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對非細(xì)菌微生物進(jìn)行了基于宏基因組（MetaPhlAn；真菌和古細(xì)菌）和VirMap（病毒）的研究。結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)古細(xì)菌，只有11種真菌。Candida albicans和C. glabrata是豐度最高且普遍的真菌，分別在26個樣本（14個嬰兒）和15個樣本（9個嬰兒）中檢測到。該方法可以檢測DNA病毒，但只檢測到兩種：在7個嬰兒的8個樣本中發(fā)現(xiàn)cytomegalovirus，而在同一嬰兒的兩個樣本中檢測到betapolyomavirus[Jz1] 。另外，總共檢測到394個細(xì)菌，因此隨后的分析主要集中在細(xì)菌方面。

物種豐富度在嬰兒出生后的前10天略有下降，好氧菌的相對豐度降低（圖1b）。從第10天開始直到離開NICU，物種豐富度持續(xù)增加，Shannon多樣性從出生到第45天呈指數(shù)增長，從第45天開始適度增加（圖1b）。從出生到第80天，專性厭氧菌的相對豐度普遍增加，之后腸道微生物組由大約1:1的兼性厭氧菌和專性厭氧菌組成（圖1c）。出生后的第一個月內(nèi)，大部分革蘭氏陽性細(xì)菌是葡萄球菌，其相對豐度較高。雙歧桿菌（放線菌門）的相對豐度從出生到出院都在增加，從第30天開始是豐度最高的菌屬。來自變形菌門的革蘭氏陰性菌埃希氏菌和克雷伯氏菌在出生后的第一個月相對豐度增加，然后逐漸下降（圖1d、e、f）。

通過細(xì)菌的Dirichlet’s multinomial mixture (DMM)模型確定了五個最佳的菌群，這里稱為PGCTs。PGCT-1主要是腸球菌（Enterococcus faecalis和E. faecium）和葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis和S. haemolyticus）組成；PGCT-2主要是是大腸桿菌屬（E. coli和一個未分類的物種）；PGCT-3是克雷伯氏菌(K. oxytoca和一個未分類的物種）；PGCT-4是一些雙歧桿菌（B. longum、B. bifidum和B. animalis）和乳酸菌（L. acidophilus和L. rhamnosus）；PGCT-5主要是B. breve（附件圖2）。

圖1：出生后120天內(nèi)早產(chǎn)兒飲食和腸道微生物組的概述（n = 1,431）

a，嬰兒接受母乳、配方奶或 二者混合的樣本比例。b-f，不同時間的豐富度和香農(nóng)多樣性 (b)、需氧菌、兼性厭氧菌和專性厭氧菌的相對豐度 (c)、革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的相對豐度 (d) ，前四個門的相對豐度（e）和前五個屬的相對豐度（f）。

Shannon多樣性與出生后天數(shù)、益生菌（無益生菌/Infloran/Labinic）、接受母乳（從未/期間/之后）、母乳強(qiáng)化劑（從未/之前/期間/之后）和抗生素（過去7天內(nèi)使用抗生素，無/有）顯著相關(guān)（附件圖2）。為了確定與整體菌群明顯相關(guān)的共變因素，使用'adonis'進(jìn)行PERMANOVA分析。出生后時間解釋總變異的4%（P<0.001），母親年齡解釋了3.5%（P<0.001），而不同的患者解釋了1.8%的變異（P = 0.016）。

在一個或多個時間點上，抗生素、母乳、母乳強(qiáng)化劑和益生菌與細(xì)菌分類學(xué)顯著相關(guān)（圖2a）。益生菌在統(tǒng)計學(xué)上是最顯著的（P<0.05），除了第0-9天，在其他時間點都與細(xì)菌群落相關(guān)。微生物組的功能代謝的補(bǔ)充分析顯示，只有益生菌在第10-14天、25-29天、30-34天、35-39天和50-69天有明顯的關(guān)聯(lián)（圖2b）。值得注意的是，胎齡、出生體重、出生方式、配方奶和性別與分類學(xué)或功能層面上的整體菌群組成沒有關(guān)系。該研究進(jìn)一步試圖用Olm等人以前發(fā)表的宏基因組研究來驗證這些結(jié)果，該研究包含86個沒有接受益生菌的對照早產(chǎn)兒（n = 513個糞便樣本）。雖然喂養(yǎng)信息沒有本研究那么細(xì)化，但各組之間的結(jié)果基本一致。

二項式混合效應(yīng)模型顯示，未接受益生菌的嬰兒明顯更有可能轉(zhuǎn)變?yōu)楦缓死撞暇?PGCT-3（P?=?0.021），這也與出生時的較低胎齡有關(guān)（P?=?0.043） ; 圖 3a 和補(bǔ)充表 1）。接受 Infloran 的嬰兒更可能轉(zhuǎn)變?yōu)?PGCT-5，而接受 Labinic 的嬰兒更可能轉(zhuǎn)變?yōu)?PGCT-4（均 P?<?0.001；圖 3a 和補(bǔ)充表 1）。PGCT-4 和 PGCT-5 主要來自有較高的出生天數(shù)的樣本（ P?<?0.001；補(bǔ)充表 1）。PGCT-5 以 B. breve 為主，并與較高的胎齡相關(guān)（P?=?0.008；補(bǔ)充表 1）。PGCT-4 通常以 Labinic 中存在的物種為主，包括B. longum，B. bifidum， L. acidophilus和B. animalis（附圖 2c）。

與線性模型 2 (MaAsLin2) 的多變量關(guān)聯(lián)分析證實，在接受益生菌的嬰兒中，該益生菌中的屬（附表 2）和物種（附表 3）有顯著性更高的相對豐度。值得注意的是，B. breve 與 Infloran 顯著相關(guān)（P?<?0.001，q?=?0.007），而 B. animalis 是與 Labinic 相關(guān)的最重要的分類群（P?<?0.001，q?<?0.001）（補(bǔ)充表 3）。使用基于培養(yǎng)的方法，本研究無法從 Infloran 組培養(yǎng) B. breve，但始終能夠從 Labinic 組培養(yǎng) B. animalis。

益生菌對其它菌群的影響表明，在補(bǔ)充 Infloran 的嬰兒中，E. faecium的相對豐度顯著增加（P?<?0.001，q?=?0.004），而Veillonella parvula（P?=?0.001，q?=?0.030）和Propionibacterium acnes（P?< 0.001，q?=?0.022）顯著降低（附表 3）。在補(bǔ)充 Labinic 的嬰兒中，非益生菌種類沒有顯著增加或減少（q?>?0.05；附表 3）。

使用 B. infantis 人乳低聚糖 (HMO) 基因簇（H1、H2、H3、H4、H5 和尿素酶）進(jìn)行菌株水平分析以檢測B. infantis亞種的存在，其中在這些簇中存在>90% 的基因的樣本被歸類為含有B. infantis。在 672 個樣本中檢測到 B. infantis，其中 666 個 (>99%) 來自接受 Labinic 的嬰兒。對嬰兒腸道菌HMO基因簇的額外分析確定了存在B. breve、B. bifidum和B. pseudocatenulatum中的同源物（圖 3b 和附圖 4a）。在從未接受過益生菌的嬰兒中發(fā)現(xiàn)B. breve, B. dentium和B. longum（附圖4b）。

與未接受益生菌的嬰兒相比（P?=?0.035），接受 Labinic 的嬰兒的香農(nóng)多樣性顯著更高，進(jìn)一步證明了不同益生菌的影響（圖 3c，d）。接下來試圖確定每個益生菌中所含物種的流行率和持久性。與從未接受益生菌的嬰兒相比，在服用相應(yīng)益生菌之前、期間和之后，益生菌的流行率都顯著提高（圖 3e）。在益生菌組間進(jìn)行比較，接受 Infloran組中雙歧桿菌的流行率顯著高于Labinic。與未接受益生菌的嬰兒相比，接受Infloran組中的B. longum流行率明顯更高（P?<?0.001），并且B. animalis的流行率對 Labinic 益生菌具有高度特異性（圖 3e）。在接受 Infloran 的嬰兒中L. acidophilus沒有持續(xù)存在，并且僅在少數(shù)接受 Labinic 的嬰兒中持續(xù)存在，而 B. bifidum 在所有接受 Infloran 的嬰兒中持續(xù)存在，只有接受 Labinic 的嬰兒中沒有持久存在（附圖 4d，e）。

基于注釋結(jié)果，發(fā)現(xiàn)益生菌是在任何時間點與整體酶功能（EC）顯著相關(guān)的唯一協(xié)變量（圖2b）。然而，與益生菌組相比，無益生菌組彼此之間的差異更大（圖 3d），而服用任意一種益生菌的嬰兒的功能譜比從未服用益生菌的嬰兒更相似（圖 3f）。MaAslin2 分析證實了這些結(jié)果，發(fā)現(xiàn) 346/754 (46%) 的EC 數(shù)通常與兩種益生菌相關(guān)（附表 4）。在顯著正相關(guān)的EC中，鑒定出大量參與形成碳-氧鍵和碳-氮鍵的糖基化酶和連接酶。相比之下，許多以硫基和其他含氮化合物為供體的氧化還原酶的相對豐度與益生菌呈負(fù)相關(guān)

接下來，研究試圖了解基于微生物分類學(xué)定義的 PGCT 是否與腸道微生物組的功能相關(guān)。分析表明，PGCT 在其整體組成上存在顯著差異（P?=?0.001；圖 4a）；然而，沒有發(fā)現(xiàn)單一的酶或途徑可以區(qū)分 PGCT。為了進(jìn)一步探索 PGCT 的功能影響，本研究選擇了代表每個 PGCT 的 10 個糞便樣本的子集（n?=?49）和匹配的血清樣本（n?=?50）用于非靶向代謝組學(xué)研究。總體而言，發(fā)現(xiàn)基于 PGCT 的樣本之間的糞便代謝物譜存在顯著差異（P?=?0.043；圖 4b），而匹配的血清代謝物譜則沒有明顯差異（P?=?0.151；圖 4c）。

與 PGCT-4/-5（與益生菌組嬰兒相關(guān)）相比，PGCT-3（與無添加益生菌嬰兒相關(guān)）中特定代謝物顯著富集，反之亦然（附表 5）。在糞便中，與 PGCT-4/-5 相比，發(fā)現(xiàn)單一未知代謝物在 PGCT-3 中顯著富集（P?<?0.001，q?=?0.0493；附表 5）。在血清中，與 PGCT-3 相比，發(fā)現(xiàn)單一代謝物lysophosphatidylcholine 20:3在 PGCT-4/-5 中顯著富集（P?<?0.001，q?=?0.01；附表 6），沒有代謝物在糞便和血清中都顯著富集。

最后，為了探索每個 PGCT 的小分子對早產(chǎn)兒上皮屏障功能的影響，該研究使用了生理氧氣條件下來自 25 周妊娠的早產(chǎn)兒腸源性類器官模型。代謝組學(xué)的每個 PGCT 的相同 10 個糞便樣本被用于制造無菌糞便上清液，然后添加到分化的腸道類器官單層中 24 小時。根據(jù)共培養(yǎng)后的跨上皮電阻 (TER)（中位數(shù) 3,215.5?Ω，IQR 3170.75–3,265.5?Ω）和顯微鏡檢查（附圖 5）后確認(rèn)單層細(xì)胞保持存活。來自類器官的轉(zhuǎn)錄組譜揭示了宿主對每個 PGCT 糞便上清液的特定反應(yīng)，PGCT-4 和 PGCT-5 在 x 軸上的明顯聚集（圖 4d）。與培養(yǎng)基對照相比，暴露于 PGCT-4 和 PGCT-5 的類器官單層顯示出最多的差異表達(dá)基因 (DEG)（圖 4e），進(jìn)一步證實這一點。通過 GO 對 PGCT-4 和 PGCT-5 暴露的單層中上調(diào)的基因進(jìn)行分組，發(fā)現(xiàn)各種生物過程富集，其中有許多細(xì)胞和代謝過程，包括細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝過程（附表 7）。

接受母乳強(qiáng)化劑、 母乳和抗生素與香農(nóng)多樣性和僅出生 1 個月左右時的腸道微生物組譜顯著相關(guān)[Jz1] （圖 2）。與從未接受過母乳喂養(yǎng)相比，接受母乳喂養(yǎng)后香農(nóng)多樣性顯著增高（P?=?0.012；圖 5a），而在前 7?天給予抗生素的樣品中，香農(nóng)多樣性顯著降低（P?<?0.001；圖 5b）。與從未接受過母乳的嬰兒相比，在接受母乳期間（P?=?0.013，q?=?0.154）和之后（P?=?0.006，q?=?0.09）采集的樣本中雙歧桿菌的相對豐度顯著升高，葡萄球菌的相對豐度則在接受母乳期間（P?=?0.013，q?=?0.157）和之后（P?=?0.003，q?=?0.053；圖5c和附表2）顯著降低。物種水平的分析沒有發(fā)現(xiàn)特定的雙歧桿菌屬。另外結(jié)果顯示，前 7 天接受抗生素降低了雙歧桿菌的相對豐度（P?<?0.001，q?<?0.001），但是增加了葡萄球菌的相對豐度（P?<?0.001，q?<?0.001；圖 5d和附表 2）。在種水平上，B. bifidum, B. longum 和 B. breve 顯著降低 (all P?<?0.01, q?<?0.1) ，但是S. haemolyticus, S. warneri和S. lugdunensis 顯著增加 (P?<?0.01, q?<?0.2; 附表3)。

在功能水平上， transaldolase (EC 2.2.1.2)酶是在接受母乳期間和之后最顯著相關(guān)的 （附表 4）。其他轉(zhuǎn)移酶的相對豐度在接受母乳期間和之后也呈正相關(guān)，特別是糖基轉(zhuǎn)移酶和那些參與轉(zhuǎn)移單碳和含磷基團(tuán)的酶。相比之下，大多數(shù) EC 的相對豐度與過去 7 天接受抗生素呈負(fù)相關(guān)，例如參與形成碳-氮鍵和單碳基團(tuán)轉(zhuǎn)移的酶（附表 4）。與抗生素呈正相關(guān)的 EC 主要包括作用于硫基團(tuán)的氧化還原酶和作用于成對供體的氧化還原酶。

該研究對未出現(xiàn)腸道并發(fā)癥或敗血癥的早產(chǎn)兒進(jìn)行了最長的時間尺度的縱向宏基因組分析。結(jié)果表明益生菌是影響早產(chǎn)兒腸道微生物組的主要因素，其次是抗生素、母乳喂養(yǎng)和母乳強(qiáng)化劑。兩種不同的益生菌產(chǎn)品改變了微生物組向不同 PGCTs的轉(zhuǎn)變。PGCTs富含不同的雙歧桿菌屬，它們在功能和與宿主的相互作用中也存在差異。

通過已發(fā)表的文章樣本驗證，結(jié)果顯示了與足月嬰兒相比的重要差異 。研究表明新生兒重癥監(jiān)護(hù)室的護(hù)理方式和環(huán)境影響早產(chǎn)兒微生物組, 這在解釋不同環(huán)境的研究結(jié)果時是很重要的。

在這項為期 10 年的觀察性研究中，分析了兩種不同益生菌產(chǎn)品的影響。結(jié)果顯示一旦使用益生菌，在精準(zhǔn)給藥之前，就能在糞便中檢測到益生菌物種。這種“交叉定殖”在之前的研究中已經(jīng)出現(xiàn) ，并且對益生菌試驗設(shè)計具有重要意義。

先前對早產(chǎn)兒的研究表明，益生菌可以改變腸道微生物組。在本研究中，益生菌產(chǎn)品在分類和功能水平上影響了細(xì)菌群落。結(jié)果表明，補(bǔ)充 Infloran 或 Labinic 與過渡到兩種不同的富含雙歧桿菌的 PGCTs（PGCT-4 和 -5）有關(guān)。先前的研究發(fā)現(xiàn)，富含雙歧桿菌的 PGCTs與健康相關(guān) ，但之前尚未探索過其功能意義。

為了確定 PGCT 與宿主-微生物相互作用的相關(guān)性，對匹配的糞便和血清樣本進(jìn)行了代謝組學(xué)分析，并使用了實驗性早產(chǎn)腸道類器官模型。總體而言，糞便的代謝物譜（而非血清）與 PGCT 相關(guān)。此外，發(fā)現(xiàn)含有代謝物和糞便其他成分的無菌糞便上清液以 PGCT 特異性方式影響早產(chǎn)兒上皮反應(yīng)。患者的腸道區(qū)域（即小腸或大腸）和成熟度也可能影響宿主轉(zhuǎn)錄。盡管需要進(jìn)一步的工作來確定益生菌給藥引起的功能變化的潛在生物學(xué)意義，但這表明，在益生菌使用的驅(qū)動下，過渡到不同的 PGCT 具有相關(guān)的功能意義。

值得注意的是，治療期間收集的糞便中排泄的補(bǔ)充菌株并不一定意味著腸道定殖。因此，本研究包括了對停用益生菌后菌株持久性的評估。已有的研究表明，益生菌和微生物定殖存在個體差異，以及治療后益生菌種類的持久性存在差異，特別是與乳酸桿菌相比，雙歧桿菌菌株的持久性更高，還觀察到益生菌定殖的個體差異。與嗜酸乳桿菌相比，所有雙歧桿菌屬顯示出更高的持久性，并且雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌（即兩種益生菌中都存在的兩種菌株）的持久性取決于所使用的益生菌。嗜酸乳桿菌的較低持久性可能反映早產(chǎn)兒腸道生態(tài)系統(tǒng)對該物種不是最佳的，因為它不是早產(chǎn)兒腸道微生物組中豐度較高或持久的細(xì)菌。這些結(jié)果顯示了益生菌的短期和長期定殖，強(qiáng)調(diào)了了解菌株水平的短期和長期影響的重要性。

盡管益生菌在該人群中提供雙歧桿菌屬的早期來源具有明顯的重要性，但本研究還確定了天然雙歧桿菌定殖菌，即B. breve, B. dentium和B. longum 亞種。已有研究表明母乳通過提供HMO 具有雙歧化作用。先前已顯示利用 HMO 進(jìn)行生長的所有雙歧桿菌屬，在這個早產(chǎn)樣本的菌株水平上有顯著變化。值得注意的是，母乳與雙歧桿菌相對豐度增加和葡萄球菌相對豐度降低有關(guān)，而抗生素與雙歧桿菌相對豐度降低和葡萄球菌相對豐度增加有關(guān)。

總之，本研究通過大量且縱向的早產(chǎn)兒群體中表明，益生菌產(chǎn)品以不同方式影響了腸道微生物群的發(fā)展，加速了向雙歧桿菌屬的轉(zhuǎn)變。年齡最大的樣本的菌群顯示主要是 PGCT-4 或 -5。此外，這些 PGCT 在其功能和與宿主上皮的相互作用方面也表現(xiàn)出差異。這些結(jié)果有助于在設(shè)計針對早產(chǎn)兒腸道微生物組的干預(yù)試驗時提供參考。