）沉積受到nSMase2阻滯的特別影響，而dmA沒(méi)有影響（圖S4 B和圖4 C），GW4869和dmA均不影響MEF或CAF中的ER-高爾基體穩(wěn)態(tài)（圖S3 D，圖3 E，圖S4 D和圖4E），排除了受損的ER-高爾基體分泌功能是造成缺陷的潛在原因ECM組件的沉積。

ESCRT機(jī)器調(diào)節(jié)的運(yùn)輸和神經(jīng)酰胺生物發(fā)生途徑會(huì)產(chǎn)生帶有不同貨物的外泌體。我們分析了Tsg101（ESCRT依賴性途徑的核心調(diào)節(jié)劑）或nSMase1和2（神經(jīng)酰胺代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑）的瞬時(shí)敲低對(duì)TnC基質(zhì)沉積的影響（圖S3F和S3G）。與小型抑制劑實(shí)驗(yàn)一致（圖4 E），任一途徑的敲低均會(huì)損害TnC沉積，而神經(jīng)酰胺合成破壞會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)的作用（圖4G和圖S3H）。這些處理還減少了FN沉積（圖S3 J）。因此，外泌體是一般的ECM沉積機(jī)制，神經(jīng)酰胺依賴性外泌體生物發(fā)生是該過(guò)程中的主要限制步驟。

圖4 外泌體介導(dǎo)的ECM沉積是Cav1依賴的過(guò)程

（A）共聚焦圖像Z-stack，顯示W(wǎng)T，Cav1KD和Cav1KO MEF沉積的基質(zhì)中的TnC（紅色）。F-肌動(dòng)蛋白顯示為綠色（比例尺，40 μm）。放大視圖顯示，在Cav1KD和Cav1KO MEF（比例尺，10 μm）中不存在TnC基質(zhì)沉積，并相應(yīng)增加了細(xì)胞內(nèi)積累（白色箭頭）。（B）通過(guò)Z-stack共聚焦顯微鏡（比例尺，40 μm）測(cè)定的U18666A處理的WTMEF的TnC沉積。（C）由Cav1WT，Cav1KO和U18666A處理的Cav1WT MEF產(chǎn)生的纖維中的細(xì)胞外TnC沉積（平均值±SD；n = 8）。（D）蛋白印跡法分析指定基因型分泌的外泌體中TnC表達(dá)。定量：平均值±SEM；n=6。（E）5-d暴露于外泌體抑制劑dmA（75 nM）和GW4869（10 μM）對(duì)WT MEFs的TnC基質(zhì)沉積（紅色）的影響（比例尺，20 μm）。右：圖表顯示細(xì)胞外TnC纖維沉積（平均值±SEM；n = 12）。（F）共聚焦圖像Z-stack，顯示5-d暴露于dmA（75 nM）和GW4869（10 μM）對(duì)WT MEF（FN，50 μm）對(duì)FN基質(zhì)沉積（綠色）的影響。底部：圖表顯示細(xì)胞外FN纖維沉積（平均值±SEM；n = 5）。（G）共聚焦圖像的代表性Z-stack，顯示靶向Tsg101和中性nSMase1和2的siRNA對(duì)WT MEF沉積TnC基質(zhì)的影響（紅色；比例尺，20 μm）。右圖顯示了纖維中細(xì)胞外TnC的沉積，以C表示（平均值±SEM；n = 6）。不適用。對(duì)于所有圖形，*，P <0.05；**，P <0.01；***，P ＜0.001。

5. TnC摻入外泌體具有細(xì)胞內(nèi)起源，并取決于膽固醇調(diào)節(jié)

為了排除通過(guò)胞吞運(yùn)輸摻入外泌體的TnC的外部來(lái)源，我們開(kāi)發(fā)了一種基于細(xì)胞衍生基質(zhì)（CDM）的檢測(cè)方法，CDM是通過(guò)WT或TnCKO MEF在體外合成的ECM脫細(xì)胞而產(chǎn)生的，我們證實(shí)TnCKO細(xì)胞被特異地破壞了TnC的沉積，其他組件（例如FN）沒(méi)有表現(xiàn)出如此顯著的依賴性，并且顯示出輕微的上調(diào)，這可能是由于存在替代性補(bǔ)償途徑（圖5A和圖S5A；另請(qǐng)參見(jiàn)圖S3I）。然后將TnCKO或WT細(xì)胞接種在每個(gè)CDM上（圖5 B），并確定TnC內(nèi)在化，在富含TnC的CDM上生長(zhǎng)的TnCKO成纖維細(xì)胞內(nèi)部未檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)TnC，因此排除了胞吞作用是用于TnC庫(kù)進(jìn)行外泌體分揀的情況。

為了排除純化外泌體組分中檢測(cè)到的TnC來(lái)自于細(xì)胞外TnC纖維與外泌體非特異性結(jié)合的可能性，將來(lái)自TnCKO細(xì)胞的純化外泌體與WT細(xì)胞產(chǎn)生的富含TnC的基質(zhì)一起孵育（圖5C和材料以及方法部分），與富含TnC的基質(zhì)孵育后，我們未能在TnCKO外泌體中檢測(cè)到TnC蛋白（圖5 C）。

然后，我們從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）和高爾基體隔室中分離了MVB。在未處理的WT細(xì)胞中，TnC與MVB和ER標(biāo)記均被沉降（圖5 D）；然而，在用GW4869處理后，TnC基本上被排除在MVB組分之外，這種分布轉(zhuǎn)移在Cav1KO細(xì)胞中再次出現(xiàn)（圖5 D），因此，在Cav1KO細(xì)胞或GW4869處理的WT細(xì)胞中，大部分細(xì)胞TnC與ER共定位（圖5E和圖S4F）。補(bǔ)充氯喹后，這種共定位作用得以增強(qiáng)（圖S4 F），表明TnC從ER轉(zhuǎn)移到MVB的缺陷會(huì)導(dǎo)致ER保留TnC，并隨后使溶酶體降解，這支持了溶酶體降解能夠在其外泌體分選失敗時(shí)去除TnC的觀點(diǎn)；降解率的差異可以解釋外泌體抑制劑藥物處理的Cav1KO細(xì)胞和WT細(xì)胞中TnC積累的差異性，以及在外泌體生物發(fā)生和分泌嚴(yán)重中斷時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)缺乏應(yīng)激。因此，TnC在外泌體中的存在反映了TnC在細(xì)胞內(nèi)被真正調(diào)節(jié)成MVBs，可能通過(guò)涉及ER-MVB接觸位點(diǎn)的機(jī)制。

膜接觸部位（MCS）是小的特殊結(jié)構(gòu)域，通過(guò)該結(jié)構(gòu)域，不同的膜隔室進(jìn)行通信，從而允許離子和脂質(zhì)（包括膽固醇）在ER內(nèi)膜MCS的情況下主動(dòng)轉(zhuǎn)移。我們假設(shè)ER-MVB MCS破壞減輕了Cav1KO細(xì)胞中的膽固醇積累，并恢復(fù)了外泌體上ECM蛋白的分類受損，敲低了ORP1L和囊泡相關(guān)蛋白A（VAPA），因?yàn)镋R-內(nèi)體系鏈復(fù)合物VAPA：ORP1L的這些成分是ER向內(nèi)體膽固醇轉(zhuǎn)移的相關(guān)調(diào)節(jié)劑。Cav1KO細(xì)胞中這些接觸位點(diǎn)的破壞顯著降低了LE/MVB大小和磷脂染色強(qiáng)度（圖6A和圖S5D），在這些接觸部位破裂時(shí)膽固醇含量的降低與細(xì)胞外TnC纖維沉積的挽救相關(guān)，其水平與在WT細(xì)胞中觀察到的水平相當(dāng)（圖6C）。

為了進(jìn)一步表現(xiàn)內(nèi)體膽固醇積累在ECM蛋白分類到外泌體上的作用，我們?cè)u(píng)估了用外源低密度脂蛋白（LDL）-膽固醇加入WT細(xì)胞對(duì)TnC轉(zhuǎn)運(yùn)到LE/MVBs中的影響，更重要的是，負(fù)載膽固醇的細(xì)胞在LE/MVBs處的蓄積和TnC的細(xì)胞外沉積均顯著降低（圖S4，G和I）。

因此，內(nèi)體隔室中膽固醇含量的控制是調(diào)節(jié)外泌體生物發(fā)生和外泌體貨物規(guī)格的關(guān)鍵機(jī)制，其中Cav1是一個(gè)重要參與者。

6. 依賴于cav1的外泌體生物發(fā)生直接驅(qū)動(dòng)ECM沉積和腫瘤細(xì)胞侵襲性的增加

我們比較了從WT或Cav1KO MEFs中純化的外泌體在無(wú)侵害的乳腺癌腫瘤細(xì)胞系MDA-MB468 2D培養(yǎng)物上沉積TnC的能力，該細(xì)胞自然表達(dá)的Cav1和TnC的水平可以忽略不計(jì)。24小時(shí)后，腫瘤細(xì)胞以相似的效率內(nèi)化預(yù)標(biāo)記的WT和Cav1KO外泌體，一般膜染料PKH67的積累也類似(圖7 A，綠色)；然而，只有WT外泌體可導(dǎo)致TnC在靠近外周的區(qū)域可檢測(cè)到沉積(圖7 A，紅色)，暴露于Cav1KO外泌體的MDA-MB468的TnC沉積水平與對(duì)照組(暴露于vehicle)相當(dāng)。因此，外泌體具有在體外沉積特異性ECM物質(zhì)的內(nèi)在能力，這需要依賴于cav1的外泌體生物發(fā)生的調(diào)控。

Tav的Cav1依賴性外泌體沉積誘導(dǎo)了MDA-MB468腫瘤細(xì)胞的重要形態(tài)變化，引起細(xì)胞間粘附力的喪失和上皮標(biāo)記E-鈣黏著蛋白的內(nèi)在化，并與絲狀偽足的突出和散發(fā)有關(guān)（圖7 B）。當(dāng)使用由慢病毒shRNA編碼載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的CAF系時(shí)，觀察到相似的表型（圖S5C），因此，MDA-MB468細(xì)胞顯示出增加的遷移，如通過(guò)傷口愈合和transwell遷移測(cè)定所評(píng)估的（圖S5，F(xiàn)和G）。有趣的是，從MDA-MB231腫瘤細(xì)胞中純化的外泌體盡管具有相當(dāng)數(shù)量的Cav1蛋白，但與來(lái)自WT成纖維細(xì)胞的外泌體相比含有較低的TnC，卻無(wú)法上調(diào)MDA-MB468細(xì)胞的突出性和運(yùn)動(dòng)性（圖S5B；圖S2G和2H；以及數(shù)據(jù)S2），因此，來(lái)源于基質(zhì)成纖維細(xì)胞的外泌體TnC/ECM貨物本身不是外泌體Cav1，而是誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞中侵襲性表型的誘導(dǎo)。

我們研究了外泌體將ECM沉積在MDA-MB468球體的能力，在無(wú)支架3D組裝中，細(xì)胞可以自組織ECM并參與細(xì)胞間通訊，并且已被驗(yàn)證為許多應(yīng)用的活體組織的體外實(shí)驗(yàn)替代物。WT衍生的含TnC的外泌體，而不是衍生自Cav1KO或Cav1KD成纖維細(xì)胞的外泌體（即TnC耗盡）有效地將原纖維TnC結(jié)構(gòu)沉積在細(xì)胞球體內(nèi)（圖7C），3D重建表明TnC原纖維優(yōu)先位于組織間隙中（圖S5 E）。

為了表征在這種情況下腫瘤細(xì)胞中Cav1依賴性，外泌體誘導(dǎo)的表型變化，將在外泌體存在下產(chǎn)生的球體鋪平，并使細(xì)胞遷移72小時(shí)，WT外泌體比來(lái)自Cav1KOMEF的外泌體顯著促進(jìn)了更多的遷移（圖7 D）。為了確認(rèn)TnC在此過(guò)程中的作用，我們測(cè)試了源自TnCKO MEF的外泌體的作用（圖7 G和圖S5，H和I），TnCKO外泌體是刺激細(xì)胞遷移的不良刺激物，驗(yàn)證了觀察到的表型影響主要來(lái)自對(duì)外泌體的特定ECM貨物的分類。

接下來(lái)，我們檢查了外泌體是否增加了腫瘤細(xì)胞的侵襲性。Cav1KO外泌體在基質(zhì)膠侵襲試驗(yàn)（圖7 E）或3D膠原基質(zhì)侵襲試驗(yàn)（圖7 F）中始終表現(xiàn)出減弱的誘導(dǎo)侵襲能力，類似于TnCKO細(xì)胞衍生的外泌體促進(jìn)的侵襲減少（圖7 G），這些結(jié)果進(jìn)一步支持了Cav1和TnC依賴性外泌體誘導(dǎo)的ECM沉積和表型改變與腫瘤進(jìn)展的相關(guān)性。

圖5 TnC的外泌體摻入通過(guò)ER-MVB途徑在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生

（A）左：TnCWT和TnCKO成纖維細(xì)胞裂解液中TnC和FN表達(dá)的蛋白印跡分析。右：如材料和方法中所述，從TnCWT和TnCKO細(xì)胞生成CDM，并將TnCWT和TnCKO細(xì)胞鋪在這些CDM上24小時(shí)，如圖所示。CDM用TnC標(biāo)記（紅色），鋪板的細(xì)胞用F-actin染色（灰色；比例尺，50 μm）。（B）總裂解物（CDM +鋪板的細(xì)胞）和鋪在CDM上并通過(guò)胰蛋白酶消化分離的細(xì)胞中TnC和FN的蛋白印跡分析。微管蛋白用作上樣對(duì)照。在分析之前，將細(xì)胞在脫細(xì)胞的CDM上培養(yǎng)24小時(shí)。（C）純化的外泌體與富含TnC或TnCKO CDM的相互作用測(cè)定。該方案顯示了測(cè)定方案。Western印跡顯示TnC和FN與外泌體結(jié)合的分析。（D）使用指示標(biāo)記，對(duì)WT（用媒介物或GW4869處理）和Cav1KO細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)TnC分布的亞細(xì)胞分級(jí)分析。方框區(qū)域表示富含MVB的級(jí)分。圖表顯示了在不同條件下，各餾分中TnC相對(duì)于MVB富集餾分中總TnC（歸一化為1）的相對(duì)量（平均值±SD；n = 3）。（E）在單獨(dú)或與溶酶體抑制劑氯喹組合使用GW4869處理的Cav1WT MEF中分析了TnC（紅色）和鈣網(wǎng)蛋白（綠色）之間的共定位（比例尺，50 μm；縮放比例尺，20 μm）。圖表顯示了皮爾遜共定位TnC和鈣網(wǎng)蛋白的相關(guān)系數(shù)（平均值±SD；n = 3）。CNTRL，控制。*，P <0.05；**，P<0.01；***，P ＜0.001。

圖6 內(nèi)體隔室/ MVB處的膽固醇調(diào)節(jié)控制外泌體介導(dǎo)的TnC沉積

（A）破壞Cav1KO MEF中的VAPA或ORP1L系鏈后，膽固醇從ER向內(nèi)體的轉(zhuǎn)移受到破壞，這通過(guò)膽固醇（灰度）和LBPA（綠色）染色（比例尺，20 μm）評(píng)估了膽固醇的積累。下半部分顯示了所關(guān)注區(qū)域的縮放縮略圖（比例尺，6 μm）。右圖顯示了MVB（上部）和總MVB面積（下部）中filipin血脂平均熒光強(qiáng)度的定量分析。誤差棒是平均值±SD；n =3。（B）用Rab5（Q79L）電穿孔的VAPA耗盡的Cav1KO MEF中，TnC分布（紅色）和LBPA（綠色）的共聚焦分析（灰色；比例尺，10 μm）。最右邊的面板顯示了內(nèi)體/MVB的放大視圖（比例尺，5 μm）。圖表沿指示線顯示了Rab5（Q79L）（灰色）和TnC（紅色）的像素強(qiáng)度。（C）Z-stack共聚焦圖像，顯示RNAi介導(dǎo)的VAPA和ORP1L耗盡對(duì)TnC纖維沉積的影響（紅色）（比例尺，10 μm）。該圖顯示了指定的系鏈耗盡后，WT或Cav1KO MEF沉積的細(xì)胞外TnC纖維（平均值±SEM；n = 3）。不適用。對(duì)于所有圖形，*，P <0.05；**，P <0.01；***，P ＜0.001。

圖7 外泌體介導(dǎo)的TnC沉積促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲

（A-G）將MDA-MB468乳腺腫瘤細(xì)胞與PKH67標(biāo)記的來(lái)自WT或Cav1KO MEF的外泌體或PBS（對(duì)照）一起孵育。（A）MDA-MB468細(xì)胞攝取外泌體（綠色）并在腫瘤細(xì)胞周?chē)鷧^(qū)域沉積外泌體遞送的TnC（紅色）的顯微圖像。比例尺，30 μm。（B）暴露于成纖維細(xì)胞衍生的WT和Cav1KO外泌體后36小時(shí)，MDA-MB468細(xì)胞的表型變化。對(duì)細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)記E-鈣黏著蛋白染色；細(xì)胞核用Hoechst染色 。放大圖像顯示E-鈣粘著蛋白從細(xì)胞與細(xì)胞接觸部位向細(xì)胞內(nèi)隔室的重新分布（比例尺，10 μm）。E-鈣黏著蛋白和其他上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)記通過(guò)蛋白印跡法確定。圖表顯示了用PBS（CNTRL），WT或Cav1KO外泌體處理后E-鈣黏著蛋白的變化（平均值±SD；n = 3）。（C）在WT，Cav1KO或Cav1KD外泌體存在下生成的3D MDA-MB468球體中TnC沉積（紅色）的Z-stack共聚焦圖像。細(xì)胞核用Hoechst（藍(lán)色；比例尺，150 μm）染色。放大的圖像顯示出TnC沉積物的清晰分布（比例尺，50 μm）。白色箭頭：TnC纖維。右：圖表顯示細(xì)胞外TnC纖維沉積（平均值±SEM；n =3）。（D）MDA-MB468球體遷移的相襯圖像（比例尺，175 μm）。在所示外泌體的存在下產(chǎn)生球體，并培養(yǎng)72小時(shí)。該圖顯示了球體遷移的定量分析（平均值±SEM；n = 11）。（E和F）在成纖維細(xì)胞衍生的WT或Cav1KO外泌體存在下產(chǎn)生的MDA-MB468球體的浸潤(rùn)性。在Matrigel中評(píng)估侵襲性（E；相差顯微鏡并定量；平均值±SEM；每種條件下n = 26個(gè)橢球；比例尺，150 μm）或I型膠原蛋白凝膠（F；免疫熒光；箭頭指示細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)域；平均值±SEM；每種條件下，n = 24個(gè)球體；比例尺，100 μm）。（G）在存在成纖維細(xì)胞的TnCWT和TnCKO外泌體的情況下產(chǎn)生的MDA-MB468球體的浸潤(rùn)性。箭頭指示細(xì)胞侵襲的區(qū)域。該圖顯示了MDA-MB468球狀體對(duì)膠原蛋白的侵襲性量化（平均值±SD；n =每個(gè)條件15個(gè)球狀體；比例尺，150 μm）。CNTRL，對(duì)照；不適用。對(duì)于所有圖形，*，P <0.05；**，P <0.01；***，P ＜0.001。

7. Cav1WT MEF衍生的外泌體在體內(nèi)產(chǎn)生富含TnC的生態(tài)位

為了評(píng)估外泌體是否在大的（器官間）距離內(nèi)在體內(nèi)沉積TnC，我們對(duì)從WT或Cav1KO成纖維細(xì)胞純化的外泌體進(jìn)行熒光標(biāo)記，每天注射到TnCKO小鼠的尾靜脈中1周（圖8A）。組織病理學(xué)分析顯示特定的外泌體在肝臟中積累，并在較小程度上在肺中積累（圖8 B和圖S5 J），然而，僅在注射WT外泌體的小鼠的肝臟和肺中始終可檢測(cè)到相關(guān)的TnC沉積，這與注射Cav1KO外泌體或媒介物（PBS）的動(dòng)物器官中殘留的TnC染色相反，盡管Cav1KO外泌體能夠同等效率到達(dá)該器官。因此，Cav1在體內(nèi)依賴外泌體的ECM沉積中起關(guān)鍵作用，由于TnC通過(guò)有利的遠(yuǎn)距離微環(huán)境的聚集是轉(zhuǎn)移的正向調(diào)節(jié)劑，因此Cav1可能通過(guò)依賴于外泌體的基質(zhì)－腫瘤通訊來(lái)特異性地調(diào)節(jié)癌癥的結(jié)果。

圖8 載有Cav1的成纖維細(xì)胞來(lái)源的外泌體以組織特異性方式在體內(nèi)沉積TnC

（A）處理方案。（B）用尾巴靜脈注射Cav1WT或Cav1KO成纖維細(xì)胞來(lái)源的外泌體或PBS注射的小鼠肝臟切片的熒光顯微鏡檢查（比例尺，60 μm；放大圖，比例尺，30 μm）。外泌體點(diǎn)是綠色的。白色箭頭指示TnC沉積區(qū)域。所有圖像代表來(lái)自兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的九個(gè)隨機(jī)區(qū)域。（C）Cav1在外泌體介導(dǎo)的ECM沉積中的可能作用。（CI）內(nèi)吞的Cav1進(jìn)入MVB隔室，在那里它促進(jìn)外泌體的大小和組成異質(zhì)性，有利于特定ECM成分的進(jìn)入。（CII）Cav1WT成纖維細(xì)胞來(lái)源的外泌體通過(guò)使腫瘤細(xì)胞周?chē)鷧^(qū)域的局部ECM（TnC）沉積成核來(lái)刺激乳腺癌細(xì)胞的突出活性和運(yùn)動(dòng)性。（CIII）Cav1WT成纖維細(xì)胞來(lái)源的外泌體還可以在距體內(nèi)來(lái)源很遠(yuǎn)的位置生成富含ECM的沉積物，并可能會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移。

外泌體是一種手段，腫瘤細(xì)胞和相關(guān)基質(zhì)不僅可以局部交流，而且可以影響和轉(zhuǎn)化遠(yuǎn)處或“小生境”，甚至系統(tǒng)地調(diào)節(jié)機(jī)體反應(yīng)。盡管它們無(wú)處不在，但外泌體生物發(fā)生，貨物分選和功能的基本機(jī)制仍然難以捉摸。在這里，我們通過(guò)調(diào)節(jié)MVB中的膽固醇含量來(lái)確定Cav1是外泌體生物發(fā)生的調(diào)節(jié)劑，從而可以產(chǎn)生不同的外泌體亞群和外泌體貨物規(guī)格（主要是特定的ECM蛋白），并具有隨后的功能影響。我們的數(shù)據(jù)表明，Cav1在外泌體中的存在通過(guò)其Tyr14磷酸化的內(nèi)吞作用而受到青睞，這促進(jìn)了Cav1靶向MVB外膜，在該處激活了第二種機(jī)制，該機(jī)制需要靶向泛素化的N末端域賴氨酸殘基的存在。第二種機(jī)制將Cav1分為ILV，以產(chǎn)生外泌體，Cav1將在MVB中充當(dāng)“膽固醇變阻器”，從而增加該隔室的可塑性并實(shí)現(xiàn)不同外泌體群體的隔離，在該隔室中的膽固醇滴定還可以通過(guò)調(diào)節(jié)ER-MVB接觸來(lái)確定外泌貨物規(guī)格。Cav1依賴性外泌體ECM沉積既引起局部ECM沉積，又引起遠(yuǎn)處ECM富集區(qū)域的生成，支持Cav1在基質(zhì)重塑中的新作用，這種外體ECM沉積通過(guò)增加細(xì)胞散射而促進(jìn)了靶向腫瘤細(xì)胞的突出和活躍遷移，表明這些機(jī)制有助于腫瘤細(xì)胞的侵襲并有利于新的ECM基質(zhì)位的成核（圖8 C）

TnC是參與促進(jìn)外泌體依賴性腫瘤侵襲的關(guān)鍵組成部分。表達(dá)Cav1的成纖維細(xì)胞的TnC基質(zhì)沉積嚴(yán)格要求完整的外泌體生物發(fā)生和分泌，我們的數(shù)據(jù)支持一個(gè)模型，其中ER/高爾基體室是TnC向外泌體的主要直接供應(yīng)者，并排除了從頭合成途徑繞過(guò)的整合，例如從細(xì)胞外空間的內(nèi)在化。在乳腺癌細(xì)胞系中進(jìn)行的研究的支持下，我們的結(jié)果表明Cav1調(diào)節(jié)了外泌體貨物規(guī)格的一般機(jī)制，特別是與TnC分選和分泌有關(guān)，此外，依賴Cav1的外泌體TnC分泌對(duì)腫瘤進(jìn)展具有雙重影響（圖7）:(1) 直接添加重組可溶性TnC后觀察到，TnC在腫瘤浸潤(rùn)前部的局部沉積可能會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞從腫瘤塊中遷移出來(lái)（見(jiàn)圖7）；此外，（2）依賴Cav1的外泌體介導(dǎo)的TnC長(zhǎng)距離沉積可能會(huì)促成基質(zhì)小生境在癌細(xì)胞到達(dá)之前“引發(fā)”，從而形成隨后的轉(zhuǎn)移性生長(zhǎng)的“著陸平臺(tái)”。我們發(fā)現(xiàn)，IV注射來(lái)自WT成纖維細(xì)胞而不是來(lái)自Cav1KO細(xì)胞的外泌體可以有效地促進(jìn)遠(yuǎn)處器官中直接TnC-基質(zhì)沉積（圖8），之后還需要進(jìn)一步的研究以確認(rèn)這些ECM基質(zhì)壁是否對(duì)體內(nèi)轉(zhuǎn)移有影響。

已有描述caveolae內(nèi)在化的途徑，其中caveolae被分解，Cav1被內(nèi)在化和泛素化，然后在LEs/MVB的內(nèi)膜積聚。有趣的是，Cav1還通過(guò)溶酶體pH值的變化和膽固醇含量的變化而靶向LE，而Cav1降解率沒(méi)有變化，增加了該Cav1庫(kù)替代命運(yùn)的可能性。我們觀察到的Cav1-MVB共定位的變化（圖1和圖S1）：將大部分內(nèi)部化的Cav1分類為MVB，部分整合到外泌體中，但是，目前我們不能排除其他細(xì)胞內(nèi)隔室（例如ER）也可能是外泌體Cav1的來(lái)源。

Cav1以高親和力結(jié)合膽固醇，其在不同隔室之間移動(dòng)的能力可能有助于調(diào)節(jié)細(xì)胞中的膽固醇通量。我們的數(shù)據(jù)支持Cav1決定LE/MVB膜中的游離膽固醇水平，為生成大小不等的ILV賦予所需的可塑性，并有利于將ECM組分分類至外泌體以供分泌（圖2，圖S2，和圖S3）。此外，通過(guò)在藥理學(xué)上阻止內(nèi)體隔室中的膽固醇運(yùn)輸，通過(guò)破壞ER-內(nèi)體MCS（圖6和圖S5D），對(duì)LE/MVB上的膽固醇水平進(jìn)行人工操作（圖2；圖4B和4C；圖S2 F；圖S4 H），或通過(guò)外源加上LDL-膽固醇（圖S4，G和I），對(duì)ECM外泌貨物的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和外泌體分泌產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。這暗示了一種模型，通過(guò)該模型，內(nèi)體/MVB的膽固醇水平控制是外泌體介導(dǎo)的ECM沉積調(diào)節(jié)的必不可少的部分，如最近在這些細(xì)胞內(nèi)區(qū)隔中的其他信號(hào)傳遞事件和功能所描述的那樣。值得注意的是，ER線粒體MCS的Cav1調(diào)節(jié)了固醇代謝復(fù)合物的募集和膽固醇的積累，之后還需要進(jìn)一步研究以更好地定義膽固醇運(yùn)輸與外泌體生物發(fā)生和下游功能之間相互作用的機(jī)制細(xì)節(jié)，其中Cav1似乎是關(guān)鍵參與者。

有趣的是，在確定的依賴Cav1的外泌體貨物中，膠原蛋白的含量不及其他ECM組分豐富，膠原蛋白分泌需要通過(guò)COPII生物合成/分泌機(jī)制運(yùn)作的特定組裝機(jī)制，因此無(wú)法用于外泌體途徑（圖3，圖4和圖S3）。這些途徑實(shí)際上可能受到Cav1的相反調(diào)控，因?yàn)橐呀?jīng)描述了Cav1表達(dá)與按時(shí)間順序老化的皮膚以及纖維化過(guò)程中膠原沉積之間呈負(fù)相關(guān)。支持我們觀察到外泌體可以充當(dāng)某些ECM蛋白的載體的觀點(diǎn)，最近的一項(xiàng)研究表明FN通過(guò)與整合素α5β1結(jié)合來(lái)分泌FN的外泌體的，然而，這種分類的功能和潛在機(jī)制尚未確定，我們的數(shù)據(jù)表明，TnC通過(guò)從生物合成途徑到MVB室的分類將其摻入到ILV中，不包括通過(guò)內(nèi)化或一旦釋放就直接與外泌體結(jié)合產(chǎn)生細(xì)胞外來(lái)的可能性（圖5）。

先前的研究表明，黑色素瘤患者血漿中表達(dá)Cav1的外泌體水平較高，我們建議表達(dá)Cav1的外泌體的相對(duì)水平可能是轉(zhuǎn)移和腫瘤惡性腫瘤以及其他膽固醇相關(guān)疾病的有價(jià)值的預(yù)后標(biāo)志。我們的研究表明，通過(guò)外體腫瘤與基質(zhì)之間的溝通，可以發(fā)現(xiàn)診斷，預(yù)防和治療干預(yù)的新潛在機(jī)會(huì)。

https://rupress.org/jcb/article/219/11/e202006178/211453/ECM-deposition-is-driven-by-caveolin-1-dependent