在體細胞中，外源的雙鏈DNA（如病毒）和細胞自身的雙鏈DNA（如受損的線粒體DNA、微核DNA、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子等）會被cGAS（cyclic GMP-AMP synthase，受體環(huán)鳥苷酸-腺苷酸合成酶）識別【1】。cGAS和DNA結(jié)合后會催化第二信使環(huán)鳥苷酸-腺苷酸（cyclic GMP-AMP dinucleotide， cGAMP）的產(chǎn)生【1,2】，產(chǎn)生的環(huán)鳥苷酸-腺苷酸會結(jié)合和激活干擾素刺激蛋白STING，STING蛋白會招募絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（TBK1），從而來激活IRF3，最終導致I型干擾素和免疫因子的產(chǎn)生。cGAS通路還可以通過轉(zhuǎn)錄激活凋亡調(diào)節(jié)因子，以及IRF3的轉(zhuǎn)錄無關作用，促進細胞凋亡。（圖1，左）
圖1 cGAS 信號通路簡圖
細胞自身染色體DNA位于細胞核內(nèi)，由核膜將其與細胞質(zhì)的cGAS隔離，因此cGAS對核DNA訪問受限。而當細胞進行有絲分裂時，核膜這一動態(tài)屏障會發(fā)生變化，結(jié)果可能導致cGAS募集至染色體上觸發(fā)異常的炎癥轉(zhuǎn)錄反應【3】。最近的研究表明，核定位cGAS對自身DNA的識別活性低于對外源性胞質(zhì)DNA的200倍，盡管核定位cGAS活性明顯減弱，但其仍能誘導樹突狀細胞的先天免疫激活【3】。
紫杉烷類藥物如紫杉醇 Taxol（paclitaxel）可穩(wěn)定微管并干擾有絲分裂，因此常用于癌癥化療。然而人們對微管穩(wěn)定從而產(chǎn)生抗癌效果的原因不得而知。紫杉醇處理后的細胞在有絲分裂過程中會停滯在紡錘體組裝檢查點【4】，隨即走向兩條不同的命運之路，因染色體無法正常分離而退出有絲分裂，或是停滯在有絲分裂時期發(fā)生細胞凋亡。維持cyclin B高于閾值水平會影響染色體分離的時機，而細胞凋亡時機的選擇則取決于細胞內(nèi)“死亡信號”積累到達閾值水平的速度。有絲分裂停滯時發(fā)生的細胞凋亡往往是通過線粒體外膜滲透（ mitochondrial outer membrane permeabilization, MOMP）來實現(xiàn)的。然而，對細胞死亡信號積累和閾值的動力學研究卻知之甚少。
cGAS在應答外源致病性DNA引起的先天免疫反應中發(fā)揮至關重要的作用，但是，當有絲分裂核膜破裂將cGAS暴露于自體染色體時又會造成怎樣的后果呢？（圖1，右）
2019年6月20日，來自美國洛克菲勒大學的Hironori Funabiki和Christian Zierhut教授團隊合作在Cell雜志上發(fā)表了題為 The Cytoplasmic DNA Sensor cGAS Promotes Mitotic Cell Death 的研究長文，揭示了核小體對cGAS比DNA更具親和力，并且會抑制DNA誘導的cGAMP合成。當有絲分裂過程發(fā)生停滯時，依賴于cGAS的IRF3磷酸化會緩慢累積并通過非轉(zhuǎn)錄依賴的機制促進有絲分裂細胞凋亡，通過小鼠異種移植試驗和TCGA數(shù)據(jù)庫分析表明了cGAS在紫杉醇化療中發(fā)揮的促進作用，為腫瘤化療提供了理論支持。
早在2017年，就有研究報道染色質(zhì)可以與cGAS相互作用，但這一生物現(xiàn)象背后的功能含意尚不明確【5】。本研究中，研究人員首先利用35S標記cGAS體外驗證cGAS與染色質(zhì)組分的結(jié)合情況，發(fā)現(xiàn)cGAS在體外與核小體的結(jié)合要明顯強于裸DNA。利用純化組分進行凝膠位移定量分析，進一步證實重組的cGAS與單核小體具有較裸DNA更高的親和力。突變cGAS上的DNA結(jié)合殘基（KRKK mutant）大大降低了cGAS對裸DNA的親和力,但對其結(jié)合核小體的能力無明顯影響，這表明cGAS與DNA和核小體結(jié)合的機制是不同的。
進一步體外結(jié)合實驗發(fā)現(xiàn)cGAS結(jié)合純化的H2A-H2B異質(zhì)二聚體，但是改變H2A-H2B的酸性表面結(jié)構(gòu)（ap*A, ap*KR,通常作為核小體結(jié)合蛋白的靶點）會影響其與丙氨酸或賴氨酸和精氨酸之間的相互作用。核小體可以通過cGAS刺激cGAMP的合成，但與結(jié)合DNA的cGAS相比，與核小體結(jié)合的cGAS其表觀催化速率降低了3倍。當在一定數(shù)量的裸DNA和cGAS混合體系種加入越來越多的核小體時，核小體會競爭性地抑制裸DNA激活cGAS的能力。
與cGAS和核小體的相互作用一致，cGAS會被募集至有絲分裂的染色體上。HeLa細胞中外源表達GFP-cGAS的活細胞實時成像顯示，當核膜破裂后，cGAS會立即與染色體結(jié)合。為了確定染色體結(jié)合的cGAS是否能在有絲分裂過程中激活下游信號，研究人員選擇IRF3-Ser396位點（廣泛使用的cGAS活化指標）對其磷酸化進行監(jiān)測。通過外源表達GFP-IRF3，研究人員發(fā)現(xiàn)在紫杉醇（Taxol）和nocodazole（諾克達唑）誘導的有絲分裂停滯過程中，GFP-IRF3 Ser396位的磷酸化以cGAS依賴的方式緩慢積累。免疫沉淀法富集內(nèi)源性IRF3后，內(nèi)源性IRF3的Ser396，Ser386位點在有絲分裂時也發(fā)生了cGAS依賴的磷酸化。
對有絲分裂停滯不同的時間點IRF3的磷酸化水平進行分析，研究人員認為在正常有絲分裂過程中，與染色體結(jié)合的cGAS可能不會產(chǎn)生任何后果，因為有絲分裂通常在30分鐘內(nèi)完成，而cGAS信號的激活傳遞則需要數(shù)個小時才能發(fā)生。敲減cGAS既不影響細胞存活能力，也不影響有絲分裂的持續(xù)時間。
然而，當細胞有絲分裂發(fā)生停滯時，即使是較低的cGAS活性也可能在功能上產(chǎn)生一定的后果。cGAS蛋白水平在不同的細胞系之間有很大的差異，由于cGAS及其下游效應物STING和IRF3在之前報道了可以促進細胞死亡，研究人員檢測了cGAS是否會影響細胞在染色體分離滑脫和死亡之間命運的抉擇。通過實時成像追蹤單個有絲分裂細胞，監(jiān)測單個細胞的死亡率和有絲分裂的周期。
因為乳腺癌的治療經(jīng)常用到紫杉烷類藥物，研究人員首先對7株乳腺癌細胞系進行分析，其中4株表達cGAS，3株不表達。在4株表達cGAS的細胞株中有3株細胞（HCC1143, MDA-MB-231, BT549）表現(xiàn)出來有絲分裂停滯時IRF3磷酸化的激活，當對細胞進行10nM Taxol（與臨床化療濃度相似）處理時，上述3株陽性細胞系容易在有絲分裂中死亡，而3株表達陰性的細胞株則最終進入間期。當Taxol濃度增加到500 nM時，cGAS陰性細胞株和MDA-MB-231細胞的阻滯時間普遍延長，增加了有絲分裂細胞死亡的機會。然而，陰性細胞株CAL51和T47D仍然更容易發(fā)生染色體分離滑脫。陰性細胞株中有絲分裂細胞死亡的趨勢減少并不是由更快的滑脫引起的，有絲分裂活力在沒有Taxol處理的情況下各細胞間無明顯差異。MDA-MB-231中的cGAS敲除降低了高濃度Taxol治療后的有絲分裂細胞死亡。總之，在許多細胞系中，cGAS的表達與細胞對紫杉醇誘導的有絲分裂停滯過程中死亡的易感性有關。
緊接著，研究人員進行了小鼠異種移植腫瘤模型實驗。實驗結(jié)果表明紫杉醇對WT腫瘤的生長有延遲作用，但對cGAS缺失腫瘤的生長無明顯影響。此外，紫杉醇治療的WT腫瘤表現(xiàn)出了大面積的凋亡情況，表明cGAS促進小鼠異種移植腫瘤模型對紫杉醇的反應。
最后，利用TCGA數(shù)據(jù)庫，研究人員進行了cGAS通路與乳腺癌患者對紫杉烷化療反應之間的相關性分析，根據(jù)腫瘤內(nèi)cGAS、STING和IRF3的RNA水平以及是否使用紫杉烷類藥物治療對患者進行分層。分析結(jié)果表明cGAS信號通過STING傳遞至IRF3對紫杉醇治療的乳腺癌患者具有重要的意義，cGAS通路或有助于紫杉烷類藥物化療的效果。
總的來說，本研究結(jié)果表明在正常細胞有絲分裂過程中，cGAS的激活受到核小體的抑制。然而，在長時間的有絲分裂停滯過程中，低水平的依賴于cGAS的IRF3磷酸化會緩慢累積，緩慢積累的磷酸化的IRF3通過減緩Bcl-xL依賴的抑制線粒體外膜通透性作用刺激細胞凋亡，并且與轉(zhuǎn)錄誘導無關。cGAS和IRF3在腫瘤細胞中的表達使小鼠異種移植模型對抗有絲分裂藥物紫杉醇產(chǎn)生應答，進一步研究cGAS在有絲分裂缺陷反應中的功能有助于我們了解腫瘤的發(fā)展和化療反應，為臨床治療提供有效的幫助。(下圖)
圖2 cGAS促進有絲分裂異常細胞死亡
原文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.05.035
制版人：珂
參考文獻
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3. Gentili, M., Lahaye, X., Nadalin, F., Nader, G.P.F., Puig Lombardi, E., Herve, S., De Silva, N.S., Rookhuizen, D.C., Zueva, E., Goudot, C., et al. (2019). The N-Terminal Domain of cGAS Determines Preferential Association with Centromeric DNA and Innate Immune Activation in the Nucleus. Cell Rep. 26, 2377–2393.
4. London, N., and Biggins, S. (2014). Signalling dynamics in the spindle checkpoint response. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 736–747.
5. Mackenzie, K.J., Carroll, P., Martin, C.-A., Murina, O., Fluteau, A., Simpson, D.J., Olova, N., Sutcliffe, H., Rainger, J.K., Leitch, A., et al. (2017). cGAS surveillance of micronuclei links genome instability to innate immunity. Nature 548, 461–465.
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