警告: 有毒物接觸皮膚或者不慎吞服。會(huì)導(dǎo)致灼傷。一旦接觸皮膚后立即以大量的洗滌劑和清水清洗。若感不適，看醫(yī)生并尋求苯酚和其他成分(JTSRN 80100437-5000p)的正確治療方案。） TRIZOL在室溫下能穩(wěn)定保存12個(gè)月。盡管如此，為達(dá)到最佳效果，我們建議保存在2—8°C的環(huán)境下。
一般描述：
TRIZOL試劑是直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細(xì)胞時(shí)能保持RNA的完整性。加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機(jī)層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后，RNA可以通過(guò)異丙醇沉淀來(lái)還原。在除去水樣層后，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA，在有機(jī)層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。共純化DNA對(duì)于樣品間標(biāo)準(zhǔn)化RNA的產(chǎn)量十分有用。
論是人、動(dòng)物、植物還是細(xì)菌組織，該方法對(duì)少量的組織(50-100 mg)和細(xì)胞(5×106)以及大量的組織(≥1 g)和細(xì)胞(>107)均有較好的分離效果。TRIZOL試劑操作上的簡(jiǎn)單性允許同時(shí)處理多個(gè)的樣品。所有的操作可以在一小時(shí)內(nèi)完成。TRIZOL抽提的總RNA能夠避免DNA和蛋白的污染。故而能夠作RNA 印跡分析、斑點(diǎn)雜交、poly(A)+ 選擇、體外翻譯、RNA酶保護(hù)分析和分子克隆。如果是用于PCR，當(dāng)兩條引物位于單一外顯子內(nèi)時(shí)，建議用級(jí)聯(lián)擴(kuò)大的DNase I(Cat. No. 18068)來(lái)處理抽提的總RNA。
RIZOL試劑能促進(jìn)不同種屬不同分子量大小的多種RNA的析出。例如，從大鼠肝臟抽提的RNA瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙啶染色，可見(jiàn)許多介于7 kb和15 kb之間不連續(xù)的高分子量條帶，（mRNA和hnRNA成分）兩條優(yōu)勢(shì)核糖體RNA條帶位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S)，低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之間 (tRNA, 5S)。當(dāng)抽提的RNA用TE稀釋時(shí)其A260/A280比值≥1.8
預(yù)防RNA酶污染:
提RNA過(guò)程中任一環(huán)節(jié)的不正確操作都可能導(dǎo)致RNA酶的污染。由于RNA酶的活性很難完全抑制，預(yù)防其污染是十分必要的。
在實(shí)際的操作中應(yīng)遵循以下指南：
* 全程佩戴一次性手套。皮膚經(jīng)常帶有細(xì)菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成為RNA酶的來(lái)源。培養(yǎng)良好的微生物實(shí)驗(yàn)操作習(xí)慣預(yù)防微生物污染。
* 使用滅菌的，一次性的塑料器皿和自動(dòng)吸管抽提RNA，避免使用公共儀器所導(dǎo)致的RNA酶交叉污染。例如，使用RNA探針的實(shí)驗(yàn)室可能用RNA酶A 或 T1來(lái)降低濾紙上的背景，因而某些非一次性的物品（如自動(dòng)吸管）可能富含RNA酶。
* 在TRIZOL中，RNA是隔離在RNA酶污染之外的。而對(duì)樣品的后續(xù)操作會(huì)要求用無(wú)RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小時(shí)。塑料器皿可以在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘，用水徹底漂洗干凈后高壓滅菌備用。其他注意事項(xiàng)
* 當(dāng)TRIZOL用量少于2-ml時(shí)建議使用清潔的一次性的聚丙材質(zhì)試管。
* 當(dāng)TRIZOL用量較大時(shí)，可以使用玻璃試管(Corex)或聚丙材質(zhì)試管，事先檢驗(yàn)以確保該試管可以耐受加入TRIZOL和氯仿后12,000×g的離心力。不可使用有裂縫或者破損的試管。
* 離心前小心平衡試管。
* 離心前玻璃管口必須蓋上鋁箔并用石蠟?zāi)し饪冢郾┕鼙仨毶w緊。
RNA抽提指南
注意：用TRIZOL抽提RNA時(shí)要戴手套和護(hù)眼罩。避免接觸皮膚和衣服。在化學(xué)通風(fēng)櫥完成操作。避免呼吸道吸入。
如無(wú)例外，所有的操作應(yīng)該在15 -30°C的條件下完成，試劑亦在15 -30°C的條件下。
實(shí)驗(yàn)所需但試劑未提供的物品：
* 氯仿 *異丙醇
* 75%乙醇(用DEPC處理過(guò)的水配制)
*無(wú)RNA酶的水或0.5% SDS溶液［配無(wú)RNA酶的水，將水加入無(wú)RNA酶的玻璃瓶中，加入DEPC至0.01% (v/v)。放置過(guò)夜并高壓滅菌。SDS溶液必須用DEPC處理過(guò)并經(jīng)高壓滅菌的水配制。］
1.勻漿化作用(見(jiàn)注意事項(xiàng)1-3)
a. 組織 用glass-Teflon蚯苛υ冉(Polytron, 或 Tekmar's TISSUMIZER 或equivalent)攪勻組織樣品，每50—100 mg組織加1ml的TRIZOL。勻漿化時(shí)組織樣品容積不能超過(guò)TRIZOL容積的10%。
b.單層生長(zhǎng)的細(xì)胞 直接往直徑3.5 cm的培養(yǎng)板中加入1ml的TRIZOL溶解細(xì)胞，通過(guò)移液管分次移出細(xì)胞裂解物。依據(jù)培養(yǎng)板的面積而不是依據(jù)細(xì)胞的數(shù)量來(lái)決定所需的TRIZOL量（每10 cm2加1 ml）。當(dāng)TRIZOL量不足時(shí)可導(dǎo)致抽提的RNA中污染有DNA。
c.懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞通過(guò)離心來(lái)沉淀細(xì)胞。在TRIZOL試劑中用移液管反復(fù)吹打來(lái)裂解細(xì)胞。每5—10×106的動(dòng)物細(xì)胞，植物或酵母菌細(xì)胞或每1×107 細(xì)菌加1ml的TRIZOL。在加入TRIZOL前應(yīng)避免洗滌細(xì)胞因?yàn)槟菢訒?huì)增加mRNA降解的可能性。破裂某些酵母菌和細(xì)菌可能需要使用勻漿器。
可選方案：
當(dāng)樣品富含蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或是細(xì)胞外物質(zhì)例如肌肉，脂肪組織和植物的塊莖部分時(shí)可能需要一額外的分離步驟。勻漿化后在2—8°C的條件下以12,000×g的離心力離心10分鐘，移除勻漿中不溶解的物質(zhì)，余下的沉淀中包含有細(xì)胞外膜，多糖，以及高分子量DNA，而上層的超浮游物含有RNA。在來(lái)自于脂肪組織的樣品中，大量的脂肪漂在最上層因而應(yīng)該除掉。在每一個(gè)個(gè)案中，將清亮的勻漿溶液轉(zhuǎn)移到一干凈的試管中加入氯仿并繼續(xù)進(jìn)行下述的分離步驟。
2. 分離階段將勻漿樣品在15—30°C條件下孵育5分鐘以使核蛋白體完全分解。每1 ml TRIZOL加0.2 ml氯仿。蓋緊樣品管蓋，用手用力搖晃試管15秒并將其在30°C下孵育2—3分鐘。在2—8°C下以不超過(guò)12,000×g的離心力高速冷凍離心15分鐘。離心后混合物分成三層：下層紅色的苯酚-氯仿層，中間層，上層無(wú)色的水樣層。RNA無(wú)一例外地存在于水樣層當(dāng)中。水樣層的容量大約為所加TRIZOL容量的60%。
3. RNA的沉淀將水樣層轉(zhuǎn)移到一干凈的試管中，如果希望分離DNA和蛋白，有機(jī)層同樣要予以保留。通過(guò)將水樣層和異丙醇混合來(lái)沉淀RNA。最初均化時(shí)的每1 ml TRIZOL對(duì)應(yīng)0.5 ml異丙醇。將混合的樣品在15—30°C條件下孵育10分鐘并在2—8°C下以不超過(guò)12,000×g的離心力高速冷凍離心10分鐘。RNA沉淀在離心前通常不可見(jiàn)，形成一膠狀片狀沉淀附著于試管壁和管底。
4 .RNA的洗脫 移去上層懸液。用75%的乙醇洗滌RNA沉淀一次，每1 ml的 TRIZOL至少加1 ml的75%乙醇。旋渦振蕩混合樣品并在2—8°C下以不超過(guò)7,500×g的離心力高速冷凍離心5分鐘。
5. RNA的再溶解在操作的最后，簡(jiǎn)單干燥RNA沉淀（空氣干燥或真空干燥5—10分鐘）不要在真空管里離心干燥RNA。尤為重要的是，不能讓RNA沉淀完全干燥那樣會(huì)極大地降低它的可溶性。部分溶解的RNA樣品其A260/280比值< 1.6。用移液管尖分幾次移取無(wú)RNA酶的水或0.5% SDS溶液來(lái)溶解RNA，并在55—60°C下孵育10分鐘（當(dāng)RNA以后要用于酶切反應(yīng)時(shí)，避免使用SDS。）RNA還能被100%甲酰胺（除去離子）再溶解并保存在–70°C。
RNA抽提注意事項(xiàng)：
1.從少量的組織(1—10 mg)或細(xì)胞(102—104)中分離RNA 樣品：往組織或細(xì)胞中加入800 祃 TRIZOL。待樣品裂解后，加入氯仿并進(jìn)行步驟2中的抽提操作。在用異丙醇沉淀RNA之前，加入5—10μg無(wú)RNA酶的脂質(zhì)體(Cat.No 10814)作為水樣層的載體。為降低其黏度在加入氯仿前用26號(hào)注射器抽吸兩次以切斷基因組DNA。脂質(zhì)體會(huì)留在水樣層中并和RNA共析出。在濃縮到4 mg/ml之前它不會(huì)抑制第一絲狀體的合成也不會(huì)抑制PCR。
2.在勻化后和加入氯仿之前，樣品可以在–60—–70°C保存至少一個(gè)月。RNA沉淀（步驟4，RNA洗脫）溶于75%的乙醇在2—8°C至少可以保存一周，在–5—–20°C下至少可保存一年。
3.臺(tái)式離心機(jī)最大能達(dá)到2,600×g的離心力，如果將離心時(shí)間延長(zhǎng)到30-60分鐘可以滿足步驟2和步驟3中的操作。
疑難解答：
RNA抽提
每1 mg組織或1×106培養(yǎng)細(xì)胞預(yù)期的RNA產(chǎn)量
1.肝和脾，6—10μg
2.腎，3—4μg
3.骨骼肌和腦組織，1—1.5μg
4.胎盤，1-4μg
5.上皮細(xì)胞(1×106 cultured cells)，8—15μg
6.纖維母細(xì)胞(1×106 cultured cells)，5—7μg
"抽提得率低
1.樣品均化或裂解不完全。
2.終RNA不完全再溶解。
"A260/A280 比率 <1.65
1.在分光光度計(jì)測(cè)量前用水而不是用TE 緩沖液稀釋RNA樣品。低離子強(qiáng)度和低pH溶液會(huì)增加280 nm處的光吸收值。
2.樣品勻漿化時(shí)所加的TRIZOL量太少。
3.勻漿化后樣品沒(méi)有在室溫下放置5分鐘。
4.分離的水樣層中污染有苯酚層。
5.終RNA沒(méi)有完全溶解。
"RNA降解
1.從動(dòng)物體取下的組織沒(méi)有立即進(jìn)行抽提或冰凍保存。
2.用于抽提的樣品，或抽提的RNA樣品保存于–5—–20°C，而不是存放于–60—–70°C。
3.細(xì)胞經(jīng)胰酶消化而分散。
4.水溶液或試管污染有RNA酶。
5.用于瓊脂糖凝膠電泳的福爾馬林pH低于3.5。
"DNA污染
1.樣品勻漿化時(shí)所加的TRIZOL量太少。
2.用于抽提的樣品包含有機(jī)溶媒（例如，乙醇，DMSO），強(qiáng)緩沖液，或堿性溶液。
"蛋白多糖和多糖污染
下述的對(duì)RNA沉淀方法（步驟3）的改進(jìn)能從抽提的RNA中移去復(fù)合污染。以勻漿化時(shí)每1 ml TRIZOL為例，在水樣層中加入0.25 ml異丙醇后再加入0.25 ml的高鹽溶液(0.8 M檸檬酸鈉和1.2 M NaCl)。將終溶液混勻，離心并繼續(xù)進(jìn)行前述的抽提操作。改進(jìn)后的沉淀法能有效地析出RNA而多糖和蛋白多糖仍以可溶的的形式留在溶液中。對(duì)于含有大量多糖的植物，要抽提其RNA將改進(jìn)后的沉淀法和在最初勻漿化時(shí)多加一次離心(RNA 抽提指南，可選方案)合并使用是十分必要的
