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多細(xì)胞生物僅僅由單個細(xì)胞發(fā)育而來的全過程非常令人驚訝。在線蟲中可以使用經(jīng)典的譜系追蹤實驗來研究單細(xì)胞到多細(xì)胞的發(fā)生發(fā)育過程，并從中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞譜系之間的差異以及功能表型方面的不同，但是這些研究結(jié)果也是取決于線蟲本身的發(fā)育過程已經(jīng)研究地非常透徹。更復(fù)雜的生物體的是如何精妙地調(diào)控的身體發(fā)育過程的還很不清楚。

為了進一步揭開哺乳動物早期胚胎發(fā)育過程，加州大學(xué)舊金山分校Jonathan S. Weissman研究組與MIT&Harvard Board研究所的Alexander Meissner研究組在Nature上合作發(fā)文Molecular recording of mammalian embryogenesis，為小鼠原腸胚發(fā)育過程的研究進一步提供了可用的工具。

單細(xì)胞RNA測序技術(shù)應(yīng)用的如火如荼，對于揭開細(xì)胞種類的異質(zhì)性、研究多種動物中的發(fā)育過程提供了重要的工具平臺【1,2】（關(guān)于哺乳動物胚胎發(fā)育過程，BioArt在3月10日曾報道了兩篇背靠背Nature文章，詳見：背靠背Nature長文丨曹俊越博士等利用單細(xì)胞測序揭示胚胎發(fā)育路徑）。最近，以CRISPR-Cas9為基礎(chǔ)的技術(shù)也被用于記錄細(xì)胞譜系發(fā)生【3】。但是這些研究編碼多樣性的產(chǎn)生很少，很大程度上限制了在其他組織和生命體中的應(yīng)用。

那么理想的多細(xì)胞生物中發(fā)育過程的分子記錄器需要具備什么樣的特點呢？1）首先對于細(xì)胞表型方面的影響要降到最低；2）對于數(shù)以萬計的細(xì)胞能夠高通量記錄信息；3）能夠同時分析單細(xì)胞的功能信息；4）可用于記錄大尺度時間線上的變化；5）在整個實驗過程中連續(xù)產(chǎn)生多樣性用于研究。因此，能夠滿足以上要點的技術(shù)需求隨著人們想要進一步揭開生命發(fā)育過程中奧秘而與日俱增。

Weissman與Meissner研究組的工作希望建立一種方法能夠同時記錄細(xì)胞譜系的歷史以及細(xì)胞的狀態(tài)。為了達到該目的，他們使用Cas9產(chǎn)生雙鏈斷裂修復(fù)后造成可遺傳的插入或者缺失突變。他們記錄的是包含3個切割位點以及8堿基對的“整合條碼”（Integration Barcode）205個堿基對的合成DNA。該合成DNA序列被嵌入組成型轉(zhuǎn)錄的熒光蛋白的3‘非翻譯區(qū)，從而能夠通過熒光從轉(zhuǎn)錄組中分析該實驗結(jié)果。另外一個cassette編碼了三個guide RNA，用來記錄多種直接信號（圖1）。此系統(tǒng)能夠產(chǎn)生大量的可遺傳修復(fù)結(jié)果和目標(biāo)位點，并且可以通過整合條碼對這些序列進行區(qū)分。這些guide RNA是他們通過篩選得到的，可以使用GFP報告基因在超過20天的時間對guide RNA靶標(biāo)的活性進行監(jiān)控，從而篩選具有廣泛動態(tài)變化范圍的系列。

圖1 “分子記錄器”優(yōu)化實驗原理。

然后他們將優(yōu)化后的技術(shù)運用在小鼠胚胎早期發(fā)育過程從而研究其中細(xì)胞命運的變化。將多個靶點整合到基因組中之后，他們又將組成型的Cas9-GFP編碼的精子釋放到卵母細(xì)胞之中開始啟動切割。為了證明該技術(shù)的譜系追蹤能力，他們對于胎盤、卵黃囊以及E8.5或者是 E9.5的小鼠胚胎中的靶點進行擴增，并且通過插入缺失標(biāo)記的相似性來研究這三者之間的關(guān)系，從而評估該技術(shù)的實用性。通過該Cas9-GFP為基礎(chǔ)的譜系追蹤技術(shù)，作者們對于7個胚胎中的單細(xì)胞數(shù)據(jù)進行分析后發(fā)現(xiàn)，與細(xì)胞中的插入缺失突變標(biāo)記相似。這些缺失突變標(biāo)記并不會因為轉(zhuǎn)入體內(nèi)而受到影響，因此進一步確認(rèn)了優(yōu)化后的技術(shù)可以用于體內(nèi)追蹤細(xì)胞譜系的變化。

與此同時，作者們使用單細(xì)胞RNA測序技術(shù)對野生型小鼠的原腸胚形成過程中的細(xì)胞狀態(tài)進行研究，發(fā)現(xiàn)引入的剪切并不會影響小鼠的正常發(fā)育過程。隨后作者們利用單細(xì)胞測序結(jié)果系統(tǒng)發(fā)育重建策略對細(xì)胞譜系進行分類，從而確定他們建立的細(xì)胞譜系“追蹤器”是否有效。通過單細(xì)胞測序的結(jié)果建立系統(tǒng)發(fā)育樹后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞譜系發(fā)育距離越近，轉(zhuǎn)錄譜的相似度越高，該結(jié)果與細(xì)胞在發(fā)育過程中逐漸分化成特化的細(xì)胞類型相一致。同時也可以利用單細(xì)胞RNA測序的數(shù)據(jù)來建立一個全面的細(xì)胞命運圖譜。

該研究中使用大量信息和持續(xù)記錄的技術(shù)來展現(xiàn)了哺乳動物原腸胚形成過程細(xì)胞命運譜系示蹤。通過將CRISPR-Cas9技術(shù)與單細(xì)胞RNA測序技術(shù)聯(lián)用并進一步優(yōu)化，揭開了哺乳動物發(fā)育過程中的“黑匣子”難題，為進一步回答更高階的細(xì)胞組織的時空調(diào)控等問題打破了技術(shù)瓶頸。希望在未來能夠在大尺度發(fā)育過程中的細(xì)胞命運決定的分子調(diào)控方面提供可用的工具和可供參考的思路。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41586-019-1184-5

制版人：小嫻子

1. Han, X. et al. Mapping the Mouse Cell Atlas byMicrowell-Seq. Cell 173, 1307,doi:10.1016/j.cell.2018.05.012 (2018).

2. Wagner,D. E. et al. Single-cell mapping ofgene expression landscapes and lineage in the zebrafish embryo. Science 360, 981-987, doi:10.1126/science.aar4362 (2018).

3. Spanjaard,B. et al. Simultaneous lineagetracing and cell-type identification using CRISPR-Cas9-induced genetic scars. Nature biotechnology 36, 469-473, doi:10.1038/nbt.4124(2018).