原名：Novel fecal biomarkers that precede clinical diagnosis of ulcerative colitis

譯名：潰瘍性結腸炎臨床前診斷新的糞便生物標志物

期刊：Gastroenterology

IF：17.373

1、UC后受試者的微生物群組成不同于HC和UC前

分析了UC前、UC后和匹配的HC受試者糞便樣本中的微生物組成（圖1A）?；?6S rRNA基因測序的微生物β-多樣性顯示UC后分別與HC和前UC樣本聚類（圖1B）。與HC和UC前相比，UC后樣本的α-多樣性降低（圖1C），Adlercreutzia的相對豐度降低（圖1D）。與HC相比，UC后Actinobacillus相對豐度增加（圖1D）和Bilophila相對豐度降低。

為了改進分類群的分類，并評估微生物群的功能基因組潛力，本文對個體子集（每組8名受試者；圖2A）進行了鳥槍宏基因組學研究。除了觀察到UC后雙歧桿菌與HC相比減少（圖2B），還確認了Adlercreutzia equalifaciens的減少，并確定了29個分類群，這些分類群僅在UC前樣本中檢測到，但在HC和UC后樣本中未檢測到。此外，與HC相比，UC前患者中Flavonifractorplautii, Coprococcus catus和 Parabacteroides merdae增多（圖2B）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，雖然UC前與HC相比可以檢測到一些微生物差異，但已確定的疾病是與UC相關的微生物群變化的關鍵驅動力，因為成分變化在UC后最為明顯。

2、UC前微生物群的微生物功能發(fā)生改變

利用鳥槍宏基因組學對糞便樣本進行功能分析，發(fā)現(xiàn)4條途徑在UC前是唯一存在的，但在HC和UC后卻不存在。與HC相比，UC前還具有較高的L-精氨酸生物合成（I，IV）、生物素生物合成II、tRNA和多胺生物合成的豐度?？偟膩碚f，UC前后共有15條途徑，但在HC中未檢測到，包括與氨基酸和蛋白質代謝相關的途徑，如賴氨酸發(fā)酵為醋酸鹽和丁酸鹽、肌酐降解II、酮生成和蛋白質N-糖基化。糞便代謝組學分析還顯示，與HC相比，UC前和UC后轉羥脯氨酸增加的趨勢，以及UC前后甘油和甘油磷脂的顯著降低。

進一步的宏基因組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，超過22000個細菌基因家族在UC前和HC之間以及UC前和UC后之間存在差異。其中，237個獨特的基因家族（有一個或多個貢獻的菌群）與蛋白酶或肽酶相關（圖3）。此外，根據(jù)蛋白酶或肽酶相關基因家族，可將UC前的整體微生物功能與HC區(qū)分開來（圖3）。綜合起來，這些數(shù)據(jù)揭示了臨床UC診斷前與蛋白質和氨基酸代謝相關的微生物組成和功能改變。

圖3 與蛋白酶和肽酶相關的基因家族的熱圖在選定的健康對照組（HC；n=8）和UC前（n=8）樣本之間發(fā)生顯著變化，如鳥槍宏基因組學所分析的。采用Euclidean距離和average linkage clustering聚類法進行層次聚類。

3、潰瘍性結腸炎前期糞便蛋白水解活性增強，并含有細菌成分

在酶水平上，UC前微生物基因組潛力的差異也存在。與HC樣本相比，UC前的蛋白水解酶和胰肽酶活性更高，達到UC后樣本中觀察到的類似水平（圖4A）。在一組活動期UC和CD患者中驗證了我們的研究結果，證實了在糞便排泄量中與對照驗證受試者相比的蛋白水解活性較高。

為了研究微生物對蛋白水解特征的貢獻，本文首先將胰肽酶活性與HC和UC前期受試者的細菌分類群相關聯(lián)。胰肽酶與活性UC中發(fā)現(xiàn)較低的細菌類群（如Adlercreutzia）和其他有益細菌（如Akkermansia）呈負相關（圖4B）。HC和UC前的胰肽酶活性也與Bacteroides vulgatus的相對豐度呈正相關（圖4C），這是一個已知的具有高蛋白水解活性的分類群。此外，本文發(fā)現(xiàn)UC前B. vulgatus的蛋白酶與HC相比有所增加（圖3）。宏基因組學還發(fā)現(xiàn)，在前UC分類群中，蛋白酶基因家族的增加，如P.merdae和C.catus，其在前UC中的豐度高于HC（圖3）。為了進一步支持這一點，本文從患者糞便樣本中分離出蛋白水解細菌。無論診斷或疾病狀態(tài)如何，所有患者都存在具有蛋白水解活性的細菌，但鑒定出的菌株依賴于供體。本文確認了不同的細菌，包括Bacteroides，具有較胰肽酶高活性。事實上，顯示蛋白水解活性的Bacteroides包括與胰肽酶活性相關的Bacteroides vulgatus（圖4C）。

圖4 功能性糞便蛋白水解差異在UC診斷前被檢測到。（A）在UC診斷前（UC前；n =13）和UC診斷后（UC后；n =9）以及匹配的HC（n =48）的糞便樣品中測定總蛋白水解活性和胰肽酶活性。每個匹配的前、后UC樣本用不同的顏色表示。沒有匹配后UC樣本的前UC樣本表示為黑色圓圈。（B，C）用16S rRNA基因譜分析法測定了HC和UC前胰肽酶活性與（B）Adlercreutzia、Akkermansia和（C）Bacteroides vulgatus相對豐度的相關性。每個點代表一個個體參與者的樣本和數(shù)據(jù)，顯示為中間值，四分位間距和胡須從最小值延伸到最大值。

4、UC前蛋白水解表型和炎癥免疫調節(jié)轉移到了gnotobitic小鼠

本文假設UC前腸道微生物蛋白水解活性的變化代表了微生物源性蛋白酶參與炎癥自發(fā)發(fā)病的機制。為了驗證這一點，首先用5名UC患者的糞便樣本（包括前、后樣本）和匹配的HC將成年GF小鼠定植。蛋白水解表型將UC前后的糞便轉移到有UC前和UC后微生物群的GF小鼠中（圖5A和B）。與先前的研究一致，潰瘍性結腸炎后的微生物群導致炎癥性免疫反應，在定植小鼠中結腸PMN細胞增多（圖5C）。最重要的是，UC前菌群在定植小鼠中復制了蛋白水解表型，并導致結腸出現(xiàn)炎癥性免疫反應（圖5C）。

由于成年GF小鼠與出生后定植的小鼠在功能和免疫方面存在差異，本文開發(fā)了一個gnotobiotic定殖模型，即用UC前、后供體的糞便和從先前實驗中選擇的匹配HC進行定植。幼崽從出生時就以這種方式自然定植，并縱向跟蹤12周（圖5D）。糞便功能分析顯示，在8周齡和12周齡時，從接種有UC前后菌群的母鼠出生的小鼠的整體蛋白水解活性高于HC定殖的小鼠（圖5E），這表明UC前供者樣本的蛋白水解表型也可轉移至新生定殖小鼠。盡管沒有動物出現(xiàn)自發(fā)性結腸炎，但與HC定植小鼠相比，UC定植前和UC定植后小鼠結腸粘膜中出生的動物表現(xiàn)出更高的PMN細胞計數(shù)，類似于成年定植小鼠中觀察到的情況（圖5F）。在4周齡和12周齡時，與HC定植小鼠相比，從UC定植前母鼠出生的小鼠的腸道炎癥標志物、糞便脂質鈣蛋白水平也較高，達到與UC定植后小鼠相似的水平。在12周時，通過全結腸組織基因顯示，與HC相比，來自UC前定殖母鼠的40個與先天免疫和凋亡相關的基因存在差異。Il18、Il1、Stat2和Irf1的表達較低，而基因表達與細菌識別和先天性有關，與HC相比，UC前定殖母鼠所生小鼠的免疫功能（如Tlr2、Tlr5、Nod2和Il1b）更高。在UC前定植的母鼠與HC小鼠的結腸組織中，5種生物網(wǎng)絡發(fā)生了改變。排名第一的網(wǎng)絡涉及免疫疾病、抗菌藥物和炎癥反應。在典型途徑中，UC前定植后代的過度表達基因與NFKB信號、細菌和病毒的模式識別受體的作用、p38 MAPK信號和急性期反應信號有關

在4周齡、8周齡和12周齡時，子代的糞便微生物組群與其母親的糞便微生物組相聚集，且UC前、后定植小鼠的α-多樣性均低于HC定殖小鼠（圖6B）。出生于母鼠的小鼠，在UC前和UC后的微生物群中，類桿菌的豐度較高，放線桿菌的豐度較低（圖6C）。在屬水平上，與HC相比，UC前定植的母鼠出生的小鼠中檢測到類桿菌增多，UC前和后定植小鼠中Adlercreutzia和Akkermansia與HC相比減少（圖6C）。與人類隊列中的發(fā)現(xiàn)類似，HC和UC前定殖小鼠的蛋白水解活性與Adlercreutzia和Akkermansia的相對豐度呈負相關（圖6D），與類桿菌直接相關（圖6D）。

利用五種不同的人類供體和兩種不同的定植模型，發(fā)現(xiàn)UC前微生物群增加了糞便蛋白水解活性，這與宿主炎癥反應和低度炎癥相關的網(wǎng)絡和途徑的激活相一致。這一結果支持了這樣一種觀點，即UC前微生物群足以通過其蛋白水解活性在小鼠體內誘導低級別炎癥狀態(tài)。

圖5 UC前期蛋白水解表型和炎性免疫張力轉移到定植小鼠。（A）選擇五位提供完整樣本（UC診斷前后）的UC捐獻者，以及每個UC患者的一個匹配對照。每個糞便樣本經(jīng)口灌胃給n=3-5 8-12周齡無菌（GF）C57BL/6雄性和雌性3周。（B）成年小鼠糞便蛋白水解活性、胰肽酶活性和（C）結腸多形核細胞（PMN）計數(shù)。（D）將妊娠無菌（GF）小鼠與一個選定的UC供體定植，該供體提供UC前后的樣本或匹配的HC。從出生后第1周采集母鼠糞便樣本。每周評估后代的體重變化，每周收集糞便樣本。（E）來自HC、UC前或UC后微生物群的母鼠后代的糞便總蛋白水解活性、胰肽酶活性和（F）結腸PMN細胞計數(shù)。每個點代表一個單獨的鼠標，每個顏色代表不同的匹配的UC前后樣本（填充點）或匹配的HC（開放點）。

圖6 新生定植小鼠的微生物群與定殖dam聚集在一起，并與蛋白水解活性相關。（A）利用加權和未加權的UniFrac和Bray-Curtis不同距離度量，以PCoA為例說明了HC、前UC或后UC微生物群的母鼠糞便微生物群的β-多樣性。（B） 使用香農(nóng)指數(shù)計算的HC、UC前和UC后樣本糞便微生物群落的α-多樣性。（C）擬桿菌、放線桿菌和Adlercreutzia的相對豐度HC在UC前和UC后殖民母鼠的后代中。（D）利用16S rRNA譜分析數(shù)據(jù)，測定了HC和UC前感染母鼠后代胰肽酶活性與Adlercreutzia、Akkermansia和類桿菌相對豐度的相關性。每個點代表一個單獨的鼠標，數(shù)據(jù)顯示為中間值，四分位間距和虛線從最小值擴展到最大值。

本文發(fā)現(xiàn)，在一部分UC患者中，在臨床診斷之前便存在糞便蛋白水解活性增加的現(xiàn)象。與先前的研究一致，在這一前瞻性隊列研究中，發(fā)現(xiàn)活動性UC患者的腸道菌群組成發(fā)生了變化，有益細菌類群（如Adlercreutzia和雙歧桿菌）的多樣性和豐度較低，而病原體（如放線桿菌）豐度較高，這可能是炎癥和損傷的結果?；顒有訧BD的蛋白水解失衡以前已有報道，但在臨床發(fā)病前是否存在這種失衡以及潛在的微生物作用尚不清楚。這里研究的獨特隊列，結合微生物群人源化的gnotobiotic模型，使本文能夠研究UC臨床診斷前存在的微生物源性功能變化，最終可作為早期干預的目標。

研究結果表明，微生物對疾病前的蛋白水解特征有貢獻。腸道細菌產(chǎn)生大量蛋白酶，有可能影響宿主的免疫和功能途徑，導致功能失調時的促炎癥反應。例如，機會性腸道病原體使用蛋白酶作為毒力因子。宏基因組分析表明，在UC的臨床診斷之前，有一個微生物功能譜圖，它具有增強的蛋白質代謝，以及先前與IBD相關的氨基酸代謝。前UC和HC受試者改變了細菌基因家族的表達與蛋白酶有關。此外，基于蛋白酶相關基因家族，前UC微生物功能譜可與HC區(qū)分，進一步支持微生物群對這種蛋白水解特征的貢獻。糞便胰肽酶活性與Bacteroides vulgatus呈正相關，在體外證實了該組細菌分離株具有較高的蛋白水解和胰肽酶活性。在通過鳥槍宏基因組學鑒定的與HC和UC前患者不同的蛋白酶和胰肽酶相關的基因家族中，有幾個與來自B. vulgatus的肽酶相關的基因，包括ATP依賴的Clp蛋白酶蛋白水解亞基和肽酶s24家族蛋白。此外，與HC患者相比，UC前期患者中增加的其他蛋白酶和肽酶基因家族來自于蛋白水解類群，其豐度高于HC患者，如對聚β-內酰胺類。

蛋白水解活性也與Adlercreutzia和Akkermansia的豐度呈負相關，這些類群具有抗菌和抗炎特性，并且在活動性IBD患者中顯示為耗盡。Adlercreutzia是一個代謝異黃酮的屬，異黃酮是一種酚類化合物，以其抗菌和抗炎作用而聞名，其在UC中的減少可能促進炎癥狀態(tài)。蛋白水解活性與已知抗炎特性的細菌在活動性疾病中降低之間的負相關表明糞便蛋白水解活性可作為疾病進展或活化的標志物。

最后，通過成人和新生兒定植模型，使用不同的UC樣本，將糖尿病前期蛋白水解酶表型轉移到小鼠身上。與人類樣本中觀察到的相似，HC和UC前定殖小鼠的蛋白水解活性與類桿菌呈正相關，與Adlercreutzia和Akkermansia呈負相關，進一步支持微生物對提高蛋白水解活性的貢獻。以前在用活躍的IBD微生物群定殖的小鼠模型中已經(jīng)描述過增強免疫張力的誘導。本文證明，被UC前菌群定殖的小鼠在結腸中也會產(chǎn)生炎癥信號，這與定植時的年齡無關。這一特征表明，除了作為早期疾病進展的潛在生物標志物外，在疾病臨床診斷之前觀察到的蛋白水解活性的增加也可能驅動炎癥和疾病進展。

雖然對IBD患者的微生物功能特性進行縱向研究有助于了解疾病隨時間的推移而發(fā)展，疾病前期狀態(tài)，以揭示疾病的發(fā)病機制和病因。另一方面，考慮到UC的自然發(fā)病率，本文的研究受到患者數(shù)量少的限制。未來的研究對于證實這些結果以及研究其在克羅恩病患者中的作用將是重要的。此外，參與者沒有提供幾個UC后樣本，導致配對數(shù)據(jù)分析不可行。增加UC前后配對數(shù)據(jù)的數(shù)量，將有助于更好地分析疾病發(fā)生前后的額外微生物差異。盡管如此，本文證明，在IBD高危人群中，與蛋白水解酶活性相關的微生物功能的差異在臨床相關疾病發(fā)生之前是明顯的，這是發(fā)展UC的進展。所識別的途徑可能導致新的非侵入性生物標記物測試，以監(jiān)測高危人群，以及針對具有高蛋白水解酶活性的患者群體使用特定的人類或細菌抗蛋白酶進行特定治療。