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可變剪接提供了一種對(duì)神經(jīng)元特異基因表達(dá)十分重要的機(jī)制。一些在神經(jīng)元細(xì)胞中廣泛表達(dá)的RNA結(jié)合蛋白與控制發(fā)育調(diào)控且神經(jīng)元特異的可變剪接程序有關(guān)，單一蛋白能夠調(diào)控許多靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄本。然而，一些RNA結(jié)合蛋白都是在神經(jīng)元集群中選擇性表達(dá)，增加了其可能控制細(xì)胞類(lèi)型特異和突觸特異的功能的可能性。KH結(jié)構(gòu)域RNA結(jié)合蛋白SLM2就是這樣一個(gè)在小鼠海馬體的谷氨酸能錐體細(xì)胞和一些特定的釋放γ-氨基丁酸（GABA）的中間神經(jīng)元中高表達(dá)的RBP。

SLM2對(duì)小鼠海馬體中的谷氨酸能突觸的功能特性至關(guān)重要。基因組范圍內(nèi)的比對(duì)揭示具有明顯選擇性的SLM2依賴(lài)的剪接程序主要由少量編碼突觸蛋白的靶標(biāo)mRNA組成。在Slm2敲除的小鼠海馬體中雜合缺失Nrxn1的21號(hào)外顯子能夠恢復(fù)突觸表型，挽回突觸可塑性和行為缺陷。因此，SLM2對(duì)單一可變外顯子的調(diào)控對(duì)谷氨酸能突觸的功能和可塑性的規(guī)范及小鼠行為具有重要作用。

首先通過(guò)免疫組化和western blot對(duì)野生型和Slm2敲除小鼠的海馬體組織進(jìn)行突觸結(jié)構(gòu)和組分分析，再通過(guò)電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)突觸的谷氨酸能傳導(dǎo)和可塑性。通過(guò)對(duì)兩種小鼠的海馬體組織進(jìn)行RNA-seq獲得了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，經(jīng)可變剪接分析得到了受SLM2調(diào)控的基因及可變剪接事件。推測(cè)SLM2調(diào)控的Nrxn1的21號(hào)外顯子可變剪接與該軸突蛋白和配體的互作有關(guān)，并通過(guò)免疫共沉淀初步證實(shí)。進(jìn)一步假設(shè)Slm2敲除小鼠中喪失與這些軸突蛋白配體的跨突觸互作，可能導(dǎo)致突觸后谷氨酸受體缺陷，通過(guò)在Slm2敲除小鼠中雜合去除一個(gè)Nrxn1Δex21等位基因，進(jìn)一步證實(shí)該推論。

（1）

Slm2敲除小鼠中的突觸結(jié)構(gòu)和突觸組成。在Slm2敲除的小鼠中，能在海馬體CA1神經(jīng)元的初級(jí)頂樹(shù)突上形成正常數(shù)量的谷氨酸能棘突觸（圖1A和B）。WB分析來(lái)自野生型和Slm2敲除小鼠海馬體的突觸體組分，發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出整體正常的谷氨酸能突觸蛋白濃度。然而，AMPA型谷氨酸受體（AMPAR）亞基GluA1增多，尤其是在來(lái)自成熟的Slm2敲除小鼠突觸體的洗滌劑可溶組分中（圖1和D）。在來(lái)自未成年小鼠的急性切片中，GluA1數(shù)量在全細(xì)胞裂解液和細(xì)胞表面組分中都升高，而N-甲基-D-天冬氨酸受體GluN1亞基的表達(dá)沒(méi)有變化（圖1 E和F）。

 圖1.

（2）

SLM2是正常谷氨酸能傳導(dǎo)和可塑性所必需的。野生型與Slm2敲除小鼠海馬體的CA1神經(jīng)元切片中微小興奮性突觸后電流（mEPSC）振幅和頻率沒(méi)有差別（圖2A和B），但后者中mEPSC事件的上升速度和衰減時(shí)間表現(xiàn)出微小的增加（圖2C和D）。在Slm2敲除的小鼠中，AMPA受體和NMDA受體介導(dǎo)的興奮性突觸后電流比率（AMPAR/NMDAR）顯著升高（圖2E和F）。與野生型相比，在Slm2敲除的CA1神經(jīng)元中，刺激謝弗側(cè)支引起了更大的突觸后反應(yīng)（圖2G），而雙脈沖易化正常（圖2H）。證實(shí)Slm2敲除小鼠CA1神經(jīng)元中突觸后AMPA受體表面表達(dá)及功能的提升。

 圖2.

（3)

SLM2依賴(lài)的可變剪接程序的基因組范圍比對(duì)。在全基因組范圍內(nèi)對(duì)SLM2依賴(lài)的可變剪接事件進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)不同基因型之間轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)高度相關(guān)，表明SLM2不在調(diào)控整體的轉(zhuǎn)錄本水平中發(fā)揮主要功能（圖3A）。野生型和Slm2敲除的小鼠海馬體中絕大多數(shù)外顯子基本保持不變（圖3B），但有四個(gè)基因的可變外顯子在敲除小鼠中表現(xiàn)出了不同程度的異常調(diào)控。編碼突觸細(xì)胞表面受體的三個(gè)軸突蛋白基因（Nrxn1，2和3）的可變剪接片段4（AS4）中的外顯子水平增加了2倍以上，而囊泡融合機(jī)制的一個(gè)組分tomosyn-2（Stxbp5l）的24號(hào)外顯子水平提高了1.58倍。另外7個(gè)外顯子盡管變化倍數(shù)不高，仍然表現(xiàn)出顯著變化（P<>

 圖3.

(4)

在Slm2敲除的海馬體中Nrxn1的21號(hào)外顯子雜合缺失恢復(fù)了突觸表型。發(fā)生在Nrxn AS4上的可變剪接，調(diào)控突觸前末梢軸突蛋白的選擇性跨突觸互作。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)21個(gè)受其調(diào)控的候選互作蛋白，六個(gè)顯著差異蛋白中包括神經(jīng)連接蛋白，Chadl，LRRTMs和補(bǔ)體C3（圖4B）。

假設(shè)Slm2敲除的小鼠海馬體中Nrxn的可變剪接可能會(huì)擾亂其與這些剪接插入敏感配體之間的互作。對(duì)其進(jìn)行免疫共沉淀分析，在野生型小鼠的沉淀中發(fā)現(xiàn)大量神經(jīng)連接蛋白1（NL1）和3（NL3），它們都在Slm2敲除小鼠的沉淀中減少（圖4C），而補(bǔ)體C3的共沉淀則輕微上升，證實(shí)SLM2的喪失確實(shí)轉(zhuǎn)換了突觸受體-配體互作關(guān)系。在Slm2敲除小鼠中喪失與這些軸突蛋白配體的跨突觸互作，可能導(dǎo)致突觸后谷氨酸受體缺陷。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，在Slm2敲除小鼠中雜合去除一個(gè)Nrxn1Δex21等位基因，恢復(fù)了正常Nrxn1 AS4(-)轉(zhuǎn)錄本水平（圖4D），從而挽救了內(nèi)源軸突蛋白與NL1和NL3的跨突觸細(xì)胞表面互作（圖4E），并使急性海馬體切片中GluA1量正?；▓D4F），部分恢復(fù)了短陣快速脈沖誘導(dǎo)的謝弗側(cè)支LTP（圖4G），且挽救了小鼠的行為變化（圖4H和I）。因此，SLM2對(duì)單一可變外顯子的調(diào)控對(duì)谷氨酸能突觸功能的特化，可塑性，和小鼠行為具有重要貢獻(xiàn)。

 圖4.

與其他RNA結(jié)合蛋白相比，SLM2表現(xiàn)出高度選擇性的神經(jīng)細(xì)胞類(lèi)型特異的表達(dá)，且僅有一小部分可變的外顯子特異的依賴(lài)其功能?；蛘葘?shí)驗(yàn)證實(shí)單一可變外顯子的恢復(fù)對(duì)SLM2敲除小鼠的表型具有重要影響。猜測(cè)這里報(bào)道的針對(duì)SLM2-軸突蛋白系統(tǒng)的表面受體識(shí)別系統(tǒng)的定向，細(xì)胞類(lèi)型特異性的剪接調(diào)控，代表了神經(jīng)回路中一種調(diào)控突觸特化的通用機(jī)制。

Traunmüller, L., A. M. Gomez, T. M. Nguyen and P. Scheiffele (2016). 'Control of neuronal synapse specification by a highly dedicated alternative splicing program.' Science 352(6288).