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LARIAT由響應(yīng)光的CRY2和它的靶蛋白CIB1組成。Opto-vTrap由過表達(dá)載體中兩個分子組成，每個分子包含CMV::CIBN-mCherry-VAMP2(CIBN-VAMP2)和CMV::CRY2PHR-mCitrine(CRY2)(圖1)。

圖1：Opto-vTrap的設(shè)計與原理

在COS-7細(xì)胞中，0.2Hz和20%占空比的藍(lán)色激光照射下，觀察到CIBN-VAMP2和CRY2在5分鐘內(nèi)和整個照明過程中同時聚類，在1~2min內(nèi)快速恢復(fù)，在“刺激斷開”后的15min內(nèi)緩慢恢復(fù)(圖2)。

圖2：COS-7細(xì)胞中Opto-vTrap的表征

在5HZ、40%占空比的488nm藍(lán)光刺激開始30秒后，加入高鉀溶液，其中488nm激光同時激活Opto-vTrap和在全內(nèi)反射熒光(TIRF)成像下可視化NPY-VENUS，發(fā)現(xiàn)Opto-vTrap的光刺激抑制含NPY-VENUS的囊泡的胞外分泌。

另外，通過熒光強(qiáng)度測量每個胞外事件，發(fā)現(xiàn)Opto-vTrap的光刺激消除胞吐過程中的峰值熒光強(qiáng)度，Opto-vTrap有效地阻斷囊泡的胞吐(圖3)。

圖3：Opto-vTrap對Neuroscreen-1細(xì)胞囊泡分泌的光遺傳抑制

構(gòu)建包含CRY2PR-P2A-CIBB-mBIRCH-VAMP2的慢病毒Opto-vTrap載體，并將慢病毒雙側(cè)注射到CA3海馬中。記錄在急性制備的海馬切片中表達(dá)OPTO-VTRAP的CA3錐體神經(jīng)元的膜電位變化后，再測量連續(xù)藍(lán)光刺激CA3區(qū)域時膜電位的變化。

觀察到連續(xù)的藍(lán)光照射10分鐘沒引起任何膜電位變化，表明激活Opto-vTrap不影響膜電位（圖4）。

記錄雙脈沖電刺激Schaffer側(cè)支突觸時，CA1錐體神經(jīng)元誘發(fā)突觸后電流(eEPSCs)，發(fā)現(xiàn)光照對突觸傳遞沒不利影響。與沒有光刺激相比，Opto-vTrap顯示在“光”作用15分鐘后，第一、二次eEPSCs振幅顯著降低。

另外，在CK啟動子下構(gòu)建AAV Opto-vTrap，并在Schaffer側(cè)支突觸上進(jìn)行測試，發(fā)現(xiàn)Opto-vTrap可有效且可逆地抑制腦回路中神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。

即便激活Opto-vTrap，成對脈沖比(PPR)在“亮燈”條件前、期間和之后沒顯著差異。表明Opto-vTrap抑制囊泡釋放可能不會影響突觸前殘余Ca²⁺(圖4)。

構(gòu)建一包含Opto-vTrap, CRY2PHRP2A-CIBB-mCHERRY-VAMP2的慢病毒載體，并將慢病毒注射到新皮層的2/3層，發(fā)現(xiàn)三種NMDAR介導(dǎo)的自發(fā)瞬時內(nèi)電流：神經(jīng)元mEPSC、膠質(zhì)誘導(dǎo)快速電流(gFICs)、膠質(zhì)誘導(dǎo)慢電流(gSICs)。

另外，TFLLR的應(yīng)用沒引起mEPSCs頻率的變化，而在控制條件下，TFLLR導(dǎo)致gFICs和gSICs頻率顯著增加。在注射GFAP::Opto-vTrap的小鼠中，發(fā)現(xiàn)gFICs由囊泡釋放機(jī)制介導(dǎo)，而gSICs由非水泡狀、通道介導(dǎo)的釋放機(jī)制介導(dǎo)。最終表明，Opto-vTrap為快速可逆的光遺傳抑制工具，用于囊泡膠質(zhì)傳遞素的釋放(圖5)。

圖5：激活Opto-vTrap抑制新皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞囊泡膠質(zhì)遞質(zhì)釋放

將CamKIIa::Opto-vTrap慢病毒單側(cè)注入海馬CA3區(qū)，并在CA1區(qū)植入視神經(jīng)套管進(jìn)行照明。術(shù)后3周，每只注射Opto-vTrap的小鼠在第1天進(jìn)行環(huán)境恐懼條件反射。第2天將每只老鼠置于相同的環(huán)境中獲得恐懼記憶。作為沒光照的對照組，每只老鼠在第3天進(jìn)行額外的上下文記憶檢索測試。

發(fā)現(xiàn)通過激活Opto-vTrap可抑制Schaffer側(cè)支通路有效且可逆地?fù)p害恐懼記憶恢復(fù)。表明Opto-vTrap可用于行為動物，通過快速啟動和恢復(fù)時間，在空間、時間和細(xì)胞類型上特異性地抑制大腦回路和行為(圖6)。

圖6：Opto-vTrap的激活可逆地抑制情境恐懼記憶的提取

新開發(fā)的Opto-vTrap可用于光誘導(dǎo)的囊泡釋放、突觸傳遞、膠質(zhì)傳遞和行為的可逆抑制，并在如今成為抑制光基因探針的首選。此外，Opto-vTrap的優(yōu)點(diǎn)是它的快速恢復(fù)時間和它的設(shè)計基于LARIAT，利用CIBN和CRY2相互作用進(jìn)行照明。所以，基于LARAT的Opto-vTrap有望在未來開發(fā)出新的通用和靈活的光遺傳工具。

參考文獻(xiàn)

Won J, Pankratov Y, Jang MW, Kim S, Ju YH, Lee S, Lee SE, Kim A, Park S, Lee CJ, Heo WD. Opto-vTrap, an optogenetic trap for reversible inhibition of vesicular release, synaptic transmission, and behavior. Neuron. 2021 Nov 24:S0896-6273(21)00896-5. doi: 10.1016/j.neuron.2021.11.003. Epub ahead of print. PMID: 34852235.