哺乳動(dòng)物大腦的發(fā)育過程極其復(fù)雜,可能涉及一千多種不同的細(xì)胞類型。對(duì)這個(gè)過程的完整理解需要在大腦發(fā)育的整個(gè)時(shí)間和空間范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行系統(tǒng)表征。因此,在神經(jīng)系統(tǒng)中使用單細(xì)胞RNA測(cè)序和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方式來揭示復(fù)雜組織的分子異質(zhì)性的研究極具優(yōu)勢(shì)。
此前的研究探索了特定大腦區(qū)域、整個(gè)成人大腦甚至整個(gè)胚胎的發(fā)育。此項(xiàng)研究報(bào)告了胚胎期的小鼠大腦在原腸胚形成和出生期間的綜合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜。
研究確定了近 800 種細(xì)胞狀態(tài),這些狀態(tài)描述了大腦功能元素的發(fā)育程序。作者使用原位mRNA測(cè)序,繪制出了關(guān)鍵發(fā)育基因的空間表達(dá)模式。
本文將實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)與單細(xì)胞簇群數(shù)據(jù)相結(jié)合,揭示了神經(jīng)系統(tǒng)模式化過程中神經(jīng)祖細(xì)胞的精確空間組織。
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研究者們使用基于液滴的單細(xì)胞RNA測(cè)序,分析了從胚胎日(E)7到E18之間胚胎期的小鼠大腦。研究發(fā)現(xiàn),在所有的類型細(xì)胞中,細(xì)胞RNA總體含量隨著胚胎年齡增長(zhǎng)而下降,然后在最成熟的神經(jīng)元中再次增加。
與成熟(剪接)RNA 相比,有絲分裂后細(xì)胞表達(dá)出更大比例的新生(未剪接)RNA。剪接體基因則顯示出相反的模式,表明了一種在大腦發(fā)育過程中剪接速率調(diào)節(jié)的通用機(jī)制。
研究員們發(fā)現(xiàn)了798個(gè)細(xì)胞簇群(見圖一)。圖一顯示了細(xì)胞主要按胎齡排列,而其分支們顯示了主要的神經(jīng)上皮譜系。在E7時(shí),細(xì)胞在原腸胚形成過程中分為三個(gè)胚層。
神經(jīng)嵴在E8-E10期間形成并在E10-E16期間分化為形成腦膜的成纖維細(xì)胞譜系。早期的神經(jīng)管在E8形成,然后成熟為增殖的放射狀膠質(zhì)細(xì)胞,這也是所有神經(jīng)細(xì)胞的前體。
圖一:t分布隨機(jī)鄰域嵌入(t-SNE)(中心)顯示來自215個(gè)胚胎的93個(gè)合并樣本的292,495個(gè)細(xì)胞,按主要類別著色。從左上角順時(shí)針方向開始,四個(gè)角插圖顯示解剖區(qū)域、標(biāo)記基因表達(dá)、細(xì)胞周期評(píng)分和年齡(細(xì)胞及其25個(gè)最近鄰細(xì)胞的平均孕齡)。
兩大類神經(jīng)元從神經(jīng)管分支出來,一類包含前腦興奮性神經(jīng)元,另一類包含所有其他神經(jīng)元類型。前腦興奮性神經(jīng)元的清晰分離與先前在成年小鼠大腦中的發(fā)現(xiàn)一致,表明這些細(xì)胞類型具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄和功能特化特質(zhì)。
大約在E14之后,放射狀膠質(zhì)細(xì)胞逐漸失去增殖能力并轉(zhuǎn)變?yōu)槟z質(zhì)母細(xì)胞狀態(tài),最終產(chǎn)生星形膠質(zhì)細(xì)胞、室管膜和寡突膠質(zhì)前體細(xì)胞。這些主要細(xì)胞的出現(xiàn),揭示了哺乳動(dòng)物大腦協(xié)調(diào)時(shí)間發(fā)展的秘密。
在原腸胚形成期間,神經(jīng)板的前后軸是由外在信號(hào)建立的。相比之下,神經(jīng)胚形成后的大腦形態(tài),是由稱為次級(jí)組織者的專門神經(jīng)祖細(xì)胞發(fā)出的內(nèi)在信號(hào)精心策劃的。
研究人員通過已知的形態(tài)因子確定了E9-E11放射狀膠質(zhì)細(xì)胞樣簇中的次級(jí)組織者(圖二ad)。組織者亞型會(huì)表達(dá)大量不同的轉(zhuǎn)錄因子、分泌配體和表面受體,這些結(jié)果建立了豐富的二級(jí)組織者庫(kù)。這些組織者進(jìn)而分泌不同形態(tài)因子的組合,這些組合在特定的區(qū)域起作用,從而開啟了不同區(qū)域神經(jīng)元的命運(yùn)。
圖二:a,神經(jīng)管中次級(jí)組織者的示意圖。顏色通過腹側(cè)化(黃色)、背側(cè)化(紫色)和邊界誘導(dǎo)(青色)活動(dòng)對(duì)早期組織者進(jìn)行分組。晚期的組織者是紫紅色的。b,在全局t-SNE(圖一)上著色的組織者相關(guān)簇的細(xì)胞 。c,蜂群圖顯示已知定義組織者的形態(tài)因子的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換UMI計(jì)數(shù)。d, 組織者相關(guān)放射狀膠質(zhì)細(xì)胞的均勻流形近似和投影嵌入。微型圖按組織者和地區(qū)著色。
簇狀樹狀圖的一個(gè)獨(dú)特分支包括膠質(zhì)細(xì)胞和相關(guān)的祖細(xì)胞(圖三a),它揭示了兩個(gè)主要團(tuán)體:表達(dá)神經(jīng)源性標(biāo)記物的細(xì)胞和表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)標(biāo)記物(圖三b、c)。鑒于它們可能致力于膠質(zhì)細(xì)胞的生成,我們將后者稱為膠質(zhì)母細(xì)胞。
研究發(fā)現(xiàn)兩組之間有超過7,000個(gè)基因差異表達(dá),并且膠質(zhì)母細(xì)胞優(yōu)先表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞和寡突膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的基因(圖三d)。在前腦、中腦和后腦中,作者發(fā)現(xiàn)其中起源性的胚胎非端腦膠質(zhì)母細(xì)胞和寡突細(xì)胞前體,與端腦膠質(zhì)母細(xì)胞具有差異性(圖三a)。
這些觀察結(jié)果表明區(qū)域化的喪失,這一表現(xiàn)在寡突膠質(zhì)細(xì)胞譜系中更加明顯。進(jìn)一步的研究表明,E12和E16之間發(fā)生了神經(jīng)元到膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變(圖三e)。
最早的星形膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)在大約E15。巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞從胚外卵黃囊發(fā)育并在E9.5之前侵入大腦。作者早在E8就觀察到增殖的巨噬細(xì)胞并持續(xù)到E14,進(jìn)而逐漸被小膠質(zhì)細(xì)胞和血管周圍巨噬細(xì)胞取代(圖三h,i)。
圖三:a,代表放射狀膠質(zhì)細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞的簇狀圖。簇狀圖被切成15個(gè)元簇,標(biāo)注在t-SNE上。b,由神經(jīng)前體Neurog2和Dlx2表達(dá)的總和著色的細(xì)胞。c,由Tnc和Egfr表達(dá)總和著色的細(xì)胞。d,按星形膠質(zhì)細(xì)胞(頂部)或少突細(xì)胞前體(底部)分?jǐn)?shù)著色的細(xì)胞。e,來自指定孕齡的細(xì)胞在每個(gè)t-SNE圖上都被著色。f,包含成纖維細(xì)胞的樹狀圖進(jìn)化枝中的簇。顏色表示Mkx、Col15a1和Slc22a2的表達(dá)。g,按胎齡著色的細(xì)胞。h,包含免疫細(xì)胞的簇狀圖。i,按胎齡著色的細(xì)胞。
發(fā)育過程中的大腦在不同空間域中會(huì)表現(xiàn)出具有特征的轉(zhuǎn)錄因子。隨著時(shí)間的推移,這些空間隨著可擴(kuò)散的形態(tài)因子和細(xì)胞-細(xì)胞接觸的區(qū)域相互作用來進(jìn)行表達(dá)。
在將這一復(fù)雜過程與轉(zhuǎn)錄細(xì)胞狀態(tài)聯(lián)系起來的過程中,我們對(duì)E10.5(圖四a,b)小鼠胚胎的24個(gè)矢狀切面進(jìn)行了119個(gè)基因的原位雜交測(cè)序(圖二c)。我們通過單細(xì)胞 RNA 測(cè)序鑒定出的底板、頂板和邊界組織者(圖二),它們?cè)诳臻g上處于隔離狀態(tài)并表達(dá)不同的分泌配體和受體組(圖四f)。
觀察表明,即使是出生在相鄰空間域中的祖細(xì)胞也會(huì)受到幾種不同的環(huán)境線索的影響。
圖四:a,原位測(cè)序?qū)嶒?yàn)概述,包括119個(gè)基因和24個(gè)冷凍切片;執(zhí)行了兩次,結(jié)果相似。b,顯示單個(gè)切片上五個(gè)基因的原始表達(dá)數(shù)據(jù)的示例。c,d,手動(dòng)注釋的解剖區(qū)域(c)和推斷的分布(d)。206和347在與b相同的部分。e,估算的Prdm12和Six1表達(dá)。f,腹側(cè)(橙色)和邊界(藍(lán)色)組織者的推斷空間分布。g,位于發(fā)育中的眼睛、耳朵和鼻子。特寫圖像顯示相鄰部分的空間分布。
大腦發(fā)育的核心問題之一涉及到神經(jīng)元多樣性的起源。研究發(fā)現(xiàn)放射狀膠質(zhì)細(xì)胞在空間和轉(zhuǎn)錄上是多樣的(圖二、四),并且分泌出更多種類的可擴(kuò)散形態(tài)因子,從而提供精確的局部線索來指定神經(jīng)元細(xì)胞類型。
同時(shí),研究觀察到87個(gè)放射狀膠質(zhì)細(xì)胞亞型,但只有171個(gè)神經(jīng)母細(xì)胞和306個(gè)神經(jīng)元亞型。從放射狀膠質(zhì)細(xì)胞到成神經(jīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變以幾個(gè)突然的變化為標(biāo)志:細(xì)胞周期退出,剪接活性突然增加和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)所特有且穩(wěn)定不變的模塊。
這些觀察支持了一個(gè)模型——神經(jīng)祖細(xì)胞廣泛地由次級(jí)組織者構(gòu)成,但大多數(shù)神經(jīng)元的多樣性是在有絲分裂后的神經(jīng)母細(xì)胞和成熟神經(jīng)元中產(chǎn)生的。本研究的圖譜概述了胎兒期大腦轉(zhuǎn)錄組的多樣性,這是研究哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的重要部分。
研究中得出的關(guān)于時(shí)間、譜系和區(qū)域特異性基因表達(dá)的豐富信息,可以在今后為基因靶向、理解神經(jīng)發(fā)育障礙和腦癌相關(guān)的基因等研究提供強(qiáng)大的支持。
原文鏈接:
https://doi.org/10.1038/s41586-021-03775-x
La Manno, G., Siletti, K., Furlan, A. et al. Molecular architecture of the developing mouse brain. Nature 596, 92–96 (2021).
https://doi.org/10.1038/s41586-021-03775-x
編譯作者:Ayden(brainnews創(chuàng)作團(tuán)隊(duì))
校審:Simon(brainnews編輯部)
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