通常意義上的DNA甲基化是指基因組DNA序列上CpG島的二核苷酸5’端胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?’甲基胞嘧啶（5’methylcytosine, 縮寫5mC）。在哺乳動物細胞中，甲基化主要發(fā)生在CpG島，片段長度為500-1000bp，約56%的編碼基因含有此結(jié)構(gòu)。CpG島和許多生命表征如X染色體失活、細胞發(fā)育以及疾病形成等有緊密的聯(lián)系，這也使得對于CpG島甲基化的探索成為表觀遺傳學研究的重點。特別是在疾病診斷過程中，CpG島甲基化程度的檢測，很大程度上的幫助患者預后。
圖1.CpG島胞嘧啶甲基化
我國對DNA甲基化檢測最近注重起來了。2021年8月25號，北京市醫(yī)療保障局發(fā)布京醫(yī)保發(fā)〔2021〕23號文件，文件中規(guī)范調(diào)整了北京市公立醫(yī)療機構(gòu)共284項醫(yī)療服務價格項目，以進一步完善醫(yī)療服務價格政策。其中基因甲基化檢測被作為實驗室診斷項目納入甲類醫(yī)保服務項目及甲類工傷保險項目內(nèi)，即全額納入報銷范圍。與此同時，在廣西和福建等地也開展了相關甲基化檢測項目。
圖2.北京市部分醫(yī)療服務價格項目規(guī)范調(diào)整信息
甲基化檢測市場預估雖然較為可觀，但是從目前的行狀態(tài)來看，甲基化檢測整體產(chǎn)業(yè)鏈并沒有很大的發(fā)展，這需要產(chǎn)業(yè)從業(yè)人員在國家政策的指導下向前推動。行業(yè)發(fā)展滯緩的部分原因：檢測服務機構(gòu)和試劑廠商數(shù)量不足，無法滿足市場需要。NMPA批準甲基化檢測試劑廠商如鹍遠、透景、廈門艾德、廣州康立明等，不足10家公司；甲基化檢測種類較少，目前NMPA批準的甲基化檢測種類僅涉及septin9、SHOX2、RASSF1A、RNF180、SDC2、MGMT、BMP3、NDRG4，主要是熒光PCR檢測；醫(yī)療系統(tǒng)甲基化檢測項目沒有全國性鋪開等。
01 CpG島（CpG island）
CpG島是基因組上一段CpG二核苷酸高度聚集的DNA回文序列。在哺乳動物細胞中，CpG島常常富集于轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)周圍，如啟動子和第一外顯子上。大小約為100-1000bp，且常常是處于非甲基化的狀態(tài)。
CpG島與甲基化。CpG島一般處于管家基因和活躍表達基因啟動子周圍，而在不活躍表達的基因附近CpG島常常處于甲基化。一旦CpG島的胞嘧啶發(fā)生甲基化，就會抑制轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，進而抑制基因的表達。與此同時，甲基化的CpG島還會吸引一些蛋白復合物，致使組蛋白乙?；愿淖?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，促使轉(zhuǎn)錄沉默。另外，CpG島中甲基化胞嘧啶（C）可以通過脫酰胺作用轉(zhuǎn)化為胸苷（T），即發(fā)生CpG到TpG的轉(zhuǎn)變，這種轉(zhuǎn)變體內(nèi)錯配修復酶無法修復，造成體細胞突變。
圖3.CpG島甲基化與基因表達的關系
CpG島甲基化與許多疾病有密切的聯(lián)系，因此對CpG島甲基化程度的檢測可以很好的患者預后。CpG島甲基化檢測分為三大類：一類是基因組甲基化水平分析，如高效液相色譜HPLC、高效毛細管電泳HPCE法；另外一類是候選基因甲基化分析，如重亞硫酸鹽測序法、甲基化熒光PCR法、甲基化特異性PCR（MS-PCR）、焦磷酸測序等。還有一類為基因組范圍的DNA甲基化模式(Methylation?pattern)與甲基化譜(Methylation Profiling)分析，如RLGS、MCA等。目前，NMPA批準的甲基化檢測試劑盒廠商均為熒光PCR法。熒光PCR法高效，迅速，具備可重復、所需樣本量少、不需要電泳分離的特點。
CpG島甲基化熒光PCR檢測法要結(jié)合重亞硫酸鹽處理，其原理為：首先用重亞硫酸鹽處理待測DNA片段，將非甲基化CpG島轉(zhuǎn)換為甲基化的形式。然后設計的探針與待測位點結(jié)合，隨著PCR的擴增進行，探針被切割釋放熒光基團發(fā)出熒光。通過測定每個擴增循環(huán)報告熒光的強度即可得到該位點的甲基化程度。通過解讀報告，預判患者情況。
圖4.CpG島甲基化熒光PCR檢測法示意圖
近岸蛋白（Novoprotein）立足于表觀遺傳疾病診斷研究，開發(fā)出一款可以高效檢測CpG島甲基化的熒光PCR試劑盒，只需要在試劑里面添加引物探針即可快速檢測靶基因。
優(yōu)秀的擴增性能，能夠高效擴增靶基因：
圖5. Novoprotein試劑對靶位點的擴增
較強的普適性，即可單重擴增，也可雙重擴增：
圖6.Novoprotein試劑雙重擴增靶位點無壓力
試劑穩(wěn)定性強，37℃放置14天，擴增性能不變：
圖7.Novoprotein試劑放置14天后仍可擴增靶位點
試劑抗逆性強，反復凍融破壞20次，擴增性能不變：
圖8.Novoprotein試劑反復凍融20次擴增性能不變
03 CpG島與疾病
CpG島大部分存在于轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域，如啟動子和第一外顯子周圍，與基因的表達有密切的關系。若體細胞CpG島甲基化狀態(tài)發(fā)生改變，那么原有的基因的表達模式發(fā)變化，必定影響生命表征。如常見的癌變，正常體細胞抑癌基因啟動子區(qū)CpG 島甲基化程度較低，抑癌基因正常表達，抑制體細胞癌變。一旦CpG島高度甲基化，抑癌基因發(fā)生沉默，無法正常表達，體細胞極易癌變。再如智力遲鈍癥狀，在胚胎發(fā)育過程中，因為某些特定基因在配子中逃避去甲基化，導致這些基因高度甲基化，無法表達，影響胚胎發(fā)育。因此，基因組甲基化程度有著嚴格的標準，一旦出現(xiàn)甲基化異樣，那么常常伴隨非正常表征的出現(xiàn)。
目前來看，我國甲基化的檢測的項目比較少，僅涉及腸癌、肺癌、膠質(zhì)瘤幾種疾病。
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近岸蛋白質(zhì)是一家專業(yè)從事mRNA疫苗原料、靶點蛋白、細胞因子、分子試劑和診斷原料的研發(fā)生產(chǎn)及抗體藥CRO服務的高新技術企業(yè)。公司產(chǎn)品及服務涵蓋mRNA疫苗、抗體藥、細胞治療、IVD、NGS、基因編輯等多個領域；并提供差異化抗原開發(fā)-噬菌體建庫-高通量候選分子篩選-人源化與親和力成熟-快速重組表達與表征等一站式抗體藥物開發(fā)服務。
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