植物發(fā)育和氮肥共同作用下的小麥根系微生物群落變化

Root-associated microbiomes of wheat under the combined effect of plant development and nitrogen fertilization

Microbiome

Impact Factor 10.465 | CiteScore 9.86

https://doi.org/10.1186/s40168-019-0750-2

發(fā)表日期：2019-10-22

第一作者：Shuaimin Chen（陳帥民）^1，2

通訊作者：Chunsheng Hu(胡春勝)¹ and Binbin Li(劉彬彬)¹

合作作者：Tatoba R. Waghmode, Ruibo Sun, Eiko E. Kuramae

主要單位：

¹ 中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所農(nóng)業(yè)資源研究中心（Key Laboratory of Agricultural Water Resources, Hebei Key Laboratory of Soil Ecology, Center for Agricultural Resources Research, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, 286 Huaizhong Road, Shijiazhuang 050021, China）

日?qǐng)?bào)

本文通過研究四種不同水平無機(jī)氮施肥條件下小麥根和根際的細(xì)菌和真菌群落在分蘗期、拔節(jié)期和成熟期的組成、變化及根系釋放有機(jī)碳(ROC)，根系分泌的有機(jī)酸以及根際的土壤有機(jī)碳(SOC)和土壤活性碳(SAC)，確定了氮輸入的增加、碳有效性改變和植物根和根際微生物群落變化之間的關(guān)系。亮點(diǎn)如下：

1、在四種不同無機(jī)氮施肥條件下和分蘗期、拔節(jié)期和成熟期對(duì)小麥根和根際的細(xì)菌和真菌群落的組成進(jìn)行研究；

2、小麥根區(qū)微生物群落結(jié)構(gòu)變化受植株生長(zhǎng)狀況和氮素輸入的共同驅(qū)動(dòng)，揭示了不同施肥水平下引起根際土壤活性炭(SAC)和土壤有機(jī)碳（SOC）變化規(guī)律的原因；

3、植物通過分泌有機(jī)酸來招募植物根際促生菌(PGPR)，從而對(duì)增加的N輸入作出反應(yīng)；

4、細(xì)菌群落組成與根釋放的有機(jī)碳(ROC)密切相關(guān)，而真菌群落與根際土壤活性炭(SAC)密切相關(guān)。

摘要

背景

植物根在根內(nèi)和根際組裝微生物群落，且這些與根相關(guān)的微生物群落在植物營(yíng)養(yǎng)和生產(chǎn)力中起著關(guān)鍵作用。眾所周知，盡管在過去的50年里，中國(guó)農(nóng)田增加了合成肥料的投入，這不僅導(dǎo)致了產(chǎn)量的增加，還導(dǎo)致了環(huán)境問題。我們?nèi)狈@樣一個(gè)全面的理解，即在提高營(yíng)養(yǎng)投入的情況下，作物是如何招募與根相關(guān)的微生物群落的，尤其是通過調(diào)整根際代謝物和分泌物的數(shù)量和組成。

方法

我們對(duì)長(zhǎng)期施用四種不同水平的無機(jī)氮的情況下小麥(Triticum aestivum L.)根和根際的細(xì)菌和真菌群落在分蘗期、拔節(jié)期和成熟期的組成進(jìn)行了研究。我們對(duì)根系釋放有機(jī)碳(ROC)，根系分泌的有機(jī)酸以及根際的土壤有機(jī)碳(SOC)和土壤活性碳(SAC)進(jìn)行了定量研究。

結(jié)果

對(duì)根系釋放有機(jī)碳(ROC)水平在小麥不同生長(zhǎng)階段之間存在顯著差異，與細(xì)菌群落的相關(guān)性大于與真菌群落的相關(guān)性。長(zhǎng)期施氮提高了根際土壤有機(jī)碳(SOC)和土壤活性碳(SAC)水平，但在各生育期間差異不大。在植物的生長(zhǎng)階段根際微生物群落結(jié)構(gòu)隨施氮量的增加呈下降趨勢(shì)。此外，在根樣品中，與分蘗期相比，拔節(jié)期和成熟期的細(xì)菌和真菌屬明顯增多。許多細(xì)菌屬因施N肥而發(fā)生改變，包括節(jié)桿菌，芽孢桿菌和德沃斯氏菌屬，其與乙酸、草酸、琥珀酸、酒石酸的含量水平顯著相關(guān)。

結(jié)論

結(jié)果表明，小麥根區(qū)微生物群落結(jié)構(gòu)變化受植株生長(zhǎng)狀況和氮素輸入的共同驅(qū)動(dòng)。植物生長(zhǎng)期對(duì)細(xì)菌的影響大于真菌的影響。許多細(xì)菌屬被描述為正相關(guān)于氮肥的植物根際促生菌(PGPR)，并且它們的豐度顯著相關(guān)于有機(jī)酸水平，表明有機(jī)酸的分泌可能是植物在根區(qū)招募有益微生物以應(yīng)對(duì)高氮輸入的策略。這些結(jié)果為深入研究氮輸入增加、碳有效性改變和集約化農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)植物根和根際微生物群落變化之間的關(guān)系提供了新穎的見解

關(guān)鍵字：根相關(guān)微生物，根系分泌物，有機(jī)酸，氮肥，植物生長(zhǎng)階段

背景

植物微生物組為宿主植物提供了額外的基因庫(kù)，因此常被稱為第二植物基因組或擴(kuò)展基因組。值得注意的是，近年來，植物根相關(guān)微生物群落因其在宿主營(yíng)養(yǎng)、發(fā)育和免疫方面的重要作用而受到了前所未有的關(guān)注。最近的一項(xiàng)研究表明，植物的根從周圍土壤聚集微生物群落。這些區(qū)域中的微生物群可能對(duì)宿主植物有益，也可能有害，這種平衡的改變可能會(huì)極大地影響農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的作物生產(chǎn)。因此，了解根相關(guān)微生物群落對(duì)土壤管理措施和植物生理狀態(tài)的響應(yīng)具有重要的農(nóng)學(xué)意義。

中國(guó)是世界范圍內(nèi)最大的化學(xué)氮肥消費(fèi)國(guó)，將全球30%以上的肥料用于大約全球9%的農(nóng)田(FAOSTAT, www.fao.org)?；实母邠p失率和低利用效率是我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中普遍存在的問題。例如，在華北平原(North China Plain，NCP)（中國(guó)最大的農(nóng)作物產(chǎn)區(qū)之一），一個(gè)小麥生長(zhǎng)季節(jié)每公頃土地使用近300公斤氮肥，據(jù)估計(jì)超過30%的氮肥被過度使用。過量施用氮肥導(dǎo)致了地下水硝酸鹽污染、溫室氣體排放增加、和土壤酸化等一系列環(huán)境問題。特別是，2005年氮肥導(dǎo)致的N₂O排放量比1980年增加了460 Gg N yr ^-1。可被植物吸收的氮主要依賴于根相關(guān)的微生物群落。然而，在氮素應(yīng)用和華北平原（NCP）一樣高的地區(qū)，根區(qū)微生物群落是如何響應(yīng)氮素有效性的變化以及由此引起的植物根系分泌物的變化的，目前還沒有研究。

根分泌物和根際土壤的碳水平是影響植物氮素吸收和微生物群落的重要因素。例如，叢枝菌根真菌最近被證明能夠?qū)⒌D(zhuǎn)移到植物中，這種真菌共生體介導(dǎo)的氮吸收是由宿主植物提供的碳刺激的。植物根系釋放的不穩(wěn)定有機(jī)碳可以促進(jìn)或抑制土壤有機(jī)質(zhì)的礦化，這是根際中植物-土壤相互作用的一個(gè)重要方面，被稱為根際啟動(dòng)效應(yīng)。越來越多的證據(jù)表明，根際啟動(dòng)是植物獲取有機(jī)氮資源的重要策略，且在森林生態(tài)系統(tǒng)中，CO₂升高引起的啟動(dòng)效應(yīng)是由根沉積物的增加和微生物活性增強(qiáng)暫時(shí)驅(qū)動(dòng)的。考慮到根區(qū)碳庫(kù)對(duì)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中作物氮回收率的重要性，需要對(duì)氮肥引起的不同碳利用水平下的根相關(guān)微生物群落進(jìn)行調(diào)查。

根相關(guān)的微生物群落受周圍土壤條件和宿主植物的動(dòng)態(tài)影響。土壤被認(rèn)為是“微生物種子庫(kù)”，為植物提供了大量的微生物候選庫(kù)。作為調(diào)節(jié)本地生長(zhǎng)條件的一種策略，植物有能力通過向根際分泌生物活性分子來改變土壤微生物群落的土壤條件，從而改變土壤環(huán)境。因此，不同的植物物種或基因型可以通過根系形態(tài)和根系分泌物類型的差異來招募特定的微生物組。此外，根系分泌物的組成和根相關(guān)的微生物群落結(jié)構(gòu)受到植物生長(zhǎng)期的強(qiáng)烈影響。在植物發(fā)育過程中，根相關(guān)微生物群落組成的變化已經(jīng)在最近的許多研究中通過分子技術(shù)手段得到了闡明，這些變化被認(rèn)為是由根系分泌物的變化引起的，雖然在這些研究中沒有對(duì)根系分泌物的成分和數(shù)量進(jìn)行評(píng)估。

根系分泌物是由廣泛的含碳代謝產(chǎn)物組成，如糖類、氨基酸和有機(jī)酸,是宿主植物的重要碳成本，也是微生物的底物和信號(hào)分子, 導(dǎo)致宿主植物與微生物之間復(fù)雜的生物地球化學(xué)交換。作為根系分泌物的主要低分子量化合物，有機(jī)酸已被證明是形成根際微生物群落結(jié)構(gòu)的選擇劑，其刺激特定微生物種群的生長(zhǎng)和/或抑制其他微生物種群的發(fā)展。培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，與碳水化合物相比，有機(jī)酸對(duì)土壤微生物群落優(yōu)勢(shì)類群的豐富度和結(jié)構(gòu)影響更大。有機(jī)酸的分泌是植物應(yīng)對(duì)磷、氮等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏的重要策略。然而，由于農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中化肥的過度使用而導(dǎo)致的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度升高對(duì)有機(jī)酸分泌的影響及其對(duì)微生物群落的影響尚未得到研究。

在本研究中，我們采集了4個(gè)氮肥水平下小麥植株3個(gè)生長(zhǎng)階段的根和根際樣本。通過測(cè)定根系分泌物的數(shù)量與組成及根際中的有機(jī)碳，評(píng)估植物的生長(zhǎng)發(fā)育和長(zhǎng)期施氮肥對(duì)碳有效性的影響。我們采用16S和18S rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)對(duì)根際和根中的細(xì)菌和真菌群落進(jìn)行檢測(cè)。本研究的結(jié)果提供了關(guān)于根系分泌物、根際碳和根相關(guān)微生物群落在不同植物生長(zhǎng)階段和氮肥水平上的深層次的信息。

結(jié)果

根系分泌物及根際中的碳

Carbon in the rhizosphere and root exudates

土壤活性碳(Soil active carbon, SAC)是構(gòu)成土壤食物網(wǎng)燃料的土壤碳的一部分，它對(duì)養(yǎng)分循環(huán)有強(qiáng)烈的影響。N0對(duì)照(不施氮肥)的小麥根際土壤活性炭顯著低于N100、N200和N300施肥處理(分別為每個(gè)小麥生長(zhǎng)期施氮量為100、200和300公斤)的小麥，雖然在大多數(shù)肥料處理樣品中沒有觀察到顯著的差異（圖1a)。根際土壤有機(jī)碳水平也表現(xiàn)出相似的變化規(guī)律（圖1b）。新鮮根系單位重量釋放有機(jī)碳(root-release organic carbon, ROC)測(cè)定結(jié)果如圖1c所示。小麥分蘗期和拔節(jié)期，4個(gè)施肥水平的根系釋放的有機(jī)碳（ROC）差異不顯著。在小麥成熟階段，N200和N300樣品的根系釋放的有機(jī)碳均顯著高于N0和N100的樣品。在小麥的不同生長(zhǎng)階段，拔節(jié)期(2.23-2.43 mg/g根)的根系釋放的有機(jī)碳值高于分蘗期(0.30-0.34 mg/g根)和成熟期(1.08-1.77 mg/g根)。值得注意的是，報(bào)道的濃度被歸一化為根重，總根系釋放的有機(jī)碳值隨著施氮量的增加而增加。

圖1.小麥3個(gè)生長(zhǎng)期4個(gè)不同氮肥水平的土壤活性碳(a)、土壤有機(jī)碳(b)、根系釋放有機(jī)碳(c)和有機(jī)酸(d)。誤差線表示三個(gè)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。不同字母表示各生育期氮肥水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。

本研究測(cè)定了8種有機(jī)酸(乙酸、草酸、丙酮酸、富馬酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸); 除丙酮酸和延胡索酸外，其余均在根樣品中檢出。有機(jī)酸的含量和組成隨生育期的不同而不同(圖1d)。分蘗期有機(jī)酸濃度總和為0.06-0.10 mg C/g根，以琥珀酸、檸檬酸和蘋果酸為主；它們分別占測(cè)定有機(jī)酸的46-62%、17-26%和14-20%。拔節(jié)期總有機(jī)酸濃度為0.39-0.76 mg C/g根;以琥珀酸為主，占有機(jī)酸總量的82-87%。成熟期有機(jī)酸濃度之和為0.14-0.23 mg C/g根，其中檸檬酸和蘋果酸占主導(dǎo)地位，分別占有機(jī)酸總量的55-92%和7-17%。

細(xì)菌群落對(duì)植物發(fā)育和氮肥的響應(yīng)

Bacterial community responses to plant development and N fertilization

對(duì)小麥三個(gè)生長(zhǎng)階段和四個(gè)氮肥水平的根際和根樣品進(jìn)行了高通量測(cè)序。小麥不同生長(zhǎng)階段和施氮量下根際和根樣品的細(xì)菌群落組成如圖2所示。根際樣品中，分蘗期4個(gè)施肥水平的細(xì)菌群落組成差異顯著(圖2a)。擬桿菌門的相對(duì)豐度降低，放線菌門和變形菌門(α-變形菌門和γ-變形菌門)的相對(duì)豐度隨施氮量的增加而增加。拔節(jié)期和成熟期4個(gè)N處理樣品間細(xì)菌群落組成比分蘗期相似。在根樣品中，變形桿菌門、放線菌門和擬桿菌門是三個(gè)優(yōu)勢(shì)門(圖2b)。放線菌門的相對(duì)豐度隨施氮量的增加而降低，而厚壁菌門在拔節(jié)期明顯高于其他兩個(gè)階段。

圖2.根際(a)和根(b)樣品中門水平的細(xì)菌群落組成。根際(c)和根(e)樣品的細(xì)菌群落主坐標(biāo)分析(PCoA) 。差異距離顯示了根際(d)和根(f)樣品在不同生長(zhǎng)階段的微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。PCoA和差異距離是基于OTU水平上的Bray-Curtis距離。

主坐標(biāo)分析(PCoA)在操作分類單元(OTU)水平進(jìn)行。根際(圖2c)和根樣品(圖2e)的OTUs均被植物生長(zhǎng)階段明顯的分離開，而根際氮肥效應(yīng)只在分蘗期出現(xiàn)。在各氮肥水平下計(jì)算三個(gè)生育期間的差異距離，且根際中不同生長(zhǎng)階段微生物群落結(jié)構(gòu)的差異隨著根際施氮量的增加呈下降趨勢(shì)(圖2d)?；贠TU水平上微生物群落結(jié)構(gòu)的冗余分析(RDA)表明，ROC與細(xì)菌群落顯著相關(guān)，分別占根際和根樣本變異的19.0%和12.7%(表1)。Mantel檢驗(yàn)結(jié)果也顯示ROC與細(xì)菌群落具有顯著的相關(guān)性(表2)。

表1. 根據(jù)冗余分析(RDA)，不同碳庫(kù)解釋的細(xì)菌和真菌群落差異

顯著性水平:P< 0.05, ;P < 0.01,^** ;P < 0.001,^**。ROC:根釋放有機(jī)碳;SAC:土壤活性炭;SOC: 土壤有機(jī)碳。
分析基于OTU水平進(jìn)行

表2. 細(xì)菌和真菌群落與根際和根中有機(jī)酸和碳庫(kù)的相關(guān)性

Mantel檢驗(yàn)采用Pearson相關(guān)法。碳庫(kù)是根據(jù)歐氏距離計(jì)算的，根據(jù)Bray-Curtis距離計(jì)算微生物群落結(jié)構(gòu)(OTU水平)。P是顯著性水平。顯示P<0.05的值。ROC:根釋放有機(jī)碳;SAC:土壤活性炭;SOC: 土壤有機(jī)碳

繪制了細(xì)菌群落在三個(gè)生長(zhǎng)階段和四個(gè)氮肥水平下的在目(圖3a,b, Additional file 2)和屬(Additional file 1: Figures
S2 and S3, Additional file 3) 兩個(gè)分類水平上的說明微生物群落組成差異的熱圖。在目水平上，根際樣品中微球菌、丙酸桿菌、蓋菌、桿菌和根瘤菌的相對(duì)豐度(成對(duì)t檢驗(yàn))在拔節(jié)和成熟階段顯著高于分蘗期(圖3a)。在根樣中，拔節(jié)期的桿菌、乳酸桿菌和伯克氏桿菌的相對(duì)豐度明顯大于其他兩個(gè)時(shí)期。分蘗期根瘤菌和鞘瘤菌的相對(duì)豐度與氮肥水平呈正相關(guān)，而在所有生長(zhǎng)階段的根樣本中，鏈霉菌則呈現(xiàn)出相反的趨勢(shì)(圖3b)。在屬水平上(Additional file 1: Figure
S2)，在拔節(jié)和成熟階段根際樣品中的節(jié)桿菌、單孢原菌、新心菌、鏈霉菌、芽孢桿菌的相對(duì)豐度顯著高于分蘗期。在根樣例中(Additional
file 1: Figure S3),微桿菌、節(jié)桿菌、鞘單胞菌、靈芝菌的相對(duì)豐度與氮肥水平呈正相關(guān)，而鏈霉菌在各生育階段與施氮量呈負(fù)相關(guān)。此外，芽孢桿菌、海洋桿菌和乳球菌的相對(duì)豐度在拔節(jié)期明顯高于其他生長(zhǎng)期。

圖3. 優(yōu)勢(shì)菌的目水平熱圖(左)和根際(a)和根(b)樣品中優(yōu)勢(shì)菌目與有機(jī)酸(右)的Pearson相關(guān)分析。屬水平的結(jié)果在(Additional file 1: Figures S4 and S5)中列出。

NA表示無顯著相關(guān)性(P > 0.05)

曼特爾檢驗(yàn)表明，這6種有機(jī)酸與根細(xì)菌群落具有顯著的相關(guān)性(表2)。為了深入了解細(xì)菌群落對(duì)有機(jī)酸的反應(yīng)，對(duì)這6種有機(jī)酸與細(xì)菌目(圖3a, b)和屬(Additional file 1: Figures S2 and S3)的相關(guān)性進(jìn)行了進(jìn)一步分析。乙酸、草酸、琥珀酸、酒石酸與根際樣品中的微球菌目、芽單胞菌目、偶氮螺旋菌目和伯克霍爾德氏菌目及根樣品中的鞘脂桿菌目、芽孢桿菌目和乳酸菌目呈正相關(guān)而與根際樣品中的幾丁噬菌體、細(xì)胞噬菌體、糖胞菌目和假單胞菌目及根樣品中的細(xì)胞原噬菌體，纖維細(xì)菌，糖精菌和粘液球菌呈負(fù)相關(guān)(圖3a, b)。在屬水平上，乙酸、草酸、琥珀酸、酒石酸與根際樣品中的節(jié)桿菌屬、德沃斯氏菌屬、馬賽菌屬及根樣品中的節(jié)桿菌屬、微單孢菌屬、諾莫菌屬、地桿菌屬、芽孢桿菌屬、海洋桿菌屬、乳球菌屬、馬賽菌屬和寡養(yǎng)單胞菌屬呈正相關(guān)而與根際樣品中的鞘氨醇桿菌屬、鄉(xiāng)村農(nóng)研絲桿菌、Taibaiella、Ohtaekwangia、Mucilaginibacter和Acidibacter及根樣品中的鄉(xiāng)村農(nóng)研絲桿菌和Ohtaekwangia呈負(fù)相關(guān) (Additional file 1: Figures S2 and S3)。

真菌群落對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育與施N肥的響應(yīng)

Fungal community responses to plant development and N fertilization

根際和根樣品中真菌門水平的群落組成分別如圖4a和b所示。在根際和根樣品中，子囊菌是優(yōu)勢(shì)門(> 75%)。在根際樣品中，壺菌在拔節(jié)期的相對(duì)豐度高于分蘗期，而接合菌在拔節(jié)期和成熟期的相對(duì)豐度高于分蘗期(圖4a)。根際樣品中占主導(dǎo)地位的真菌目(相對(duì)豐度>1%)為卷須目(5-17%)、多孢目(5-31%)和腔菌目(13-30%)而根樣中占主導(dǎo)地位的真菌目(相對(duì)豐度>1%)為煤炱目(6-23%)、多孢目(5-30%)和腔菌目(20-62%)(Additional file 1: Figure S4,Additional file 4)。所鑒定的真菌目對(duì)氮肥或植株發(fā)育階段沒有明顯的響應(yīng)模式，除了Calosphaeriales、Hypocreales和Sordariales，它們與根際氮肥水平一般呈正相關(guān);根樣品中多孢子菌的相對(duì)豐度隨植物的生長(zhǎng)而增加。群落屬水平的組成表明，鐮刀菌屬為優(yōu)勢(shì)屬(Additional file 1: Figure S5, Additional file 5),分別占根際和根樣品相對(duì)豐度的9-23%和16-47%。與細(xì)菌群落的PCoA相比，基于OTUs相對(duì)豐度的真菌群落的PCoA在根際和根樣品的生長(zhǎng)階段中沒有顯示出明顯的分離(圖4c and e)。盡管如此，與對(duì)細(xì)菌群落的觀察結(jié)果一致，在根際樣品中，隨著施氮量的增加，不同生長(zhǎng)階段的距離差異有減小的趨勢(shì)(圖4d)。RDA顯示，土壤活性炭SAC和土壤有機(jī)碳SOC分別占根際真菌群落變異的12.6和14.8%，顯著高于根釋放有機(jī)碳ROC解釋的比例(表1)，表明真菌群落受根際碳的強(qiáng)烈影響。曼特爾試驗(yàn)表明，在根樣品中，土壤活性炭SAC和真菌群落之間存在顯著的相關(guān)性 (Table 2)。

圖4.根際(a)和根(b)樣品中的真菌群落組成。根際(c)與根(e)樣品中真菌群落的PCoA分析。根際(d)和根(f)樣品的相異距離。OTU水平上基于Bray-Curtis距離的PcoA和相異距離。

細(xì)菌和真菌的關(guān)系

Correlations between bacteria and fungi

我們對(duì)根際和根樣品中的細(xì)菌和真菌在三個(gè)生長(zhǎng)階段的相關(guān)性進(jìn)行評(píng)估。對(duì)相對(duì)豐度大于1%的屬進(jìn)行分析，根際樣本中有39個(gè)細(xì)菌屬和24個(gè)真菌屬，根樣本中有45個(gè)細(xì)菌屬和24個(gè)真菌屬。在細(xì)菌和真菌的根際樣本中(表3和圖5a)，分蘗期、拔節(jié)期和成熟期分別有123、82和100個(gè)顯著相關(guān)(p < 0.05)。分蘗期的細(xì)胞弧菌、念珠菌和假黃單胞菌，成熟期的念珠菌和節(jié)桿菌與9個(gè)以上的真菌屬顯著相關(guān)。在根樣本中的細(xì)菌和真菌中，分蘗期有106個(gè)顯著相關(guān)，拔節(jié)期有增加到128個(gè)，成熟期增加到130個(gè)(表3)。在拔節(jié)期，假絲酵母菌、節(jié)桿菌和黃體桿菌與9個(gè)以上真菌屬顯著相關(guān)(圖5b)。

表3. 根際和根樣品中細(xì)菌和真菌屬的相關(guān)性

圖5. 根際(a)和根(b)樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌與真菌屬(相對(duì)豐度>1%)在分蘗、拔節(jié)和成熟三個(gè)生長(zhǎng)階段的相關(guān)性。采用Spearman法對(duì)所有兩兩比較進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)意義分析; 只有顯著相關(guān)，正相關(guān)(藍(lán)色方塊)或負(fù)相關(guān)(紅色方塊)(p值< 0.05)被顯示。

討論 Discussion

氮肥的施用是最重要的農(nóng)業(yè)措施之一，在過去的半個(gè)世紀(jì)里，氮肥的施用促進(jìn)了全球農(nóng)作物產(chǎn)量的增長(zhǎng)。以往的研究表明，超過一定閾值的過量氮肥并不會(huì)進(jìn)一步提高作物產(chǎn)量，反而會(huì)導(dǎo)致大量的N損失并造成了一系列的環(huán)境問題。氮肥的過度使用是當(dāng)前我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的主要問題之一，特別是在集約化農(nóng)業(yè)地區(qū)，如華北平原，提高氮素利用效率和降低氮肥水平仍然具有挑戰(zhàn)性。由于細(xì)菌和真菌在根區(qū)氮素周轉(zhuǎn)中的重要作用，有必要對(duì)根相關(guān)菌群對(duì)氮肥的響應(yīng)進(jìn)行綜合研究，特別是與根系分泌有關(guān)的相關(guān)菌群，這已被證明對(duì)植物吸收氮至關(guān)重要。

在本研究中，不同氮肥處理(N100、N200和N300)下根際土壤活性炭(SAC)和土壤有機(jī)碳(SOC)的數(shù)量較對(duì)照(N0)顯著增加。這些變化可以初步歸因于氮肥的長(zhǎng)期效應(yīng)，其增加了根系生物量和根系分泌物總量。此外，由于作物殘?bào)w被還田，氮肥處理增加了地上作物的生物量，從長(zhǎng)期來看也促進(jìn)了土壤活性炭(SAC)和土壤有機(jī)碳（SOC）水平的提高。根際土壤活性炭(SAC)和土壤有機(jī)碳（SOC）不像根釋放的有機(jī)碳(ROC)那樣隨植物生長(zhǎng)階段而波動(dòng)（圖1），說明不同施肥水平下根際土壤活性炭(SAC)和土壤有機(jī)碳（SOC）的差異主要是由于作物根系分泌物的累積變化和在20年的栽培過程中作物殘?bào)w的還田引起的。

根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在分蘗期因施氮量的不同而明顯分離，但在拔節(jié)期和成熟期則聚集在一起（圖2c）。因?yàn)樵诎喂?jié)和成熟階段根釋放的有機(jī)碳(ROC)水平明顯高于分蘗期，并且冗余分析(RDA)和Mantel試驗(yàn)表明，細(xì)菌群落與根釋放的有機(jī)碳(ROC)密切相關(guān)，不同氮肥水平下微生物群落相似性的增加可能是由于根系分泌物的影響超過了根際氮有效性的影響。

植物根際促生菌(PGPR)與植物的根有著密切的聯(lián)系，能夠增強(qiáng)宿主植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力。本研究中，根際節(jié)桿菌、芽孢桿菌、麻絲菌和假絲酵母的相對(duì)豐度和根芽孢桿菌、海洋桿菌、乳球菌和麻絲菌的相對(duì)豐度在拔節(jié)和成熟期高于分蘗期（圖3a），這些屬被認(rèn)為是重要的植物根際促生菌(PGPR)。此外,皮爾遜相關(guān)分析表明，這些類群與一種或幾種有機(jī)酸呈正相關(guān)（圖3b）。有趣的是，節(jié)桿菌、芽孢桿菌和奉獻(xiàn)菌也與N輸入水平呈正相關(guān)。對(duì)這些結(jié)果的一個(gè)可能的解釋是，植物通過分泌有機(jī)酸來招募植物根際促生菌(PGPR)，從而對(duì)增加的N輸入作出反應(yīng)。事實(shí)上，根分泌有機(jī)酸招募植物根際促生菌(PGPR)已經(jīng)在之前的一些研究中得到了證明。

有機(jī)酸的組成和量也隨著施肥水平的變化而變化。一個(gè)直接的解釋是增加氮素改變了植物的生理狀態(tài)。對(duì)這一現(xiàn)象的另一種可能的解釋是，過量的N輸入導(dǎo)致了土壤中其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，如磷。調(diào)節(jié)根系分泌物的數(shù)量和組成是植物為應(yīng)對(duì)有限的養(yǎng)分而發(fā)展起來的一種策略。為了支持這一觀點(diǎn)，有機(jī)酸的分泌被認(rèn)為是一種從土壤無機(jī)復(fù)合物中釋放磷酸鹽的有效途徑。

根際真菌群落受植物生長(zhǎng)階段、土壤特征和植物種類的影響。最近的一項(xiàng)研究還表明，凋落物的施用引起的啟動(dòng)效應(yīng)可能通過促進(jìn)真菌生長(zhǎng)而增強(qiáng)根際活性。但在本研究中，生長(zhǎng)階段對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)沒有顯著影響（圖4）。此外，RDA表明，土壤活性炭(SAC)對(duì)根際和根樣品的真菌群落結(jié)構(gòu)都有實(shí)質(zhì)性的影響（表1）。最近的一項(xiàng)研究表明，植物內(nèi)生真菌是從周圍土壤中招募的真菌的一個(gè)子集，因此，根系真菌和根際真菌與周圍土壤的土壤因子密切相關(guān)也就不足為奇了。

結(jié)論 Conclusions

植物生長(zhǎng)發(fā)育和長(zhǎng)期施氮對(duì)根相關(guān)微生物群落結(jié)構(gòu)都有重要影響。在根區(qū)，細(xì)菌群落組成與根釋放的有機(jī)碳(ROC)密切相關(guān)，而真菌群落與根際土壤活性炭(SAC)密切相關(guān)。植物生長(zhǎng)發(fā)育階段對(duì)根際和根際樣品中細(xì)菌和真菌群落的相關(guān)性有不同程度的影響。有機(jī)酸和氮肥水平與許多植物根際促生菌(PGPR)相關(guān)，表明有機(jī)酸的分泌可能是植物招募有益微生物的一種重要策略。這項(xiàng)研究代表朝著更機(jī)械化地理解微生物群落組成的變化如何調(diào)節(jié)和反映集約化農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中氮輸入的影響邁出了一步。

方法

田間試驗(yàn)和樣品采集

Field experiment and sample collection

1998年，在中國(guó)河北省欒城縣欒城農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)試驗(yàn)站(37°53′N, 114°41′E，海拔50米)進(jìn)行了長(zhǎng)期氮肥田間試驗(yàn)。試驗(yàn)包括4個(gè)施肥水平，分別為每個(gè)小麥生長(zhǎng)期0、100、200和300公斤N/公頃，施于3個(gè)重復(fù)的地塊。本研究使用的土壤為潮土，pH為7.53-7.95，總碳(TC)為17.03-20.80 g/kg，總氮(TN)為1.13-1.70 g/kg。分別于2016年11月(Feekes生長(zhǎng)期2-3期)、2017年3月(Feekes階段6-7期)、2017年5月(Feekes階段11)三個(gè)小麥生長(zhǎng)期采集根際和根樣品，在本研究中分別稱為分蘗期、拔節(jié)期和成熟期。在不同氮肥水平下，每個(gè)生長(zhǎng)期采集3個(gè)重復(fù)的根芯樣本。本研究中的根際樣品嚴(yán)格定義為根表面2毫米以內(nèi)的土壤。輕輕地?fù)u動(dòng)根部以去除松散的土壤團(tuán)塊，然后通過刷去根部殘留的土壤來仔細(xì)收集根際樣本。為了減少對(duì)附著在根上的叢枝菌根真菌和下游DNA提取的影響，用無菌蒸餾水沖洗根，用于根分泌物和根微生物群落的分析。我們將本研究中的“根微生物群落”定義包括根內(nèi)層和根表面的微生物群落，因?yàn)闃颖静杉椒]有區(qū)分這兩個(gè)取樣部分。

SAC、SOC、ROC和有機(jī)酸的測(cè)定

Determination of SAC, SOC, ROC and organic acids

由于只調(diào)查了根際和根樣品，土壤有機(jī)碳和土壤活性炭在本研究中指的是根際的土壤有機(jī)碳(SOC)和土壤活性炭(SAC)。土壤有機(jī)碳(SOC)是以傳統(tǒng)的方法定義，指土壤中有機(jī)化合物的碳成分。本研究將根系釋放有機(jī)碳(root-release organic carbon, ROC)定義為根系分泌物中的總碳(標(biāo)準(zhǔn)化的每克根系)。采用高錳酸鉀(KMnO₄)氧化C法測(cè)定土壤活性炭(SAC)。簡(jiǎn)而言之，將1.0 g風(fēng)干土壤與20 ml濃度為0.02 M的KMnO₄混合，在25℃下以200 rpm的速度搖動(dòng)2分鐘。然后，950×g離心5 min，用去離子水按1:50比例稀釋上清。用紫外分光光度計(jì)在550 nm處測(cè)定了稀釋后的樣品的吸光度(UV-2450,
Shimadzu)。選擇標(biāo)準(zhǔn)的范圍是為了充分覆蓋樣品的濃度。利用KMnO₄濃度的變化來估計(jì)氧化碳的量，假設(shè)在氧化0.75 mM或9 mg碳的過程中消耗了1 mM MnO₄^?(Mn (VII)到Mn (II))。SOC采用K₂Cr₂O₇-H₂SO₄氧化法測(cè)定。

取新鮮根0.4 g，加入1.5 ml消毒去離子水，以1400轉(zhuǎn)/分鐘的速度振蕩30分鐘，提取根滲出液。樣品以13000×g離心5 min，并且上層清液通過0.22 μm注射器式過濾器進(jìn)行過濾。然后，用總有機(jī)碳分析儀測(cè)定0.5 ml過濾過的上清液的ROC。用配備反相硅膠C18柱(Atlantis T3,
250 × 4.6 mm, 5 μm, Waters)的高效液相色譜儀測(cè)定有機(jī)酸(Waters e2695, Milford, MA, USA) ；10 μl根分泌物樣本在用20 mm磷酸鈉緩沖液(pH=2.73)以流速為0.5 ml/min，溫度為30℃的條件下被提取。在210 nm處監(jiān)測(cè)吸光度，并且用標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸建立了標(biāo)定曲線。

DNA提取和擴(kuò)增子測(cè)序

DNA extraction and amplicon sequencing

總基因組DNA通過使用E.Z.N.A.?土壤DNA試劑盒(Omega Biotek, Inc., Norcross,
GA)按照說明書從0.5 g的根際土壤或用液氮研磨得到的0.4 g的新鮮根粉中提取。分別用引物對(duì)341F:785R和FR1:FF390擴(kuò)增16S和18S rRNA基因。引物中含有簡(jiǎn)并的堿基，用于在第二輪PCR中連接Illumina測(cè)序接頭和雙端索引條形碼。PCR反應(yīng)體系為25μl，其包含12.5 μl預(yù)混料(Phanta高保真度DNA聚合酶,Vazyme生物科技有限公司,中國(guó)),1 μl引物(10μM),和 1μl DNA模板(大約20 ng的DNA)。PCR條件為:95℃，3 min;95°C 30 s, 55°C 30 s, 72°C 30 s 25個(gè)循環(huán);最后在72°C下延長(zhǎng)10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用AMPure XP beads(Beckman Coulter, Inc.,Brea, CA) 按照說明書進(jìn)行純化。隨后進(jìn)行8個(gè)循環(huán)的PCR，將雙索引條形碼和Illumina測(cè)序接頭添加到每個(gè)樣本中，然后用AMPure磁珠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。將每個(gè)樣品等量的PCR產(chǎn)物進(jìn)行混合通過Illumina MiSeq PE300平臺(tái)(GENEWIZ, Suzhou,China)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)存放在歐洲核苷酸檔案庫(kù)，接入號(hào)為PRJEB33393。

測(cè)序數(shù)據(jù)分析

Analysis of sequencing data

利用微生物生態(tài)學(xué)的定量研究(QIIME)程序分析序列。接頭序列、條形碼和以及每個(gè)讀長(zhǎng)末端的30個(gè)低質(zhì)量堿基被移除，之后使用fastq-join方法以最小重疊區(qū)為20bp，重疊區(qū)10%的最大錯(cuò)配率進(jìn)行正向和反向讀長(zhǎng)拼接。丟棄低質(zhì)量序列(Phred質(zhì)量評(píng)分Q < 20或長(zhǎng)度小于200 bp)，且在USEARCH程序中使用UCHIME算法過濾掉嵌合體。使用UCLUST方法將高質(zhì)量的數(shù)據(jù)按97%的相似度聚成可操作分類單元(OTUs)。SILVA 16S和18S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)分別作為細(xì)菌和真菌參考數(shù)據(jù)庫(kù)。在去除非細(xì)菌和非真菌的OTUs和singletons后，對(duì)高質(zhì)量序列進(jìn)行分析。

質(zhì)控后，每個(gè)樣本分別從根際和根樣本中獲得9003-33,523和5811-27,012個(gè)細(xì)菌序列。根際和根樣本的細(xì)菌OTU表分別亞采樣到8500和5500個(gè)序列。根際樣本亞采樣的序列被聚成1002-3256個(gè)OTUs(平均2588個(gè))和根樣本亞采樣的序列被聚成817-2031個(gè)OTUs(平均1573個(gè))。對(duì)于18S rRNA基因序列，質(zhì)控后，每個(gè)樣本分別從根際和根樣本中產(chǎn)生4777-29,260和1492-5413條高質(zhì)量序列。根際和根樣品的真菌庫(kù)分別被亞采樣到為4000和1000個(gè)序列。根際樣本亞采樣的序列被聚成704–1084個(gè)OTUs(平均895個(gè))和根樣本亞采樣的序列被聚成192–301個(gè)OTUs(平均263個(gè))?；诤喜⑿蛄械南嗨菩?ANOSIM)初步分析顯示，細(xì)菌和真菌群落的根際和根樣本之間存在顯著差異(P < 0.001); 因此，對(duì)根際和根樣品分別進(jìn)行了序列分析。

統(tǒng)計(jì)分析

Statistical analyses

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS20.0 (IBM，芝加哥，美國(guó))和R進(jìn)行。利用SPSS 20.0軟件采用方差分析和最小顯著性差異分析(LSD)，檢驗(yàn)施氮水平對(duì)土壤有機(jī)碳(SOC)、土壤活性炭(SAC)和根系分泌物的影響是否顯著。使用R中的vegan包進(jìn)行冗余分析和Mantel檢驗(yàn)來確定碳庫(kù)和OTU水平的微生物群落之間的相關(guān)性。使用R中的psych包對(duì)有機(jī)酸與細(xì)菌類群、細(xì)菌類群與真菌類群進(jìn)行Pearson相關(guān)分析。采用Bray-Curtis相異性距離矩陣進(jìn)行相似性（ANOSIM）分析以確定根際和根樣品之間的細(xì)菌和真菌群落的顯著差異。