Single-cell RNA-seq enables comprehensive tumour and immune cell profiling in primary breast cancer
利用scRNA-seq揭示原發(fā)乳腺癌中腫瘤細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞單細(xì)胞水平的基因表達(dá)譜
一.研究背景
自從內(nèi)分泌療法應(yīng)用于ER陽(yáng)性的乳腺癌(Breast cance，BC)患者以來(lái)，研究者已經(jīng)評(píng)估了很多針對(duì)BC的分子靶向療法。然而B(niǎo)C基因組和基因表達(dá)譜的分析都是通過(guò)對(duì)腫瘤組織整體的研究得來(lái)的，因腫瘤自身的異質(zhì)性，分子靶向治療的效果大大折扣。其中BC的遺傳異質(zhì)性(拷貝數(shù)變異，單核苷酸突變等)以及癌細(xì)胞基因表達(dá)水平的異質(zhì)性對(duì)療效有很大影響。此外，因?yàn)槟[瘤微環(huán)境中各種細(xì)胞的存在，從癌組織整體得到的基因表達(dá)譜中也反映了非腫瘤細(xì)胞的特征，也對(duì)癌癥的分子靶向治療造成了干擾。而且這些腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞自身的基因表達(dá)特征也存在獨(dú)立的預(yù)后價(jià)值，值得去探究。
以上這些觀點(diǎn)體現(xiàn)了根據(jù)癌組織基因表達(dá)譜進(jìn)行分子靶向療法的缺點(diǎn)和局限。而作者希望通過(guò)對(duì)不同分子類(lèi)型的乳腺癌的單細(xì)胞水平上的研究，去揭示不同BC亞型中癌細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中非癌細(xì)胞的基因表達(dá)特征，從而為不同亞型BC的分子靶向治療提供理論依據(jù)。同時(shí)作者希望通過(guò)對(duì)腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的研究，從免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組水平揭示癌癥免疫逃逸的機(jī)制。
二.論證邏輯
三. 結(jié)果解析
1. 得到11個(gè)樣本的外顯子數(shù)據(jù)
11個(gè)乳腺癌病人的基本信息如下表，獲取全部病人的腫瘤組織以及BC03，07的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織進(jìn)行WES(全外顯子測(cè)序,數(shù)據(jù)在SRP067248)，bulk RNA-seq(即對(duì)樣本組織整體進(jìn)行RNA-seq)以及scRNA-seq(數(shù)據(jù)在GSE75688)
乳腺癌的分子亞型分子標(biāo)志樣本備注
Luminal AER+/PR+，HER2-BC01-02-
Luminal BER+/PR+，HER2+BC03經(jīng)過(guò)赫賽汀治療
HER2過(guò)表達(dá)型ER-，PR-，HER2+BC04-05-06-
basal-like型/三陰性ER-，PR-，HER2-BC07-08-09-10-11-
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表1. 樣本信息
分析WES數(shù)據(jù)得到的11個(gè)BC患者發(fā)生顯著突變的基因的的CNV(拷貝數(shù)變異)和SNV(單核苷酸突變)信息。BC特征基因的突變也被發(fā)現(xiàn)，包括PIK3CA，TP53，ERBB2等基因。在TNBC患者中發(fā)現(xiàn)CNV有明顯改變
圖. 1 樣本W(wǎng)ES得到乳腺癌相關(guān)基因的CNV和SNV信息
2. 得到11個(gè)樣本的scRNA-seq數(shù)據(jù)
作者用的是microfluidic chips捕獲單細(xì)胞，用SMARTer Ultra Low RNA Kit建庫(kù)，Hiseq-2500測(cè)序。STAR用于把reads與標(biāo)準(zhǔn)序列對(duì)照，基因reads歸一化為T(mén)PM(使用RSEM)，RNA-SeQC對(duì)RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)如下：
細(xì)胞基因
1. number of total reads1. 樣本中TPM<1的基因直接用0替代
2. mapping rate2. 轉(zhuǎn)換為log2(TPM+1)
3. number of detected genes3. 在<10%的腫瘤組織細(xì)胞中表達(dá)的基因被除去
4. portion of intergenic region-
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表2. scRNA-seq質(zhì)量控制步驟
經(jīng)過(guò)濾后留下了包含515個(gè)細(xì)胞和17779個(gè)基因的scRNAs-seq數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析，在這之前先檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。每個(gè)scRNA-seq數(shù)據(jù)中兩個(gè)RNA-spike in的表達(dá)比率恒定(A)，與特定基因的qRT-PCR結(jié)果相關(guān)性高(B)；將每個(gè)樣本的scRNA-seq數(shù)據(jù)合并后與其bulk RNA-seq數(shù)據(jù)間相關(guān)性高(C-D)；對(duì)每個(gè)樣本隨機(jī)抽取一定細(xì)胞進(jìn)行多元回歸分析，隨著細(xì)胞數(shù)增多，對(duì)bulk RNA-seq解釋的方差也增高(E)。這些都說(shuō)明作者得到的scRNA-seq數(shù)據(jù)是可靠的，可以很好的代表腫瘤群體
圖. 2 檢測(cè)scRNA-seq數(shù)據(jù)是否真實(shí)可靠
3.分離單細(xì)胞群中的腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞
首先是確認(rèn)BC中廣泛的異質(zhì)性
A：通過(guò)PCA法對(duì)數(shù)據(jù)降維，發(fā)現(xiàn)不同樣本的細(xì)胞和屬于同一樣本的細(xì)胞混合在一起，說(shuō)明BC異質(zhì)性同時(shí)存在于腫瘤間和腫瘤內(nèi)
B：三個(gè)治療靶點(diǎn)基因ER，PR，HER2在不同分子亞型BC樣本中以及同一分子亞型BC樣本的細(xì)胞中的表達(dá)也存在異質(zhì)性。比如在TNBC樣本的細(xì)胞中也存在高表達(dá)HER2的細(xì)胞
C-D：通過(guò)每個(gè)樣品的病理切片檢查發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中存在不同程度的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)以及其他類(lèi)型細(xì)胞
圖4. BC間存在廣泛的異質(zhì)性
因?yàn)樵谶M(jìn)行scRNA-seq前細(xì)胞并未篩選，所以作者認(rèn)為腫瘤組織中的非腫瘤細(xì)胞可能造成了BC的異質(zhì)性，下一步是要對(duì)其進(jìn)行分離，再分別分析
A：先通過(guò)細(xì)胞CNV信息分離開(kāi)腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞，再根據(jù)免疫評(píng)分區(qū)分免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞
B：作者打算根據(jù)單細(xì)胞基因組的染色體表達(dá)模式即CNV模式，從已知的乳腺癌的基因組CNV去推斷細(xì)胞是否為癌細(xì)胞。作者用GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中正常乳腺組織的基因表達(dá)譜做為對(duì)照，根據(jù)基因的所在的染色體以及起始位置進(jìn)行排序，以150個(gè)基因步長(zhǎng)移動(dòng)計(jì)算每個(gè)細(xì)胞的CNV模式并歸一化。之后通過(guò)對(duì)515個(gè)細(xì)胞的無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)得到11種類(lèi)別，可以看到靠上的細(xì)胞群都屬于某種BC亞型且都有獨(dú)特的CNV模式；而最下方的一類(lèi)細(xì)胞群并不屬于某種BC亞型且沒(méi)有明顯的CNV模式
圖5. 細(xì)胞的CNV模式
為了驗(yàn)證從scRNA-seq得來(lái)的細(xì)胞基因組CNV信息的可靠性，需要和WES得到的CNV信息進(jìn)行比對(duì)，從而驗(yàn)證根據(jù)細(xì)胞CNV模式進(jìn)行分類(lèi)的可靠性
A：以樣本BC01的scRNA-seq數(shù)據(jù)得到的CNV信息為例，可以看到它和WES得到的CNV信息有很高的一致性
B：對(duì)各個(gè)樣品中由scRNA-seq數(shù)據(jù)得來(lái)的有CNV的基因表達(dá)量取平均值與各樣本W(wǎng)ES得來(lái)的相應(yīng)基因表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，在大多數(shù)樣本中呈現(xiàn)高度正相關(guān)
圖6. 從scRNA-seq和WES數(shù)據(jù)中推斷的CNVs的相關(guān)性
C：根據(jù)圖6. B中的聚類(lèi)結(jié)果，給每個(gè)細(xì)胞加上癌細(xì)胞或非癌細(xì)胞標(biāo)簽，此時(shí)PCA圖中兩大類(lèi)細(xì)胞是明顯分開(kāi)了的，說(shuō)明分類(lèi)較成功，結(jié)果可信
D：用ESTIMATE包對(duì)兩類(lèi)細(xì)胞進(jìn)行分析，綠色數(shù)據(jù)為GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中183個(gè)正常乳房組織的分析結(jié)果。由上文得到的腫瘤細(xì)胞的腫瘤得分很高而免疫和基質(zhì)得分與非癌細(xì)胞相比顯著降低。有趣的是，在非腫瘤細(xì)胞中有一些細(xì)胞的免疫得分很低，被認(rèn)為是纖維母細(xì)胞等基質(zhì)細(xì)胞
E：作者觀察了兩類(lèi)細(xì)胞分別在3個(gè)免疫相關(guān)基因，3個(gè)機(jī)制相關(guān)基因和3個(gè)腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)情況(順序從下到上)。腫瘤細(xì)胞高表達(dá)腫瘤相關(guān)基因；非腫瘤細(xì)胞高表達(dá)免疫相關(guān)基因；非腫瘤細(xì)胞中也存在高表達(dá)基質(zhì)相關(guān)基因的細(xì)胞
通過(guò)以上方法，作者從515個(gè)細(xì)胞中分離出了317個(gè)腫瘤細(xì)胞，175個(gè)腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞以及23個(gè)基質(zhì)細(xì)胞用于后續(xù)下游分析
圖7. 成功分離了癌細(xì)胞與非癌細(xì)胞
4. 乳腺癌細(xì)胞內(nèi)在的異質(zhì)性
在成功區(qū)分兩類(lèi)細(xì)胞后，就能分別展開(kāi)研究
A：在去除非癌細(xì)胞后，樣本單個(gè)腫瘤細(xì)胞間的相關(guān)性顯著增加，說(shuō)明腫瘤內(nèi)在的異質(zhì)性可以從單細(xì)胞水平去解釋。也可以看到TNBC樣本細(xì)胞間的相關(guān)性并沒(méi)有明顯提高，說(shuō)明其腫瘤細(xì)胞間也存在較大差異
B：用箱線圖的形式展示去除非癌細(xì)胞之前(白框)和之后(條紋框)的腫瘤內(nèi)細(xì)胞的相關(guān)系數(shù)。從最右側(cè)的條形圖可以看出在TNBC(粉色)內(nèi)無(wú)論是否去除非腫瘤細(xì)胞，其樣本內(nèi)細(xì)胞間相關(guān)性始終不高，說(shuō)明腫瘤細(xì)胞和微環(huán)境中的非腫瘤細(xì)胞都對(duì)TNBC的異質(zhì)性有影響
C：分別對(duì)腫瘤細(xì)胞(左)和非腫瘤細(xì)胞(右)進(jìn)行PCA分析。屬于不同BC樣本的腫瘤細(xì)胞會(huì)聚成自己獨(dú)立的類(lèi)(左側(cè))，也有些樣本的腫瘤細(xì)胞混合在一起，說(shuō)明了不同類(lèi)型BC間和同一類(lèi)型BC內(nèi)腫瘤細(xì)胞間的異質(zhì)性；而對(duì)于非腫瘤細(xì)胞而言(右側(cè))，不同樣本的細(xì)胞混合在一起，說(shuō)明樣本BC類(lèi)型對(duì)細(xì)胞聚類(lèi)的影響很小，而非腫瘤細(xì)胞的類(lèi)型對(duì)聚類(lèi)的影響更大
圖8. 去除非癌細(xì)胞后揭示了BC細(xì)胞內(nèi)在的異質(zhì)性
接下來(lái)對(duì)分離出的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行BC分子亞型的分類(lèi)，由于樣本BC05接受過(guò)化療，所以并不將其包含在內(nèi)
A：將腫瘤細(xì)胞根據(jù)HER2 module score和ER module score(利用genefu包)分成ER+/HER2-，HER2+和ER-/HER2-三類(lèi)，右側(cè)熱圖展示每個(gè)樣本中腫瘤細(xì)胞的得分情況，與樣本所屬的BC分子亞型基本一致，但一些樣本混合了其它亞型的細(xì)胞。下方餅圖展示了每個(gè)樣本中各種類(lèi)型細(xì)胞所占的比例，像BC04-06的細(xì)胞顯示出混合的亞型，尤其是BC06中大多數(shù)腫瘤細(xì)胞屬于TNBC型；而屬于Luminal B型(ER/HER2雙陽(yáng))的BC03中的腫瘤細(xì)胞卻被歸為HER2陰性的細(xì)胞。這說(shuō)明不同分子分型BC的腫瘤細(xì)胞內(nèi)在的異質(zhì)性
B：GSVA包( Gene Set Variation Analysis，通過(guò)評(píng)估基因集在樣本轉(zhuǎn)錄組中表現(xiàn)看某一通路是否激活)分析了EMT，干性，血管新生，增殖和復(fù)發(fā)(從genefu包中得到基因集)通路在每個(gè)細(xì)胞中的富集程度?？梢钥吹紼MT基因集在TNBC樣本中富集程度更高；HER2型和TNBC型樣本中干性和復(fù)發(fā)相關(guān)基因集富集程度更高(下方箱線圖)。EMT，干性和血管新生的富集分?jǐn)?shù)在腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(上方散點(diǎn)圖)，并以5%為閾值鑒定出三者分?jǐn)?shù)都很高的稀有細(xì)胞(散點(diǎn)圖右上角標(biāo)出)，它們可能在BC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用
圖9. BC細(xì)胞內(nèi)在的異質(zhì)性
5. BC分子亞型間的異質(zhì)性成分
A：利用Seurat包中的LRT檢驗(yàn)法獲得了4種BC分子亞型樣本的單細(xì)胞水平的差異表達(dá)基因(左側(cè))，右側(cè)是bulk RNA-seq中樣本間的差異表達(dá)基因，下方是不同樣本單細(xì)胞水平GSVA分析的結(jié)果
B：分析BC03-04-06三個(gè)樣本(HER2+)腫瘤細(xì)胞中HER2/HER3及其下游信號(hào)通路激活情況
C：針對(duì)TNBC樣本的分析(BC07-BC11)，在A中可以看出樣本細(xì)胞差異表達(dá)基因在basal通路富集。然而根據(jù)之前研究報(bào)道，還可以將TNBC樣本腫瘤細(xì)胞分為6種不同類(lèi)型(右側(cè)圖例)。分類(lèi)后發(fā)現(xiàn)每個(gè)TNBC樣本的腫瘤細(xì)胞中存在多種類(lèi)型細(xì)胞，這也解釋了TNBC廣泛的異質(zhì)性
圖10. 不同BC亞型的單細(xì)胞水平基因表達(dá)譜
6. 腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的異質(zhì)性
結(jié)果4.5是對(duì)BC樣本中腫瘤細(xì)胞的分析，接下來(lái)作者分析了腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞
A：作者先用NMF法將175個(gè)免疫細(xì)胞根據(jù)免疫基因集聚成了三類(lèi)，注釋為B細(xì)胞，T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。同樣用LRT法找出三個(gè)類(lèi)中的差異表達(dá)基因(左上)。右側(cè)是三個(gè)類(lèi)別細(xì)胞中差異基因的GO分析結(jié)果。作者同樣對(duì)所有免疫細(xì)胞做了GSVA分析(右下)，可以看到第一類(lèi)(B細(xì)胞)中的細(xì)胞大部分來(lái)自BC轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織；其他兩類(lèi)大部分來(lái)自原位BC組織
B：針對(duì)第一類(lèi)B細(xì)胞，作者對(duì)它們根據(jù)在各個(gè)基因集中的GSVA的富集分?jǐn)?shù)進(jìn)行層次聚類(lèi)畫(huà)熱圖，這些B細(xì)胞又被分為兩類(lèi)。其中一種有初始B細(xì)胞的特征，多來(lái)自TNBC樣本；另一種具有中心細(xì)胞或中心母細(xì)胞的特征，大多來(lái)自BC03的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織
圖11. 對(duì)腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的分析
B-C：利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)樣本BC組織中的免疫細(xì)胞，CD3是T細(xì)胞的標(biāo)志分子，CD20是B細(xì)胞的標(biāo)志分子。C中點(diǎn)代表樣本，顏色越深表示捕獲到的單細(xì)胞中的相應(yīng)免疫細(xì)胞數(shù)越多，橫坐標(biāo)是相應(yīng)標(biāo)志分子在bulk RNA-seq中的表達(dá)量，縱坐標(biāo)是免疫螢光標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)?？梢钥吹矫庖邿晒獾慕Y(jié)果和bulk RNA-seq的結(jié)果呈顯著的正相關(guān)(p<0.05)，而且scRNA-seq確實(shí)可以得到T，B淋巴細(xì)胞的基因表達(dá)譜(灰/黑色點(diǎn))，但并不是所有樣本的scRNA-seq都可以(白點(diǎn))
圖12. 免疫熒光技術(shù)驗(yàn)證淋巴細(xì)胞的存在
7. 對(duì)腫瘤浸潤(rùn)的T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞進(jìn)行分析
將免疫細(xì)胞中的T細(xì)胞提取出，根據(jù)細(xì)胞的在每個(gè)基因集中的GSVA富集分?jǐn)?shù)進(jìn)行聚類(lèi)分析，它們又被聚成4種類(lèi)型T細(xì)胞，分別表現(xiàn)出初始T，共刺激T，調(diào)節(jié)T和耗竭性T細(xì)胞的基因表達(dá)特征。之后分別對(duì)各樣本BC組織中免疫細(xì)胞的組成進(jìn)行分析。并得出BC樣本中免疫細(xì)胞具有表達(dá)免疫抑制基因的特征的結(jié)論
圖13. 腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞的特征
好啦，讓我們總結(jié)一下本文。作者收集了4種分子亞型的BC樣本組織，主要是通過(guò)scRNA-seq數(shù)據(jù)研究乳腺癌的異質(zhì)性。在對(duì)RNA-seq數(shù)據(jù)質(zhì)量檢驗(yàn)后根據(jù)細(xì)胞的CNV表達(dá)模式將細(xì)胞分為腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞(多為免疫細(xì)胞)后分開(kāi)研究乳腺癌的異質(zhì)性。本文主要利用genefu包對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分子分型，以及GSVA包開(kāi)展功能分析。讓我們期待下一次的文獻(xiàn)解讀，大家不見(jiàn)不散！
