論文：HuD Binds to and Regulates Circular RNAs Derived From Neuronal Development- and Synaptic Plasticity-Associated Genes（HUD結合和調控來自神經元發(fā)育和突觸可塑性相關基因的環(huán)狀RNAs）
摘要
RNA結合蛋白(RBP)HUD參與神經元的分化、再生、突觸可塑性和學習記憶.RBPs不僅與mRNAs結合，而且還與多種RNA相互作用，包括環(huán)狀RNA(CircRNAs)，一類由預mRNA反向剪接產生的非編碼RNA。
本研究探討HUD是否能調節(jié)神經元圓環(huán)RNA的表達。HUD通過與腺苷酸-UridyateRichElement(ARES)結合來控制靶RNA的命運.通過生物信息學分析，我們發(fā)現在約26%的腦表達轉錄因子中存在HUD結合基序.通過小鼠紋狀體RNA免疫共沉淀(RIP)和圓環(huán)RNA陣列，我們鑒定了600多個與HUD結合的圓環(huán)RNA。
在這些基因中，226條來自hud還與其相關的mRNAs結合的基因，包括圓環(huán)，這是我們以前描述的突觸HUD靶基因crcRNA。HUD與另外兩個可塑性相關的圓環(huán)RNA的結合，圓克里布1，和圓環(huán)Ufp 2，用圓環(huán)RNA特異性qRT-PCR進行驗證。
有趣的是，我們發(fā)現環(huán)Upf 2也在突觸體中富集。通路分析證實，大多數HUD結合的圓環(huán)RNA來源于調控神經系統(tǒng)發(fā)育和功能的基因。利用HUD高表達(HUD-OE)小鼠和敲除(KO)小鼠的紋狀體組織進行crcRNA表達分析，鑒定出86株HUD調控的cRNA。
這些基因來源于與HUD RIP相同的生物通路中的基因。對HUD調控和HUD結合的cRNA進行相關分析，發(fā)現在HUD-OE或HUD-KO中分別有69條和5條。這些包括圓Brwd 1, 圓周Foxp 1，和CircMap1a來源于神經元發(fā)育和再生的基因，以及環(huán)Magi 1和圓環(huán)Lppr4，起源于控制突觸形成的基因，并與精神疾病有關。
這些圓環(huán)RNA形成相互競爭的內源性RNA(CerNA)網絡，包括microRNAs和mRNAs。在HUD靶基因中，圓Brwd 1和圓周Foxp 1是以與其各自的mRNAs相反的方式調控的。其他與發(fā)育和可塑性相關的hud靶基因的表達，如CircSatb 2，CirHmer1a和環(huán)Ntrk 3在可卡因條件性位置偏愛(CPP)建立后也發(fā)生了改變。
綜上所述，這些數據表明HUD與圓環(huán)RNA的相互作用調節(jié)了它們的表達和轉運，由此產生的HUD調控的CerNA網絡的改變可以控制神經元的分化和突觸可塑性。
HUD與調控神經系統(tǒng)發(fā)育和功能的基因ccRNA結合
HUD結合模體在小鼠腦圓環(huán)RNA中的高頻率表達。
(A)38.7%的MMU_CircRNA在大腦中表達，其中31%在中腦，48.57%在前腦，20.44%在后腦。
(B)小鼠圓環(huán)RNA的生物信息學分析顯示ARE序列的分布。對來自圓環(huán)堿基的完整注釋的MMU_cRNA序列進行了分析，發(fā)現有33%的序列具有HUD一致結合基序和其他基序。這組圓環(huán)RNA的餅圖顯示，每個基序中含有29.11%的HUD特異基序(14.20%motif 1；8.58%motif 2，6.33%motif 3)。
(C)火山圖表示HUD RIP與WT控件(粉紅色矩形)中圓環(huán)RNA的差異富集。HUD免疫共沉淀后獲得的RNA按“材料和方法”一節(jié)所述進行圓環(huán)RNA陣列分析。垂直線分別對應上下1.5倍的變化，而水平線代表一個p-價值0.05，n每個IP=3(HUD-OE、WT和IgG)，每組3只小鼠，用三種不同的RIP方法進行組織分析。紅色數據點代表差異表達的圓環(huán)RNA。
HUD在體內與CircUpf 2和CircCreb 1結合。
(A)HUD與來自Upf 2和Creb 1基因的圓環(huán)RNA之間的相互作用被HUD RIP和WT對照RIP所證實，然后再用圓環(huán)RNA特異性的qRT-PCR檢測。值表示為折疊變化與IgG對照。以MMU_CIRC_cis-R7為陰性對照。數據采用單因素方差分析，隨后采用鄧恩多重比較檢驗，表示為均值±掃描電鏡；*p < 0.05, n = 3.
(B)用RNase R對crcRNAs的特異性擴增進行驗證，用RNase R對所有線性RNA進行預處理，隨機引物與寡突T對寡突T擴增crcRNAs和mRNAs。n = 3.
(C)從小鼠紋狀體突觸體提取液中提取的總RNA按“材料和方法”部分所述進行加工，并對crcUpf 2和CircCreb 1進行qrt-PCR。值標準化為GAPDH mRNA水平，表達為折疊變化與WT對照；S1、S2和突觸體分數(SYN)之間的BC1 RNA水平差異用于驗證突觸小體(SYN)的純化，如前面所述(Rao和Steward，1991年)。學生數據分析t-測試(CircUpf 2和CircCreb 1)和單向方差分析(BC1)。值表示平均值±掃描電鏡；*p < 0.05, n = 3.
UD靶基因表達途徑及功能分析。RIP鑒定的HUD相互作用圓環(huán)RNA的獨創(chuàng)性途徑分析。
(A)與HUD結合基因相關的頂級分子功能。
(B)頂級疾病和功能。
(c、D)具有代表性的網絡，包括編碼谷氨酸能傳遞蛋白的基因的圓環(huán)RNA。
(C)和表觀遺傳調節(jié)劑(D).
討論
物質使用障礙(SUDS)中的強迫性藥物尋求行為被認為是由藥物在反復暴露后誘發(fā)分子、細胞和電路水平的適應性失調所介導的。包括HUD在內的幾個RBP與成癮相關的途徑相關。HUD本身被列在與成癮相關的基因知識庫(KARG)中，進一步表明它在吸毒成癮中的作用。
此外，在可卡因CPP過程中，HUD及其靶mRNA不僅在NAC中增加，而且HUD-OE小鼠與野生型小白蟻相比，可卡因CPP增加。使用可卡因CPP后，我們發(fā)現調控上下文調節(jié)、認知、學習和記憶的基因的圓環(huán)RNA發(fā)生了顯著的變化。
其中包括RIP鑒定的幾個HUD靶基因，以及一些預測的目標。其中之一是圓衛(wèi)星2，該基因來源于與染色質可達性調節(jié)因子sabb 2相同的基因，該基因參與海馬依賴的長期記憶和可卡因調節(jié)。另一個在CPP期間改變水平的HUD靶基因圓環(huán)RNA是圓環(huán)，這與海馬的穩(wěn)態(tài)可塑性有關。
這種圓環(huán)RNA來源于編碼Hmer 1的基因，這是一種與谷氨酸能突觸相關的蛋白，與藥物成癮有關。突觸可塑性是網絡動力學變化的基礎，被認為是學習和記憶的基礎。因此，cpp后水平顯著升高或下降的頂端基因參與神經元遷移、突起和樹枝狀突起的生長和分支，這也就不足為奇了。
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