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編譯：沐秋，編輯：小菌菌、江舜堯。

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1 試驗(yàn)安排和取樣

1998年在河北省欒城縣欒城農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)試驗(yàn)站（北緯37°53′，東經(jīng)114°41′，海拔50米）開(kāi)展了長(zhǎng)期氮肥田間試驗(yàn)。試驗(yàn)包括四個(gè)施氮水平，分別為每個(gè)小麥生長(zhǎng)期0、100、200和300公斤N/公頃，施于3個(gè)重復(fù)的地塊。土壤為潮土，pH值為7.53-7.95，總碳（TC）為17.03-20.80 g/kg，總氮（TN）為1.13-1.70 g/kg。在2016年11月（Feekes生長(zhǎng)期2-3）、2017年3月（Feekes生長(zhǎng)期6-7）和2017年5月（Feekes生長(zhǎng)期11）分別采集了三次根際和根樣品，本研究稱(chēng)之為分蘗期、拔節(jié)期和成熟期。分別從各生育期不同施氮水平的植物中采集了3個(gè)重復(fù)的根芯樣本，本研究中的根際樣品嚴(yán)格定義為根表2 mm范圍內(nèi)的土壤。在輕輕搖動(dòng)根部以去除松散附著的土壤團(tuán)塊后，通過(guò)清除根部的殘留土壤仔細(xì)收集根際樣品。為了減少對(duì)附著在根部的叢枝菌根真菌和下游DNA提取的影響，用無(wú)菌蒸餾水沖洗根，用于根分泌物和根微生物群落分析。因此，我們將本研究中的“根微生物群落”定義為根內(nèi)和根表面的微生物群落，因?yàn)闃颖静杉椒](méi)有區(qū)分這兩個(gè)部分。

2 SAC、SOC、ROC和有機(jī)酸的測(cè)定

       由于只對(duì)根際和根系樣品進(jìn)行了調(diào)查，本研究中的土壤有機(jī)碳（SOC）和土壤活性碳（SAC）是指根際SOC和SAC。SOC是用傳統(tǒng)的方法定義的，是指土壤中有機(jī)化合物的碳組成。根釋放有機(jī)碳（ROC）在本研究中定義為根分泌物中的總碳。用高錳酸鉀（KMnO₄）氧化C法測(cè)定SAC。用K₂Cr₂O₇—H₂SO₄氧化法測(cè)定SOC。

將0.4g新鮮根與1.5ml無(wú)菌去離子水以1400rpm振蕩30min，提取根分泌物。樣品隨后在13000×g下離心5min，上清液通過(guò)0.22μm過(guò)濾器過(guò)濾。然后，使用總有機(jī)碳分析儀對(duì)0.5 ml上清進(jìn)行ROC測(cè)定。使用配備反相硅膠C18柱（Atlantis T3250×4.6 mm，5μm，Waters）的高效液相色譜儀（Waters e2695，Milford，MA，USA）測(cè)定有機(jī)酸；用20 mm磷酸鈉緩沖液（pH 2.73）以0.5 mL/ min的流速在30°C下洗脫10μl根分泌物樣品。測(cè)定在210 nm處的吸光度，并且用標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3 DNA提取和PCR擴(kuò)增

       總基因組DNA通過(guò)使用E.Z.N.A.?土壤DNA試劑盒(Omega Biotek, Inc., Norcross,GA)按照說(shuō)明書(shū)從0.5 g的根際土壤或用液氮研磨得到的0.4 g的新鮮根粉中提取。分別用341F:785R和FR1:FF390引物對(duì)16S和18S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μl，其包含12.5 μl預(yù)混料(Phanta高保真度DNA聚合酶,Vazyme生物科技有限公司,中國(guó)),1 μl引物(10μM),和 1μl DNA模板(大約20 ng的DNA)。PCR條件為:95℃，3 min;95°C 30 s, 55°C 30 s, 72°C 30 s 25個(gè)循環(huán);最后在72°C下延長(zhǎng)10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后使用AMPure XP beads（Beckman Coulter，Inc.，Brea，CA）按照說(shuō)明書(shū)純化。隨后進(jìn)行8個(gè)循環(huán)的PCR，將雙索引條形碼和Illumina測(cè)序接頭添加到每個(gè)樣本中，然后用AMPure磁珠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。使用Illumina MiSeq PE300平臺(tái)（中國(guó)蘇州GENEWIZ）對(duì)每個(gè)樣本的等量PCR產(chǎn)物進(jìn)行混合和測(cè)序。

4 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

       利用微生物生態(tài)學(xué)的定量研究(QIIME)程序分析序列。在每次讀取結(jié)束時(shí)移除接頭序列、條形碼和以及每個(gè)讀長(zhǎng)末端的30個(gè)低質(zhì)量堿基，之后使用fastq-join方法以最小重疊區(qū)為20bp，重疊區(qū)10%的最大錯(cuò)配率進(jìn)行正向和反向讀長(zhǎng)拼接。丟棄低質(zhì)量序列（Phred質(zhì)量評(píng)分Q < 20或長(zhǎng)度小于200 bp），并在USEARCH程序中使用UCHIME算法過(guò)濾掉嵌合體。使用UCLUST方法將高質(zhì)量的數(shù)據(jù)以97%的相似性聚成可操作的分類(lèi)單元（OTUs）。SILVA 16S和18S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)分別用作細(xì)菌和真菌參考數(shù)據(jù)庫(kù)。去除singletons和非細(xì)菌或真菌的OTUs后，對(duì)高質(zhì)量序列進(jìn)行分析。

       在完成質(zhì)控后，分別從根際和根際樣品中獲得9003-33523和5811-27012個(gè)細(xì)菌序列，根際和根樣品的細(xì)菌OTU表分別被細(xì)分為8500和5500個(gè)序列。亞取樣序列聚類(lèi)為根際樣品1002-3256個(gè)OTUs（平均2588個(gè)），根際樣品817-2031個(gè)OTUs（平均1573個(gè)）。對(duì)于18S rRNA基因序列，質(zhì)控后分別從根際和根樣品中獲得4777-29260和1492-5413個(gè)高質(zhì)量序列。根際和根樣品的真菌文庫(kù)分別為每個(gè)樣品4000和1000個(gè)序列。將亞取樣序列聚類(lèi)為根際樣品704-1084個(gè)OTUs（平均895個(gè)），根際樣品192-301個(gè)OTUs（平均263個(gè)）?；诤喜⑿蛄械南嗨菩裕?/span>ANOSIM）初步分析表明，細(xì)菌和真菌群落的根際和根樣品之間存在顯著差異（P<0.001），因此，分別對(duì)根際和根樣品進(jìn)行序列分析。

5 數(shù)據(jù)分析

       使用SPSS20.0（IBM，芝加哥，美國(guó)）和R進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析和最小顯著性差異（LSD）分析，檢驗(yàn)施氮水平對(duì)土壤有機(jī)碳、土壤活性炭和根系分泌物的影響。利用R中的vegan包進(jìn)行冗余分析和Mantel檢驗(yàn)，以確定碳庫(kù)和OTU水平上微生物群落之間的相關(guān)性。利用R中的psych包對(duì)有機(jī)酸與細(xì)菌類(lèi)群、細(xì)菌類(lèi)群與真菌類(lèi)群進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，利用Bray-Curtis相異性距離矩陣進(jìn)行ANOSIM分析，以確定根和根際樣品之間細(xì)菌和真菌群落的顯著差異。

1 根際和根系分泌物中的碳

土壤活性炭（SAC）是構(gòu)成土壤食物網(wǎng)燃料的土壤碳的一部分，對(duì)養(yǎng)分循環(huán)有重大的影響。在所有生長(zhǎng)階段，N0對(duì)照（不施肥）樣品的根際土壤活性炭顯著低于N100、N200和N300施肥處理（每個(gè)小麥生長(zhǎng)期分別為100、200和300 kg N ha^-1）的小麥，雖然在大多數(shù)肥料處理樣品中沒(méi)有觀察到顯著的差異（圖1a）。根際土壤有機(jī)碳（SOC）水平也表現(xiàn)出類(lèi)似的規(guī)律（圖1b）。鮮根單位重量釋放的有機(jī)碳（ROC）如圖1c所示。在分蘗期和拔節(jié)期，4個(gè)施氮水平的ROC差異不顯著。成熟期，N200和N300的ROC顯著高于N0和N100。在不同生長(zhǎng)階段，拔節(jié)期（2.23-2.43mg/g根）的ROC水平高于分蘗期（0.30-0.34mg/g根）和成熟期（1.08-1.77mg/g根）。值得注意的是，報(bào)道的濃度被歸一化為根重，總ROC隨施氮水平的增加而增加。

       本研究測(cè)定了8種有機(jī)酸（乙酸、草酸、丙酮酸、延胡索酸、琥珀酸、蘋(píng)果酸、酒石酸和檸檬酸），除丙酮酸和延胡索酸外，其余均在根樣中檢出。有機(jī)酸的含量和組成隨生長(zhǎng)階段的不同而不同（圖1d）。分蘗期有機(jī)酸濃度之和為0.06-0.10mg C/g根，以琥珀酸、檸檬酸和蘋(píng)果酸為主，分別占所測(cè)有機(jī)酸的46-62%、17-26%和14-20%，拔節(jié)期有機(jī)酸總量為0.39-0.76mg C/g根；以琥珀酸為主，占有機(jī)酸總量的82-87%。成熟期有機(jī)酸濃度之和為0.14-0.23 mg C /g根，其中檸檬酸和蘋(píng)果酸占主導(dǎo)地位，分別占有機(jī)酸總量的55-92%和7-17%。

2 細(xì)菌群落對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育和施氮的響應(yīng)

對(duì)三個(gè)生長(zhǎng)階段和四個(gè)施肥水平下的小麥根際和根樣進(jìn)行高通量測(cè)序。不同生育期和施氮水平下根際和根樣中的細(xì)菌群落組成如圖2所示。在根際樣品中，分蘗期4種施氮水平下的細(xì)菌群落組成差異顯著（圖2a）。隨著施氮水平的提高，擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度降低，而放線菌門(mén)和變形菌門(mén)的相對(duì)豐度增加。拔節(jié)期和成熟期4個(gè)施肥水平下的土壤細(xì)菌群落組成均較分蘗期相似。在根樣中，變形菌門(mén)、放線菌門(mén)和擬桿菌門(mén)是三個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)（圖2b）。隨著施氮水平的提高，放線菌門(mén)的相對(duì)豐度降低，而厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度在拔節(jié)期顯著高于其它兩個(gè)時(shí)期。

主坐標(biāo)分析（PCoA）在操作分類(lèi)單元（OTU）級(jí)別進(jìn)行。根際（圖2c）和根樣（圖2e）的OTUs在植物生長(zhǎng)期都有明顯的分離，而根際氮肥效應(yīng)只在分蘗期出現(xiàn)。計(jì)算了各施氮水平下三個(gè)生長(zhǎng)階段間的差異距離，各生長(zhǎng)階段微生物群落結(jié)構(gòu)的差異隨根際施氮水平的提高呈下降趨勢(shì)（圖2d）?；?/span>OTU水平上微生物群落結(jié)構(gòu)的冗余分析（RDA）表明ROC與細(xì)菌群落顯著相關(guān)，分別占根際和根樣變化的19.0%和12.7%（表1），Mantel檢驗(yàn)結(jié)果也表明ROC與細(xì)菌群落具有顯著的相關(guān)性（表2）。

繪制了細(xì)菌群落在三個(gè)生長(zhǎng)階段和四個(gè)施肥水平下的微生物群落組成差異在目和屬水平的熱圖（圖3a、b）。在目水平上，拔節(jié)期和成熟期根際樣品中的微囊菌、丙酸桿菌、蓋菌、桿菌和根瘤菌的相對(duì)豐度顯著高于分蘗期（圖3a）。在根樣中，拔節(jié)期桿菌、乳酸桿菌和伯克氏桿菌的相對(duì)豐度顯著高于其它兩個(gè)時(shí)期。分蘗期根瘤菌和鞘氨醇單胞菌的相對(duì)豐度與施氮水平呈正相關(guān)，而根樣中鏈霉菌的相對(duì)豐度在各生育期呈相反趨勢(shì)（圖3b）。在屬水平上，根際樣品中節(jié)桿菌、單孢原菌、諾卡氏菌、鏈霉菌、芽孢桿菌和德沃斯氏菌在拔節(jié)期和成熟期的相對(duì)豐度顯著高于分蘗期。在根樣中，微桿菌、節(jié)桿菌、鞘氨醇單胞菌和德沃斯氏菌的相對(duì)豐度與施氮水平呈正相關(guān)，而鏈霉菌與各生育期施氮水平呈負(fù)相關(guān)。此外，拔節(jié)期芽孢桿菌、海洋桿菌和乳球菌的相對(duì)豐度顯著高于其他生長(zhǎng)期。

Mantel檢驗(yàn)表明，6種有機(jī)酸與根細(xì)菌群落顯著相關(guān)（表2）。為了深入了解細(xì)菌群落對(duì)有機(jī)酸的反應(yīng)，對(duì)這六種有機(jī)酸與細(xì)菌目（圖3a、b）和屬進(jìn)行了進(jìn)一步的相關(guān)分析。乙酸、草酸、琥珀酸和酒石酸與根際樣品中的微球菌目、芽單胞菌目、偶氮螺菌目和伯克霍爾德氏菌目及根樣品中的鞘脂桿菌目、芽孢桿菌目和乳酸桿菌目呈正相關(guān)，而與根際樣品中的噬幾丁質(zhì)菌目、噬纖維菌目、糖胞菌目和假單胞菌目及根樣品中的噬纖維菌目，纖維細(xì)桿菌目，糖胞菌目和粘球菌目呈負(fù)相關(guān)(圖3a, b)。在屬水平上，乙酸、草酸、琥珀酸、酒石酸與根際樣品中的節(jié)桿菌屬、德沃斯氏菌屬、馬賽菌屬及根樣品中的節(jié)桿菌屬、微單孢菌屬、野野村菌屬、土地桿菌屬、芽孢桿菌屬、海洋桿菌屬、乳球菌屬、馬賽菌屬和寡養(yǎng)單胞菌屬呈正相關(guān)而與根際樣品中的噬幾丁質(zhì)菌屬、農(nóng)研絲桿菌、Taibaiella、Ohtaekwangia、Mucilaginibacter和Acidibacter及根樣品中的農(nóng)研絲桿菌和Ohtaekwangia呈負(fù)相關(guān)。

根際和根樣中的真菌群落在門(mén)水平的組成分別如圖4a和圖4b所示。子囊菌在根際和根樣品中均占優(yōu)勢(shì)（>75%）。在根際樣品中，壺菌相對(duì)豐度在拔節(jié)期高于分蘗期，接合菌的相對(duì)豐度在拔節(jié)和成熟期高于分蘗期（圖4a）。根際樣品的優(yōu)勢(shì)真菌目（相對(duì)豐度>1%）為煤炱目(5-17%)、格孢菌目(5-31%)和肉坐菌目(13-30%)，根樣中占主導(dǎo)地位的真菌目(相對(duì)豐度>1%)為煤炱目(6-23%)、格孢菌目(5-30%)和肉坐菌目(20-62%)。所鑒定的真菌目對(duì)施氮和植物發(fā)育階段均沒(méi)有明顯的響應(yīng)模式，除根際的Calosphaeriales、Hypocreales和Sordariales外，均與根際施氮水平呈正相關(guān)；根樣中的格孢菌目相對(duì)豐度隨植物生長(zhǎng)而增加。在屬水平的群落組成上，鐮刀菌為優(yōu)勢(shì)屬，分別占根際和根樣相對(duì)豐度的9-23%和16-47%。與細(xì)菌群落的PCoA相比，基于OTUs相對(duì)豐度的真菌群落的PCoA在根際和根樣品的生長(zhǎng)階段中沒(méi)有顯示出明顯的分離（圖4c和e）。盡管如此，與對(duì)細(xì)菌群落的觀察一致，在根際樣品中觀察到隨著施氮量的增加，不同生長(zhǎng)階段之間的差異距離呈下降趨勢(shì)（圖4d）。RDA表明SAC和SOC分別占根際真菌群落變異的12.6%和14.8%，顯著高于ROC（表1），說(shuō)明根際碳對(duì)真菌群落的影響很大。Mantel檢驗(yàn)表明根樣本中SAC和真菌群落之間存在顯著相關(guān)性（表2）。

對(duì)根際和根樣中的細(xì)菌和真菌之間在三個(gè)生長(zhǎng)階段的相關(guān)性進(jìn)行了評(píng)估。采用相對(duì)豐度大于1%的屬進(jìn)行分析，根際樣品中有39個(gè)細(xì)菌屬和24個(gè)真菌屬，根樣品中有45個(gè)細(xì)菌屬和24個(gè)真菌屬。在根際樣品（表3和圖5a）的細(xì)菌和真菌中，分蘗期、拔節(jié)期和成熟期分別有123、82和100個(gè)顯著相關(guān)（p<0.05）。分蘗期的細(xì)胞弧菌、念珠菌和假黃單胞菌以及成熟期的念珠菌和節(jié)桿菌與9個(gè)以上的真菌屬顯著相關(guān)。根樣中的細(xì)菌和真菌在分蘗期有106個(gè)顯著相關(guān)，拔節(jié)期增加到128個(gè)，成熟期增加到130個(gè)（表3）。拔節(jié)期，假絲酵母菌、節(jié)桿菌和黃體桿菌與9個(gè)以上真菌屬顯著相關(guān)（圖5b）。

氮肥施用是最重要的農(nóng)業(yè)措施之一，在過(guò)去的半個(gè)世紀(jì)里促進(jìn)了全球作物產(chǎn)量的增加，以往的研究表明，超過(guò)一定閾值的過(guò)量施氮并不能促進(jìn)作物的進(jìn)一步增產(chǎn)，反而會(huì)導(dǎo)致大量的氮素?fù)p失，造成了一系列的環(huán)境問(wèn)題。氮肥的過(guò)度使用是當(dāng)前我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的主要問(wèn)題之一，特別是在華北平原等農(nóng)業(yè)集約化地區(qū)，提高氮肥利用效率、降低氮肥水平仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。由于細(xì)菌和真菌在根區(qū)氮素轉(zhuǎn)化中的重要作用，有必要對(duì)根相關(guān)微生物對(duì)氮肥的響應(yīng)進(jìn)行全面的研究，特別是與根系分泌有關(guān)的研究，這已被證明對(duì)植物吸收氮至關(guān)重要。

在本研究中，不同施氮處理（N100、N200和N300）根際土壤活性碳（SAC）和土壤有機(jī)碳（SOC）含量均顯著高于對(duì)照（N0）。這些變化可初步歸因于長(zhǎng)期施氮增加了根系生物量和根系分泌物總量。此外，由于作物殘?bào)w被還田，長(zhǎng)期來(lái)看，由于施氮而增加的地上作物生物量也有助于提高SAC和SOC水平。根際土壤活性炭(SAC)和土壤有機(jī)碳（SOC）沒(méi)有隨植物生長(zhǎng)階段的變化而變化，（圖1），表明不同施肥水平下根際土壤活性炭(SAC)和土壤有機(jī)碳（SOC）的差異主要是由20年栽培過(guò)程中根系分泌物的累積變化和作物殘?bào)w的還田造成的。

根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在分蘗期因施氮水平差異而明顯分離，但在拔節(jié)和成熟期聚集在一起（圖2c）。由于ROC水平在拔節(jié)期和成熟期顯著高于分蘗期，冗余分析（RDA）和Mantel檢驗(yàn)均表明細(xì)菌群落與ROC密切相關(guān)。不同施氮水平下微生物群落間的相似性增加，這可能是因?yàn)楦捣置谖锏挠绊懗^(guò)了根際氮有效性的影響。

促生根際菌（PGPR）與根密切接觸，能夠增強(qiáng)寄主植物在其環(huán)境中的適應(yīng)能力。在本研究中，根際節(jié)桿菌、芽孢桿菌、馬賽菌和德沃斯氏菌的相對(duì)豐度以及根中芽孢桿菌、海洋桿菌、乳球菌和馬賽菌的相對(duì)豐度在拔節(jié)期和成熟期均高于分蘗期（圖3a），這些屬被認(rèn)為是重要的PGPR。此外，Pearson相關(guān)分析表明，這些類(lèi)群與一種或幾種有機(jī)酸正相關(guān)（圖3b）。有趣的是，節(jié)桿菌、芽孢桿菌和德沃斯氏菌也與氮輸入水平呈正相關(guān)，對(duì)這些結(jié)果的一個(gè)可能解釋是，植物通過(guò)分泌有機(jī)酸來(lái)招募PGPR，從而對(duì)施氮水平增加作出響應(yīng)。事實(shí)上，已經(jīng)有研究表明通過(guò)根分泌的有機(jī)酸會(huì)招募PGPR。

不同施氮水平下，三個(gè)生育期的有機(jī)酸組成和數(shù)量也發(fā)生了變化。這可能是因?yàn)槭┑皆黾痈淖兞酥参锏纳頎顟B(tài)。對(duì)這一現(xiàn)象的另一個(gè)可能解釋是，過(guò)量的氮輸入導(dǎo)致土壤中其他養(yǎng)分如磷酸鹽的消耗。調(diào)節(jié)根系分泌物的數(shù)量和組成是植物為了應(yīng)對(duì)有限的養(yǎng)分而發(fā)展起來(lái)的一種策略。為了支持這一觀點(diǎn)，有機(jī)酸的分泌被認(rèn)為是從土壤中的無(wú)機(jī)復(fù)合物中釋放磷酸鹽的有效途徑。

植物發(fā)育和長(zhǎng)期施氮都對(duì)根系相關(guān)微生物的結(jié)構(gòu)有重要影響。在根區(qū)，細(xì)菌群落組成與根釋放的有機(jī)碳密切相關(guān)，而真菌群落與根際土壤活性炭相關(guān)。植物生長(zhǎng)期對(duì)根和根際細(xì)菌和真菌群落的相關(guān)性有不同的影響。大量的植物根際促生菌PGPR與有機(jī)酸和施氮水平相關(guān)，表明分泌有機(jī)酸以招募有益微生物可能是植物應(yīng)對(duì)氮素輸入的重要策略。這項(xiàng)研究是朝著更機(jī)械地理解微生物群落組成的變化如何調(diào)節(jié)和反映在集約農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中氮輸入的影響邁出的一步。

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