第三節(jié) 工業(yè)微生物菌種的選育
用發(fā)酵法生產(chǎn)產(chǎn)品，首先要有一個良好的菌種。因此必須進行菌種選育工作。菌種選育工作大幅度提高了微生物發(fā)酵的產(chǎn)量，促進了微生物發(fā)酵工業(yè)的迅速發(fā)展。通過菌種選育，抗生素、氨基酸、維生素、藥用酶等產(chǎn)物的發(fā)酵產(chǎn)量提高了幾十倍、幾百倍、甚至幾千倍。菌種選育在提高產(chǎn)品質(zhì)量、增加品種、改善工藝條件和生產(chǎn)菌的遺傳學研究等方面也發(fā)揮重大作用。菌種選育的目的是改良菌種的特性，使其符合工業(yè)生產(chǎn)的要求。
菌種選育包括經(jīng)驗育種和定向育種，其中經(jīng)驗育種又分自然選育和誘變育種。在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工誘變處理，根據(jù)菌種的自發(fā)突變（亦稱自然突變）而進行菌種篩選的過程，叫做自然選育。由于野生菌株生產(chǎn)能力低，往往不能滿足工業(yè)上的需要。因為在正常生理條件下，微生物依靠其代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)，趨向于快速生長和繁殖。但是，發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)，需要培養(yǎng)微生物使之積累大量的代謝產(chǎn)物。為此，采用種種措施來打破菌的正常代謝，對代謝流進行調(diào)節(jié)控制，從而大量積累我們所需要的代謝產(chǎn)物。例如青霉素的原始生產(chǎn)菌種產(chǎn)生黃色色素，使成品帶黃色，經(jīng)過菌種選育，生產(chǎn)菌不再分泌黃色色素；土霉素產(chǎn)生菌在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生大量泡沫，經(jīng)誘變處理后改變了遺傳特性，發(fā)酵泡沫減少，可節(jié)省大量消泡劑并增加培養(yǎng)液的裝量；紅霉素等品種發(fā)酵遇有噬菌體侵襲時，發(fā)酵產(chǎn)量大幅度下降，甚至被迫停產(chǎn)，菌種經(jīng)誘變處理獲得抗噬菌體的特性，就可保證發(fā)酵生產(chǎn)的正常進行。
自然選育 自然選育包括從自然界分離獲得菌株和根據(jù)菌種的自發(fā)突變進行篩選而獲得菌種。
⒈ 從自然界分離獲得菌株
從自然界分離新菌種一般包括以下幾個步驟：采樣、增殖培養(yǎng)、純種分離和性能測定等。
?、?采樣 采樣地點的確定要根據(jù)篩選的目的、微生物的分布概況及菌種的主要特征與外界環(huán)境關系等，進行綜合、具體地分析來決定。如果預先不了解某種生產(chǎn)菌的具體來源，一般可從土壤中分離。采樣的方法多是在選好地點后，用小鏟去除表土，取離地面5～15 cm處的土壤幾十克，盛入預先消毒好的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，記錄采樣時間、地點、環(huán)境情況等，以備考查。一般土壤中芽孢桿菌、放線菌和霉菌的孢子忍耐不良環(huán)境的能力較強，不太容易死亡。但是，由于采樣后的環(huán)境條件與天然條件有著不同程度的差異，一般應盡快分離。對于酵母類或霉菌類微生物，由于它們對碳水化合物的需要量比較多，一般又喜歡偏酸性環(huán)境，所以酵母類、霉菌類在植物花朵、瓜果種子及腐殖質(zhì)含量高的土壤等上面比較多。
?、?增殖培養(yǎng) 收集到的樣品，如含目標菌株較多，可直接進行分離。如果樣品含目標菌種很少，就要設法增加該菌的數(shù)量，進行增殖(富集)培養(yǎng)。所謂增殖培養(yǎng)就是給混合菌群提供一些有利于所需菌株生長或不利于其它菌型生長的條件，以促使目標菌株大量繁殖，從而有利于分離它們。例如篩選纖維素酶產(chǎn)生菌時，以纖維素作為唯一碳源進行增殖培養(yǎng)，使得不能分解纖維素的菌不能生長；篩選脂肪酶產(chǎn)生菌時，以植物油作為唯一碳源進行增殖培養(yǎng)，能更快更準確地將脂肪酶產(chǎn)生菌分離出來。除碳源外，微生物對氮源、維生素及金屬離子的要求也是不同的，適當?shù)乜刂七@些營養(yǎng)條件對提高分離效果是有好處的。另外，控制增殖培養(yǎng)基的pH值，有利于排除不需要的、對酸堿敏感的微生物；添加一些專一性的抑制劑，可提高分離效率，例如在分離放線菌時，可先在土壤樣品懸液中加10％的酚液數(shù)滴，以抑制霉菌和細菌的生長；適當控制增殖培養(yǎng)的溫度，也是提高分離效率的一條好途徑。
?、?純種分離 通過增殖培養(yǎng)還不能得到微生物的純種，因為生產(chǎn)菌在自然條件下通常是與各種菌混雜在一起的，所以有必要進行分離純化，才能獲得純種。純種分離方法常選用單菌落分離法。把菌種制備成單孢子或單細胞懸浮液，經(jīng)過適當?shù)南♂尯?，在瓊脂平板上進行劃線分離。劃線法是將含菌樣品在固體培養(yǎng)基表面作有規(guī)則的劃線(有扇形劃線法、方格劃線法及平行劃線法等)，菌樣經(jīng)過多次從點到線的稀釋，最后經(jīng)培養(yǎng)得到單菌落。也可以采用稀釋法，該法是通過不斷地稀釋，使被分離的樣品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平板，使每一微生物都遠離其他微生物而單獨生長成為菌落，從而得到純種。劃線法簡單且較快，稀釋法在培養(yǎng)基上分離的菌落單一均勻，獲得純種的概率大，特別適宜于分離具有蔓延性的微生物。采用單菌落分離法有時會夾雜一些由兩個或多個孢子所生長的菌落，另外不同孢子的芽管間發(fā)生吻合，也可形成異核菌落。要克服這些缺點，就要特別重視單孢子懸浮液的制備方法。為使單孢子懸浮液有良好的分散度，力求去除菌絲斷片或粘接在一起的成串的孢子，可采用如下方法制備單孢子懸浮液：① 對于細菌，因其在固體斜面培養(yǎng)基上常粘在一起，故要求轉(zhuǎn)種到新鮮肉湯液體中進行培養(yǎng)，以取得分散且生長活躍的菌體；② 對放線菌和霉菌的孢子，采用玻璃珠或石英砂振蕩打散孢子后，用濾紙或棉花過濾；對某些黏性大的孢子，常加入0.05％的分散劑(如吐溫80，Tween 80)以獲得分散的單個孢子。
為了提高篩選工作效率，在純種分離時，培養(yǎng)條件對篩選結(jié)果影響也很大，可通過控制營養(yǎng)成分、調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值、添加抑制劑、改變培養(yǎng)溫度和通氣條件及熱處理等來提高篩選效率。平板分離后挑選單個菌落進行生產(chǎn)能力測定，從中選出優(yōu)良的菌株。
⑷ 生產(chǎn)性能的測定 由于純種分離后，得到的菌株數(shù)量非常大，如果對每一菌株都作全面或精確的性能測定，工作量十分巨大，而且是不必要的。一般采用兩步法，即初篩和復篩，經(jīng)過多次重復篩選，直到獲得1～3株較好的菌株，供發(fā)酵條件的摸索和生產(chǎn)試驗，進而作為育種的出發(fā)菌株。這種直接從自然界分離得到的菌株稱為野生型菌株，以區(qū)別于用人工育種方法得到的變異菌株（亦稱突變株）。
⒉ 從自發(fā)突變體中獲得菌株
一般微生物可遺傳的特性發(fā)生變化稱為變異，又稱突變，是微生物產(chǎn)生變種的根源，同時也是育種的基礎。自然突變是指在自然條件下出現(xiàn)的基因變化。目前，發(fā)酵工業(yè)中使用的生產(chǎn)菌種，幾乎都是經(jīng)過人工誘變處理后獲得的突變株。這些突變株是以大量生成某種代謝產(chǎn)物(發(fā)酵產(chǎn)物)為目的篩選出來的，因而它們屬于代謝調(diào)節(jié)失控的菌株。微生物的代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)趨向于最有效地利用環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)，優(yōu)先進行生長和繁殖，而生產(chǎn)菌種常常是打破了原有的代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)的突變株，因此常常表現(xiàn)出生活力比野生菌株弱的特點。此外，生產(chǎn)菌種是經(jīng)人工誘變處理而篩選獲得的突變株，遺傳特性往往不夠穩(wěn)定，容易繼續(xù)發(fā)生變異，使得生產(chǎn)菌株呈現(xiàn)出自然變異的特性，如果不及時進行自然選育，通常會導致菌種性能變化，使發(fā)酵產(chǎn)量降低，但也有變異使菌種獲得優(yōu)良性能的情況。
自發(fā)突變的頻率較低，因此自然選育篩選出來的菌種，不能滿足育種工作的需要，不完全符合工業(yè)生產(chǎn)的要求，如產(chǎn)量低、副產(chǎn)物多、生長周期長等。因而不能僅停留在“選”種上，還要進行“育”種。如通過誘變劑處理菌株，就可以大大提高菌種的突變頻率，擴大變異幅度，從中選出具有優(yōu)良特性的變異菌株，這種方法就稱為誘變育種。
誘變育種的程序 誘變育種和其他方法相比較，人工誘變能提高突變頻率和擴大變異譜，具有速度快、方法簡便等優(yōu)點，是當前菌種選育的一種主要方法，在生產(chǎn)中使用得十分普遍。但是誘發(fā)突變隨機性大，因此誘發(fā)突變必須與大規(guī)模的篩選工作相配合才能收到良好的效果。如果篩選方法得當，也有可能定向地獲得好的變異株。
誘變育種的主要環(huán)節(jié)是：① 以合適的誘變劑處理大量而均勻分散的微生物細胞懸浮液(細胞或孢子)，以引起絕大多數(shù)細胞致死的同時，使存活個體中DNA堿基變異頻率大幅度提高；② 用合適的方法淘汰負變異株，選出極少數(shù)性能優(yōu)良的正變異株，以達到培育優(yōu)良菌株的目的。誘變育種的程序如圖4-1所示。
圖4-1 誘變育種的程序
?、?出發(fā)菌株的選擇
工業(yè)上用來進行誘變處理的菌株，稱為出發(fā)菌株(parent strain)。在許多情況下，微生物的遺傳物質(zhì)具有抗誘變性，這類遺傳性質(zhì)穩(wěn)定的菌株用來生產(chǎn)是有益的，但作為誘變育種材料是不適宜的。出發(fā)菌株通常有三種：① 從自然界分離得到的野生型菌株；② 通過生產(chǎn)選育，即由自發(fā)突變經(jīng)篩選得到的高產(chǎn)菌株；③ 已經(jīng)誘變過的菌株，這類菌株作為出發(fā)菌株較為復雜。一般認為誘變獲得高產(chǎn)菌株，再誘變易產(chǎn)生負突變，再度提高產(chǎn)量比較困難。采用連續(xù)誘變的方法，在每次誘變之后選出3～5株較好的菌株繼續(xù)誘變，如果遇到高產(chǎn)菌株再誘變進一步提高產(chǎn)量效果不佳時，可以先行雜交，再作為誘變的出發(fā)菌株，這樣有可能收到比較好的效果。
?、?菌懸液的制備
采用生理狀態(tài)一致(用選擇法或誘導法使微生物同步生長)的單細胞或孢子進行誘變處理，這樣不但能均勻地接觸誘變劑，還可減少分離現(xiàn)象的發(fā)生。處理前細胞盡可能達到同步生長狀態(tài)，細胞懸液經(jīng)玻璃珠振蕩打散，并用脫脂棉或濾紙過濾，以達到單細胞狀態(tài)。
一般處理細菌的營養(yǎng)細胞，采用生長旺盛的對數(shù)期，其變異率較高且重現(xiàn)性好。霉菌的菌株一般是多核的，因此對霉菌都用孢子懸浮液進行誘變，對放線菌一般也如此。但孢子生理活性處于休眠狀態(tài)，誘變時不及營養(yǎng)細胞好，因此最好采用剛剛成熟時的孢子，其變異率高?；蛟谔幚砬皩㈡咦优囵B(yǎng)數(shù)小時，使其脫離靜止狀態(tài)，則誘變率也會增加。
一般處理真菌的孢子或酵母時，其菌懸液的濃度大約為106個／mL，細菌和放線菌的孢子的濃度大約為108個／mL。
?、?前培養(yǎng)
誘變處理前，將細胞在添加嘌呤、嘧啶等堿基或酵母膏的培養(yǎng)基中培養(yǎng)20～60 min，再進行誘變處理，則變異率可大幅度提高。
?、?誘變
能誘發(fā)基因突變并使突變率提高到超過自然突變水平的物理化學因子都稱為誘變劑?？煞譃槲锢碚T變劑和化學誘變劑兩大類。
?、?變異菌株的分離和篩選
通過誘變處理，在微生物群體中出現(xiàn)各種突變型的個體，但其中多數(shù)是負突變體。為在短時間內(nèi)獲得好的效果，應采用效率較高的篩選方案或篩選方法。實際工作中，一般分初篩和復篩兩階段進行，前者以量為主，后者以質(zhì)為主。
誘變育種方案設計 誘變育種一般采用物理、化學誘變因素使微生物DNA的堿基排列發(fā)生變化，以使排列錯誤DNA模板形成異常的遺傳信息，造成某些蛋白結(jié)構變異，而使細胞功能發(fā)生改變。誘變育種不僅可以提高菌株的生產(chǎn)能力，而且還可以改進產(chǎn)品的質(zhì)量，擴大品種，簡化工藝。在科學實驗和生產(chǎn)上都得到了廣泛應用。目前應用于工業(yè)化的生產(chǎn)菌幾乎毫無例外地都是經(jīng)過誘變的改良菌種。
按照生產(chǎn)的要求，根據(jù)生物的遺傳和變異的理論，用人工的方法造成菌種變異，再經(jīng)過篩選，而達到菌種選育的目的。即就是通過誘變改善菌種的特性，獲得優(yōu)良菌株。
誘變育種方案包括突變的誘發(fā)、突變株的篩選和突變高產(chǎn)基因的表現(xiàn)。這些環(huán)節(jié)是相互聯(lián)系，缺一不可的。在誘變育種的早期階段，工作一般是順利的，高產(chǎn)突變株不斷涌現(xiàn)。但經(jīng)過長期誘變得到的高產(chǎn)突變株，再進一步提高時，進展逐漸變慢，困難也越來越多。因此，應在早期周密地設計一個選育工作方案。
誘發(fā)突變有可能出現(xiàn)多種多樣變異性突變株。除了高產(chǎn)性狀外，還要考慮其他有利性狀。例如，生長速度快、產(chǎn)孢子多；消除某些色素或無益組分；能有效利用廉價發(fā)酵原材料；改善發(fā)酵工藝中某些缺陷(如泡沫過多、對溫度波動敏感、菌絲量太多、自溶早、過濾困難等)。但是所定的篩選目標不可太多，要充分估計人力、物力和測試能力等，要考慮實現(xiàn)這些目標的可能性。要選出一個達到一定產(chǎn)量的高產(chǎn)菌株，往往要篩選數(shù)千個左右的突變株，經(jīng)歷多次誘變和篩選，才能達到目的。
?、?突變的誘發(fā)
誘變劑所造成的DNA分子的某一位置的結(jié)構改變稱為前突變。例如紫外線照射形成的胸腺嘧啶二聚體就是一種前突變。前突變可以通過影響DNA復制而成為真正的突變，也可以經(jīng)過修復重新回到原有的結(jié)構，即不發(fā)生突變。許多環(huán)境因素可以影響突變的誘發(fā)過程，從而影響突變率。以下將討論從誘變劑進入細胞到突變型出現(xiàn)的整個過程以及影響這一過程的一些因素。
⒈ 誘變劑接觸DNA分子
誘變劑要進入細胞才能誘發(fā)突變，因此細胞對誘變劑的透性將影響誘變結(jié)果。誘變劑在接觸DNA之前要經(jīng)過細胞質(zhì)，細胞質(zhì)的某些組分和某些酶可和誘變劑相互作用而影響誘變效果。
突變的誘發(fā)還和基因所處的狀態(tài)有關，而基因的狀態(tài)又和培養(yǎng)條件有關。在培養(yǎng)基中加入誘導劑使基因處于轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，可能有利于誘變劑的作用。據(jù)認為在轉(zhuǎn)錄時，DNA雙鏈解開更有利于誘變作用。
?、?DNA損傷的修復
DNA損傷的修復和基因突變有著密切的關系。已發(fā)現(xiàn)微生物有五種修復DNA損傷方式，它們是：光復活作用、切補修復、重組修復、SOS修復系統(tǒng)、DNA多聚酶的校正作用。
圖4-2 三種DNA修復作用
?、?光復活作用 人們發(fā)現(xiàn)某些經(jīng)紫外線照射過的放線菌孢子，如果在可見光下培養(yǎng)時，存活數(shù)明顯大于在黑暗中培養(yǎng)的同一樣品。經(jīng)研究證明這是有一種為可見光所激活的酶在起作用。這種酶能和經(jīng)紫外線照射過的DNA在黑暗中結(jié)合，形成的復合物置于可見光下，酶和DNA解離，解離下來的DNA分子中不再存在原來的胸腺嘧啶二聚體。見圖4-2(a)。
?、?切補修復 切補修復是在四種酶的協(xié)同作用下進行DNA損傷修復，這四種酶都不需要可見光的激活。首先在胸腺嘧啶二聚體5’端，在核酸內(nèi)切酶的作用下造成單鏈斷裂；其次在核酸外切酶的作用下切除胸腺嘧啶二聚體；然后在DNA多聚酶Ⅰ、Ⅲ的作用下進行修補合成；最后在DNA連接酶的作用下形成一個完整的雙鏈結(jié)構。見圖4-2 (b)。
?、?重組修復 重組修復必須在DNA進行復制的情況下進行，所以又稱為復制后修復。重組修復是在不切除胸腺嘧啶二聚體的情況下進行修復作用。以帶有二聚體的單鏈為模板合成互補單鏈，可是在每一個二聚體附近留下一個空隙。一般認為通過染色體交換，空隙部位就不再面對著二聚體，而是面對著正常的單鏈，在這種情況下，DNA多聚酶和連接酶就能把空隙部位修復好。見圖4-2 (c)。
?、?SOS修復系統(tǒng) 這是一種能夠造成誤差修復的“呼救信號”修復系統(tǒng)。當DNA受到誘變劑損傷而阻斷DNA復制過程時，DNA損傷相當于一個呼救信號，促使細胞中的有關酶系解除阻遏，而進行DNA的修復。在修復過程中，DNA多聚酶在無模板的情況下進行DNA的修復合成，并將合成的DNA片段插入受損DNA的空隙處。SOS修復系統(tǒng)的修復作用容易導致基因突變，大多數(shù)經(jīng)誘變所獲得的突變來源于此修復系統(tǒng)的作用。
⑸ DNA多聚酶的校正作用 除了上述種種修復作用以外，細胞還具有對復制過程中出現(xiàn)差錯加以校正的功能。大腸桿菌中DNA的復制依賴于三種DNA多聚酶(多聚酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)的作用，這三種酶除了對于多核苷酸的多聚作用以外，還具有3’到5’核酸外切酶的作用。一般認為依靠DNA多聚酶的這一作用，能在復制過程中隨時切除不正常的核苷酸。如果DNA多聚酶發(fā)生突變而使其核酸外切酶活性減弱，那么，它切除不正常核苷酸的能力減弱，菌體的突變率相應地提高，成為增變突變型。DNA多聚酶為DNA修復作用所必需，所以增變突變型對于誘變劑的作用格外敏感。
?、?從前突變到突變
前突變形成后，細胞中幾種修復系統(tǒng)就會對它施加作用。從對突變誘發(fā)的影響看，修復系統(tǒng)可以分為校正差錯和引起差錯這兩類。一般認為光復活作用、切補修復和DNA多聚酶校正作用這三種修復作用具有校正差錯的性質(zhì)而不利于突變的誘發(fā)，而重組修復和SOS修復系統(tǒng)這兩種修復作用具有引起差錯的性質(zhì)而有利于突變的發(fā)生。
可以認為，一切影響這些修復系統(tǒng)中的酶活性的因素都能影響由前突變到突變這一過程。例如，咖啡堿能抑制切補修復系統(tǒng)，因而增強誘變作用；氯霉素能抑制細菌的蛋白質(zhì)合成，從而抑制了依賴于蛋白質(zhì)合成的SOS修復系統(tǒng)和重組修復，降低誘變率。相反地，一切有利于蛋白質(zhì)合成的因素都有利于提高突變率。
與突變有關的一些酶的激活劑或抑制劑也會影響突變率。Ba2+對DNA多聚酶的3’核酸外切酶活性有抑制作用，從而可提高突變率。
從上述可以看出，誘變前后的處理可影響誘變的效果。其原因主要有兩方面：一是通過影響與DNA修復作用有關的酶活性而影響誘變的效果；二是通過使誘變的目的基因處于活化狀態(tài)(復制或轉(zhuǎn)錄狀態(tài))，使之更容易被誘變劑所作用，從而影響目的基因的突變率。
?、?從突變到突變表型
突變基因的出現(xiàn)并不等于突變表型的出現(xiàn)，表型的改變落后于基因型改變的現(xiàn)象稱為表型遲延。表型遲延有兩種原因：分離性遲延和生理性遲延。
?、?分離性遲延 分離性遲延實際上是經(jīng)誘變處理后，細胞中的基因處于不純的狀態(tài)(野生型的基因和突變型的基因并存于同一細胞中)，突變型基因由于屬于隱性基因而暫時得不到表達，需經(jīng)過復制、分離，在細胞中處于純的狀態(tài)(一細胞中只有突變型基因，沒有野生型基因)時，其性狀才得以表達。
大腸桿菌在對數(shù)生長期含有2～4個核質(zhì)體，當其中一個核發(fā)生突變時，這個細胞變成異核體。如果突變表型表現(xiàn)為某個基因所控制的產(chǎn)物的喪失，那么這一突變在異核體內(nèi)就是隱性的。因為其他的核繼續(xù)生產(chǎn)該基因控制的產(chǎn)物。需要經(jīng)歷1～2個世代，通過細胞分裂而出現(xiàn)同一細胞的所有核中都帶有這一突變基因時，突變表型才出現(xiàn)。
?、?生理性遲延 突變基因由雜合狀態(tài)變?yōu)榧兒蠣顟B(tài)時，還不一定出現(xiàn)突變表型，新的表型必須等到原有基因的產(chǎn)物稀釋到某一程度后才能表現(xiàn)出來。而這些原有基因產(chǎn)物的濃度降低到能改變表型的臨界水平以前，細胞已經(jīng)分裂多次，經(jīng)過了好幾個世代。例如某個產(chǎn)酶基因發(fā)生了突變，可是細胞中原有的酶仍在起作用，細胞所表現(xiàn)的仍是野生型表型。只有通過細胞分裂，原有的酶已經(jīng)足夠稀釋或失去活性時，才出現(xiàn)突變型的表型。生理性遲延最明顯的例子是噬菌體抗性突變的表達。用誘變劑處理噬菌體敏感菌，將存活菌體立即分離在含噬菌體的培養(yǎng)基上，其抗性菌株不立即出現(xiàn)。而將存活菌先在不含噬菌體的培養(yǎng)基中繁殖幾代后，再分離后接到含有噬菌體的培養(yǎng)基中，則可得到大量抗性菌。有些誘發(fā)突變要經(jīng)歷十幾個世代才能表達。敏感菌對某一些噬菌體敏感是因為其細胞表面具有該噬菌體的受體，抗性菌因不產(chǎn)生該受體而對噬菌體具有抗性。但是基因發(fā)生了抗性突變而細胞表面具有受體的細胞仍會受到噬菌體的感染，抗性突變的表型必須等到經(jīng)過多次細胞分離，細胞表面不再存在有受體時才能表現(xiàn)出來。
?、?誘變劑的種類及選擇
?、?誘變劑
物理誘變劑主要為各種射線，如紫外線、X射線、α射線、β射線、γ射線和超聲波等，其中以紫外線應用最廣，紫外光譜作用光譜正好與細胞內(nèi)的核酸的吸收光譜相一致，因此在紫外光的作用下能使DNA鏈斷裂、DNA分子內(nèi)和分子間發(fā)生交聯(lián)形成嘧啶二聚體，從而導致菌體的遺傳性狀發(fā)生改變。
化學誘變劑的種類較多，常用的有甲基磺酸乙酯(EMS)、亞硝基胍、亞硝酸、氮芥等。它們作用于微生物細胞后，能夠特異地與某些基團起作用，即引起物質(zhì)的原發(fā)損傷和細胞代謝方式的改變，失去親株原有的特性，并建立起新的表型。所謂“表型”是指某一生物個體能夠觀察到的特殊性狀。所謂“基因型（遺傳型）”是指某一生物個體所含有的全部遺傳因子（即基因組）所攜帶的遺傳信息。
誘變劑亞硝基胍和甲基磺酸乙酯雖然誘變效果好，但由于多數(shù)引起堿基對轉(zhuǎn)換，得到的變異株回變率高。電離輻射、紫外線和吖啶類等誘變劑，能引起缺失、閱讀密碼組移動等巨大損傷，則不易產(chǎn)生回復突變。誘變處理劑量的選擇是一個比較復雜的問題，一般正突變較多出現(xiàn)在偏低劑量中，而負突變則較多地出現(xiàn)于偏高劑量中。對于經(jīng)過多次誘變而提高了產(chǎn)量的菌株，在較高劑量負突變率更高。因此，目前處理量已從以前采用的死亡率90％～99％減低為死亡率70％～80％。各種化學誘變劑常用的劑量和處理時間如表4-1。
表4-1 各種化學誘變劑常用的劑量、處理時間
誘變劑的選擇主要是根據(jù)已經(jīng)成功的經(jīng)驗，誘變作用不但決定于誘變劑，還與菌種的種類和出發(fā)菌株的遺傳背景有關。一般對遺傳上不穩(wěn)定的菌株，可采用溫和的誘變劑，或采用已見效果的誘變劑；對于遺傳上較穩(wěn)定的菌株則采用強烈的、不常用的、誘變譜廣的誘變劑。要重視出發(fā)菌株的誘變系譜，不應常采用同一種誘變劑反復處理，以防止誘變效應飽和；但也不要頻頻變換誘變劑，以避免造成菌種的遺傳背景復雜，不利于高產(chǎn)菌株的穩(wěn)定。
選擇誘變劑時，還應該考慮誘變劑本身的特點。例如紫外線主要作用于DNA分子的嘧啶堿基，而亞硝酸則主要作用于DNA分子的嘌呤堿基。紫外線和亞硝酸復合使用，突變譜寬，誘變效果好。
?、?影響誘變效果的因素
除了出發(fā)菌株的遺傳特性和誘變劑會影響誘變效果之外，菌種的生理狀態(tài)、被處理菌株的預培養(yǎng)和后培養(yǎng)條件以及誘變處理時的外界條件等都會影響誘變效果。
菌種的生理狀態(tài)與誘變效果有密切關系，例如有的堿基類似物、亞硝基胍(NTG)等只對分裂中的DNA有效，對靜止的或休眠的孢子或細胞無效；而另外一些誘變劑，如紫外線、亞硝酸、烷化劑、電離輻射等能直接與DNA起反應，因此對靜止的細胞也有誘變效應，但是對分裂中的細胞更有效。因此，放線菌、真菌的孢子誘變前經(jīng)培養(yǎng)稍加萌發(fā)可以提高誘變率。
誘變處理前后的培養(yǎng)條件對誘變效果有明顯的影響?？稍谂囵B(yǎng)基中添加某些物質(zhì)(如核酸堿基、咖啡因、氨基酸、氯化鋰、重金屬離子等等)來影響細胞對DNA損傷的修復作用，使之出現(xiàn)更多的差錯，而達到提高誘變率的目的。例如菌種在紫外線處理前，在富有核酸堿基的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，能增加其對紫外線的敏感性。相反，如果菌種在進行紫外線處理以前，培養(yǎng)于含有氯霉素(或缺乏色氨酸)的培養(yǎng)基中，則會降低突變率。紫外線誘變處理后，將孢子液分離于富有氨基酸的培養(yǎng)基中，則有利于菌種發(fā)生突變。
誘變率還受到其他外界條件，例如溫度、氧氣、pH值、可見光等的影響。
㈢ 出發(fā)菌株的選擇
突變的誘發(fā)受到菌種的遺傳特性、誘變劑、菌種的生理狀態(tài)以及誘變處理時環(huán)境條件的影響。出發(fā)菌株的選擇是誘變育種工作成敗的關鍵。出發(fā)菌株的性能，如菌種的系譜、菌種的形態(tài)、生理、傳代、保存等特性，對誘變效果影響很大。挑選出發(fā)菌株應考慮如下幾點。
① 選擇純種作為出發(fā)菌株，借以排除異核體或異質(zhì)體（表型相同，基因型不同）的影響。從宏觀上講，就是要選擇發(fā)酵產(chǎn)量穩(wěn)定、波動范圍小的菌株為出發(fā)菌株。如果出發(fā)菌株遺傳性不純，可以用自然分離或用緩和的誘變劑進行處理，取得純種作為出發(fā)菌株。這樣雖然要花一些時間，但效果更好。
?、?選擇出發(fā)菌株，不僅是選產(chǎn)量高的，還應該考慮其他因素。如產(chǎn)孢子早而多，色素多或少，生長速度快等有利于合成發(fā)酵產(chǎn)物的性狀。特別重要的是選擇的出發(fā)菌株應當具有我們所需要的代謝特性。例如，適合補料工藝的高產(chǎn)菌株是從糖、氮代謝速度較快的出發(fā)菌株得來的。用生活力旺盛而發(fā)酵產(chǎn)量又不很低的形態(tài)回復突變株作為出發(fā)菌株，?？墒盏胶玫男Ч?。
?、?選擇對誘變劑敏感的菌株作為出發(fā)菌株，不但可以提高變異頻率，而且高產(chǎn)突變株的出現(xiàn)率也大。生產(chǎn)中經(jīng)過長期選育的菌株，有時會對誘變劑不敏感。在此情況下，應設法改變菌株的遺傳型，以提高菌株對誘變劑的敏感性。雜交、誘發(fā)抗性突變和采用大劑量的誘變劑處理均能改變菌株的遺傳性而提高菌株對誘變劑的敏感性。
㈣ 篩選的方法
?、?制定篩選方案
圖4-3 誘變篩選的典型流程
方案設計的中心內(nèi)容是確定誘變篩選流程，流程示意如圖4-3。整個流程可按誘變和篩選兩部分說明如下。
由出發(fā)菌種開始，制出新鮮孢子懸浮液(或細菌懸浮液)作誘變處理，然后以一定稀釋度涂布平皿，至平皿上長出單菌落為止的各步驟為誘變過程。出發(fā)菌種的斜面非常重要。其培養(yǎng)工藝最好是經(jīng)過試驗已知的最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。要選取對誘變劑最敏感的斜面種齡，要求孢子數(shù)適中而新鮮。在平皿內(nèi)傾入10 mL左右的培養(yǎng)基，凝固后，加入一定量經(jīng)誘變處理的孢子液，用涂布器涂勻后進行單菌落分離培養(yǎng)。
篩選過程主要包括傳種斜面、菌株保藏和篩選高產(chǎn)菌株這三項工作。長出單菌落后，隨機挑選單菌落進行生產(chǎn)能力測定。每一被挑選的單菌落傳種斜面后，再由斜面接入模擬發(fā)酵工藝的搖瓶中培養(yǎng)，然后測定其生產(chǎn)能力。挑選生長良好的正常形態(tài)的菌落傳種斜面，還可適當挑選少數(shù)形態(tài)或色素有變異的菌落。經(jīng)誘變處理，形態(tài)嚴重變異的往往為低產(chǎn)菌株。經(jīng)篩選挑出比對照生產(chǎn)能力高10％以上的菌株，要制成砂土管或冷凍管留種保藏。這一步非常重要，可保證高產(chǎn)菌株不會得而復失。誘變處理前后孢子要計數(shù)，以控制處理液的孢子數(shù)和統(tǒng)計誘變致死率，常用于處理的孢子液濃度為105～l08個／mL。孢子計數(shù)采用血球計數(shù)法在顯微鏡下直接計數(shù)。致死率是通過處理前后孢子液活菌計數(shù)來測定。
?、?營養(yǎng)缺陷型的篩選方法
營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）是指原菌株由于發(fā)生基因突變，致使合成途徑中某一步驟發(fā)生缺陷，從而喪失了合成某些物質(zhì)的能力，必須在培養(yǎng)中外源補加該營養(yǎng)物質(zhì)才能生長的突變型菌株。原養(yǎng)型（prototroph）一般指營養(yǎng)缺陷型突變株經(jīng)回復突變或重組后產(chǎn)生的菌株，其營養(yǎng)要求在表型上與野生型（wild type）相同，如能在基本培養(yǎng)基（MM）上生長，但基因型不一定相同。
營養(yǎng)缺陷型的篩選，一般是經(jīng)誘變后，再經(jīng)中間培養(yǎng)、淘汰野生型、檢出營養(yǎng)缺陷型、確定生長譜等步驟。中間培養(yǎng)的目的是減少以后篩選中再產(chǎn)生分離子，其培養(yǎng)基是完全培養(yǎng)基（CM）或補充培養(yǎng)基（SM），并且培養(yǎng)過夜。淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌絲過濾法、差別殺菌法和饑餓法等。其目的在于濃縮缺陷型菌株。當誘變后的缺陷型數(shù)量較大時，也可省去中間培養(yǎng)和淘汰野生型等過程。營養(yǎng)缺陷菌株的檢出方法有：逐個測定法、夾層平板法、限量營養(yǎng)法和影印接種法等。經(jīng)過檢出確定為營養(yǎng)缺陷型菌株之后，尚需進一步確定它的缺陷型是氨基酸、維生素，還是嘌呤、嘧啶缺陷型。
經(jīng)過平皿初篩，確定營養(yǎng)缺陷或其他標記的變異性狀后，即可進行發(fā)酵試驗，檢查其生產(chǎn)性狀，經(jīng)過生產(chǎn)性狀比較，再平行試驗比較，并結(jié)合生產(chǎn)的其他因素考慮，可確定用于生產(chǎn)或進一步改良誘變的菌株，進行保藏或擴大試驗，直至用于生產(chǎn)等。
?、?突變株的篩選
誘變處理后的孢子傳種斜面后，進行生產(chǎn)能力測試篩選。為了獲得優(yōu)良菌株，初篩菌株的量要大，發(fā)酵和測試的條件都可粗放一些。例如可以采用瓊脂塊篩選法進行初篩，也可以采用一個菌株進一個搖瓶的方法進行初篩。隨著以后一次一次的復篩，對發(fā)酵和測試條件的要求應逐步提高，復篩一般每個菌株進3～5個搖瓶，如果生產(chǎn)能力繼續(xù)保持優(yōu)異，再重復幾次復篩。初篩和復篩均需有親株作對照以比較生產(chǎn)能力是否優(yōu)良。復篩后，對于有發(fā)展前途的優(yōu)良菌株，可考察其穩(wěn)定性、菌種特性和最適培養(yǎng)條件等。真正的高產(chǎn)菌株，往往需要經(jīng)過產(chǎn)量提高的逐步累積過程，才能變得越來越明顯。所以有必要多挑選一些出發(fā)菌株進行多步育種，以確保挑選出高產(chǎn)菌株。
根據(jù)形態(tài)變異淘汰低產(chǎn)菌株。突變一旦發(fā)生，突變細胞能夠把突變的性狀遺傳給子代。如果誘變處理確實有效的話，在一定的培養(yǎng)基上，很容易發(fā)現(xiàn)一些菌落的性狀或色澤等和親代菌株不同，這可作為誘變效果的定性指標。某些菌落形態(tài)與生產(chǎn)性能有直接的相關性，可采取在平皿直接篩選。如在灰黃霉素生產(chǎn)菌的選育中，菌落暗紅色變深者，產(chǎn)量就提高。但就目前的研究，多數(shù)變異其菌落外觀形態(tài)與生理的相應關系尚未完全清楚。
根據(jù)平皿直接反應挑取高產(chǎn)菌株。所謂平皿直接反應是指每個菌落產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物與培養(yǎng)基內(nèi)的指示物作用后的變色圈或透明圈等。因其可表示菌株的生產(chǎn)活力高低，所以可以作為初篩的標志，常用的有紙片培養(yǎng)顯色法、透明圈法、瓊脂片法、深度梯度法。菌體細胞經(jīng)誘變劑處理后，要從大量的變異菌株中，把一些具有優(yōu)良性狀的突變株挑選出來，這需要有明確的篩選目標和篩選方法，需要進行認真細致的篩選工作。育種工作中常采用隨機篩選和理性化篩選這兩種篩選方法。
?、?隨機篩選 隨機篩選即菌種經(jīng)誘變處理后，進行平板分離，隨機挑選單菌落，從中篩選高產(chǎn)菌株。為了提高篩選效率，可采用下列方法增大篩選量。
?、?搖瓶篩選法。這是生產(chǎn)上一直使用的傳統(tǒng)方法。即將挑出的單菌落傳種斜面后，再由斜面接入模擬發(fā)酵工藝的搖瓶中培養(yǎng)，然后測定其發(fā)酵生產(chǎn)能力。選育高產(chǎn)菌株的目的是要在生產(chǎn)發(fā)酵罐中推廣應用，因此，搖瓶的培養(yǎng)條件要盡可能和發(fā)酵生產(chǎn)的培養(yǎng)條件相近。但是，實際上搖瓶培養(yǎng)條件很難和發(fā)酵罐培養(yǎng)條件相同。搖瓶篩選的優(yōu)點是培養(yǎng)條件與生產(chǎn)培養(yǎng)條件相接近。但工作量大、時間長、操作復雜。
?、?瓊脂塊篩選法。這是一種簡便、迅速的初篩方法。將單菌落連同其生長培養(yǎng)基(瓊脂塊)用打孔器取出，培養(yǎng)一段時間后，置于鑒定平板以測定其發(fā)酵產(chǎn)量。瓊脂塊篩選法的優(yōu)點是操作簡便、速度快。但是，固體培養(yǎng)條件和液體培養(yǎng)條件之間是有差異的，利用此法所取得的初篩結(jié)果必須經(jīng)搖瓶復篩加以驗證。
?、?篩選自動化和篩選工具微型化。近年來，在研究篩選自動化方面有很大進展，篩選實驗實現(xiàn)了自動化和半自動化，省去了繁瑣的勞動，大大提高了篩選效率。篩選工具的微型化也是很有意義的，例如將一些小瓶子取代現(xiàn)有的發(fā)酵搖瓶，在固定框架中振蕩培養(yǎng)，可使操作簡便，又可加大篩選量。
?、?理性化篩選 傳統(tǒng)的菌種選育是采用隨機篩選的方法。由于正變異株出現(xiàn)的幾率小，產(chǎn)量提高的范圍往往在生物學波動的范圍內(nèi)，因而選出一株高產(chǎn)菌株需要耗費大量的人力、物力。而且，隨著發(fā)酵產(chǎn)量不斷提高，用隨機篩選方法獲得高產(chǎn)菌株的幾率越來越小。近年來，隨著遺傳學、生物化學知識的積累，人們對于代謝途徑、代謝調(diào)控機制了解得更多，因而篩選方法逐漸從隨機篩選轉(zhuǎn)向理性化篩選。理性化篩選是指運用遺傳學、生物化學的原理，根據(jù)產(chǎn)物已知的或可能的生物合成途徑、代謝調(diào)控機制和產(chǎn)物分子結(jié)構來進行設計和采用一些篩選方法，以打破微生物原有的代謝調(diào)控機制，獲得能大量形成產(chǎn)物的高產(chǎn)突變株。微生物的代謝產(chǎn)物不同，其篩選方法也有所不同。
?、?初級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選。根據(jù)代謝調(diào)控的機理，氨基酸、核苷酸、維生素等小分子初級代謝產(chǎn)物的合成途徑中普遍存在著反饋阻遏或反饋抑制，這對于生產(chǎn)菌本身是有意義的，因為可以避免合成過多的代謝物而造成能量的浪費。
表4-2 反饋阻遏與反饋抑制的比較
酶活性的抑制包括競爭性抑制和反饋抑制。反饋抑制是指反應途徑中某些中間產(chǎn)物或末端產(chǎn)物對該途徑中前面反應的影響。凡使反應加速的稱為正反饋，凡使反應減速的稱為負反饋。酶活性的調(diào)節(jié)機制可用Monod提出的變構酶學說予以說明。
末端產(chǎn)物的反饋抑制普遍存在于合成途徑。有兩種似上的末端產(chǎn)物的分支代謝途徑的反饋抑制，作用機制較復雜，其調(diào)節(jié)方式見圖4-4。
圖4-4 反饋抑制模式圖
(a) 協(xié)同反饋抑制 此種抑制作用的特點是分支途徑的幾種末端產(chǎn)物同時過量時才抑制共同途徑中的第一個酶活性。如谷氨酸棒桿菌(
Corynebacterium glutamicum)合成天冬氨酸族氨基酸時，天冬氨酸激酶受到賴氨酸和蘇氨酸的協(xié)同反饋抑制。
(b) 累積反饋抑制 此種抑制作用的特點是每一種末端產(chǎn)物按一定百分率單獨抑制共同途徑中第一個酶活性。各種產(chǎn)物間既無協(xié)同效應，又無拮抗作用。它們抑制的酶，有的是同功酶(能催化同一種生化反應，但酶分子結(jié)構有所不同的一組酶)，有的是多功能酶(指結(jié)構上僅為一種多肽，但卻具有兩種或兩種以上催化活力的酶蛋白)。如谷氨酰胺合成酶受到八種末端產(chǎn)物的累積反饋抑制。
(c) 增效反饋抑制 其特點是代謝途徑中任何一種末端產(chǎn)物過量時，僅部分抑制共同反應途徑中的第一個酶活性，但是兩個末端產(chǎn)物同時過量時，其抑制作用可超過各產(chǎn)物存在的抑制能力的總和。此種調(diào)節(jié)方式發(fā)現(xiàn)在6-氨基嘌呤核苷酸和6-酮基嘌呤核苷酸生物合成途徑。兩類核苷酸各自都能部分地抑制磷酸核糖焦磷酸轉(zhuǎn)酰胺酶的活性。而6-氨基和6-酮基嘌呤核苷酸混合物(GMP+AMP或AMP+IMP)對該酶有強烈地抑制作用。
(d) 順序反饋抑制 每個分支末端產(chǎn)物抑制分支后的第一個酶，產(chǎn)生部分抑制作用。如枯草桿菌合成芳香族氨基酸時的反饋抑制作用。
但是，在工業(yè)生產(chǎn)中，需要生產(chǎn)菌產(chǎn)生大量的氨基酸、核苷酸、維生素等產(chǎn)物。因此，需要打破微生物原有的反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)。育種工作要達到此目的，可從以下兩個方面著手。
?、?降低終產(chǎn)物濃度
(a) 篩選終產(chǎn)物營養(yǎng)缺陷型 如圖4-5所示。在圖4-5中，假設所需要的發(fā)酵產(chǎn)物是C，而該生物合成途徑的終產(chǎn)物是E，則可篩選E的營養(yǎng)缺陷型；如果營養(yǎng)缺陷型是由C→D的代謝被阻斷，則可解除終產(chǎn)物E對發(fā)酵產(chǎn)物C合成的反饋阻遏或反饋抑制，而積累大量的發(fā)酵產(chǎn)物C。
圖4-5 在簡單的代謝途徑中積累中間產(chǎn)物
圖4-6 賴氨酸的大量生成
實例見圖4-6。在谷氨酸棒桿菌的原始菌株中，賴氨酸和蘇氨酸協(xié)同反饋抑制天冬氨酸激酶，獲得了一個缺少高絲氨酸脫氫酶的突變株。它的生長需要蘇氨酸和蛋氨酸。如果蘇氨酸以限制生長的濃度加入時，協(xié)同反饋抑制被打破而大量產(chǎn)生賴氨酸，谷氨酸棒桿菌的雙氫吡啶二羧酸合成酶對賴氨酸的反饋抑制不敏感。
總之，篩選終產(chǎn)物營養(yǎng)缺陷型適合于下面三種情況：發(fā)酵產(chǎn)物為某一直線合成途徑的中間產(chǎn)物如圖4-5所示；發(fā)酵產(chǎn)物為某一分枝合成途徑的中間產(chǎn)物；發(fā)酵產(chǎn)物為某一分枝合成途徑的一個終產(chǎn)物時，可篩選該分枝合成途徑的另一終產(chǎn)物的營養(yǎng)缺陷型，如圖4-6所示。
(b) 篩選細胞膜透性改變的突變株 使之大量分泌排出終產(chǎn)物，以降低細胞內(nèi)終產(chǎn)物濃度，從而避免終產(chǎn)物反饋調(diào)節(jié)。例如，用谷氨酸棒桿菌的生物素營養(yǎng)缺陷型(biotin deficiency)進行谷氨酸發(fā)酵，生物素是合成脂肪酸所必需的，而脂肪酸又是組成細胞膜類脂的必要成分。該缺陷型在生物素處于限量的情況下，不利于脂肪酸的合成，因而使細胞膜的滲透性發(fā)生變化，有利于將谷氨酸透過細胞膜分泌至胞外的發(fā)酵液中。如果使用油酸缺陷型菌株或者甘油缺陷型菌株，即使在生物素過量的條件下，也可使谷氨酸在胞外大量積累。
Ⅱ 篩選抗反饋突變菌株
(a) 篩選結(jié)構類似物(抗代謝物)抗性突變株 分離抗反饋突變株的最常用的方法是用與代謝產(chǎn)物結(jié)構類似的化合物(結(jié)構類似物)處理微生物細胞群體，殺死或抑制絕大多數(shù)細胞，選出能大量產(chǎn)生該代謝物的抗反饋突變株。結(jié)構類似物一方面具有和代謝物相似的結(jié)構，因而具有和代謝物相似的反饋調(diào)節(jié)作用，阻礙該代謝物的生成；另一方面它不同于代謝物，不具有正常的生理功能，對細胞的正常代謝有阻礙作用，會抑制菌的生長或?qū)е戮乃劳觥＠纾环N氨基酸終產(chǎn)物，在正常的情況下，參與蛋白質(zhì)合成，過量時可抑制或阻遏它自身的合成酶類。如果這種氨基酸的結(jié)構類似物也顯示這種抑制或阻遏，但卻不能用于蛋白質(zhì)的合成，那么當用這種結(jié)構類似物處理菌株時，大多數(shù)細胞將由于缺少該種氨基酸而不能生長或者死亡，而那些對該結(jié)構類似物不敏感的突變株，仍然能夠合成該種氨基酸而繼續(xù)生長。某些菌株所以能抵抗這種結(jié)構類似物，是因為被該氨基酸(或結(jié)構類似物)反饋抑制的酶的結(jié)構發(fā)生了改變(抗反饋抑制)，或者被阻遏的酶的生成系統(tǒng)發(fā)生了改變(抗反饋阻遏)。由于突破了原有的反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)，這些突變株就可產(chǎn)生大量的該種氨基酸。
例如選育
L-精氨酸（
L-Arg）高產(chǎn)菌株，可采用篩選結(jié)構類似物
D-Argr菌株的方法（一般文獻中采用上標“r”表示抗性，“s”表示敏感型）。
(b) 利用回復突變篩選抗反饋突變菌株 經(jīng)誘變處理出發(fā)菌株，先選出對產(chǎn)物敏感的營養(yǎng)缺陷型，再將營養(yǎng)缺陷型進行第二次誘變處理得到回復突變株。篩選的目的不是要獲得完全恢復原有狀態(tài)的回復突變株，而是希望經(jīng)過兩次誘發(fā)突變，所得的回復突變株有可能改變了產(chǎn)物合成酶的調(diào)節(jié)部位的氨基酸的順序，使之不能和產(chǎn)物結(jié)合，因而不受產(chǎn)物的反饋抑制。例如，谷氨酸棒桿菌的肌苷酸脫氫酶的回復突變株對其終產(chǎn)物鳥苷酸的反饋調(diào)節(jié)不敏感，從而提高了鳥苷酸的產(chǎn)量。
?、?次級代謝產(chǎn)物(主要是抗生素)高產(chǎn)菌株的篩選。次級代謝是某些生物為了避免在初級代謝過程中某些中間產(chǎn)物積累所造成的不利作用而產(chǎn)生的一類有利于生存的代謝類型。初級代謝與次級代謝都受到核內(nèi)遺傳物質(zhì)的控制，次級代謝產(chǎn)物的合成同時還受到核外遺傳物質(zhì)——質(zhì)粒的控制，有人將這種代謝產(chǎn)物叫做質(zhì)粒產(chǎn)物。次級代謝有不同于初級代謝的特點，因此其篩選方法也和初級代謝略有不同。次級代謝產(chǎn)物不是菌體生長、繁殖所必需的，往往不能簡單地采用篩選營養(yǎng)缺陷型或結(jié)構類似物抗性菌株的方法來獲得高產(chǎn)菌株。
次級代謝又受到初級代謝的調(diào)節(jié)，次級代謝和初級代謝有一些共同的中間產(chǎn)物，這些中間產(chǎn)物可以進而合成初級代謝產(chǎn)物，也可以進而合成次級代謝產(chǎn)物，這取決于菌的遺傳特性和生理狀態(tài)，這些中間產(chǎn)物叫做分叉中間體。微生物的代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)趨向于平衡地利用營養(yǎng)物質(zhì)，當環(huán)境中某些營養(yǎng)物質(zhì)過剩，而某些營養(yǎng)物質(zhì)缺乏時，菌體不能有效的攝入營養(yǎng)，在代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)作用下，菌的生長繁殖速率下降，并通過代謝途徑的改變將過剩的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)變成與生長繁殖無關的次級代謝產(chǎn)物。因此，可篩選某些營養(yǎng)缺陷型或初級代謝產(chǎn)物結(jié)構類似物抗性菌株以消除初級代謝產(chǎn)物對那些共同中間產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)，使之大量積累而有利于次級代謝產(chǎn)物的合成。大多數(shù)菌株在被快速利用的碳、氮、磷源消耗至一定程度時才產(chǎn)生有活性的次級代謝酶，因此篩選解除分解代謝調(diào)節(jié)突變株，可以獲得高產(chǎn)菌。
次級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選方法如下：
(a) 利用營養(yǎng)缺陷型篩選。抗生素產(chǎn)生菌的營養(yǎng)缺陷型大多為低產(chǎn)菌株，但是如果某些次級代謝和初級代謝處于同一分枝合成途徑時，篩選初級代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)缺陷型?？墒瓜鄳拇渭壌x產(chǎn)物增產(chǎn)。例如，芳香族氨基酸營養(yǎng)缺陷型可能增產(chǎn)氯霉素，芳香族氨基酸和氯霉素的生物合成途徑中有一個共同的中間代謝物莽草酸，當誘變處理使莽草酸→芳香族氨基酸的生物合成出現(xiàn)遺傳性阻礙時，菌體不能夠合成芳香族氨基酸，從而避免了芳香族氨基酸對莽草酸生物合成的反饋調(diào)節(jié)，莽草酸得以大量合成，進而合成大量的氯霉素。同樣的道理，脂肪酸和制霉菌素、四環(huán)素、灰黃霉素有共同的中間代謝物丙二酰CoA，脂肪酸營養(yǎng)缺陷型可以增產(chǎn)上述的抗生素。類似的例子還有頭孢菌素產(chǎn)生菌的亮氨酸營養(yǎng)缺陷型可增產(chǎn)頭孢菌素C，亮氨酸和纈氨酸有共同的中間代謝物
α-酮基異戊酸，亮氨酸營養(yǎng)缺陷型使得纈氨酸的生成量增加，纈氨酸作為頭孢菌素C合成的前體物質(zhì)，參與頭孢菌素C母核的合成，所以亮氨酸營養(yǎng)缺陷型可以提高頭孢菌素C的發(fā)酵產(chǎn)量。一般來說，氨基酸營養(yǎng)缺陷不適合工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的要求，將這種氨基酸營養(yǎng)缺陷型和生產(chǎn)菌株(或另一種營養(yǎng)缺陷型)雜交或者回復突變，可能得到適合于工業(yè)生產(chǎn)的高產(chǎn)菌株。因為這樣的雜交后代或回復突變株，可能既保留了營養(yǎng)缺陷型的代謝優(yōu)點(生成較多的抗生素前體)，又便于發(fā)酵生產(chǎn)的控制(不需要另外補充相應的營養(yǎng)物質(zhì))。而且，還可能通過雜交或回復突變獲得具有和抗生素合成有關的基因的部分二倍體。
篩選滲漏缺陷型是一種值得重視的方法。所謂滲漏缺陷型(leaky mutant)是遺傳性障礙不完全的營養(yǎng)缺陷型。突變使某一種酶的活性下降而不是完全喪失，所以這種缺陷型能夠少量地合成某一代謝產(chǎn)物，能在基本培養(yǎng)基上少量地生長。由于滲漏缺陷型不會合成過多的終產(chǎn)物，所以不會造成反饋調(diào)節(jié)而影響中間代謝物的積累。大多數(shù)抗生素高產(chǎn)菌株的生長速率低于野生型菌株的生長速率，似乎可以認為它們在某種意義上屬于滲漏缺陷型，生長速率降低可能有利于抗生素合成。一般文獻中采用上標“-”表示營養(yǎng)缺陷型，上標“L”表示滲漏缺陷型，例如：Met-+ ThrL表示甲硫氨酸缺陷和蘇氨酸滲漏。
根據(jù)以上的推理，可設計如下篩選過程：先進行搖瓶發(fā)酵試驗，選出對抗生素發(fā)酵產(chǎn)量有明顯影響的初級代謝產(chǎn)物，據(jù)此誘變出相應的營養(yǎng)缺陷型，然后再誘發(fā)回復突變或?qū)⒁吧途暾T變成另一營養(yǎng)缺陷型，再與之雜交。如欲篩選滲漏缺陷型，則把營養(yǎng)缺陷型接種在基本培養(yǎng)基上，這上面出現(xiàn)的菌落是回復突變株，其中長得特別小的菌落可能是滲漏缺陷型。
(b) 篩選負變株的回復突變株。選擇經(jīng)過誘變處理后抗生素生產(chǎn)能力明顯降低或完全喪失，但其他性狀仍近于正常的突變株作為實驗材料，進行誘變，再挑選高產(chǎn)菌株。因為兩次誘變都作用于和抗生素生物合成有關的基因上，動搖了抗生素合成的遺傳基礎。用此方法得到的突變株，其與抗生素合成有關的酶受調(diào)節(jié)的程度，往往低于原出發(fā)菌株。此外，從負變株中篩選回復突變株也比較容易，因為負變株沒有發(fā)酵產(chǎn)量或發(fā)酵產(chǎn)量很低，便于從中檢出有較高抗生素產(chǎn)量的回復突變株。
(c) 篩選去磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株。磷酸鹽對許多抗生素的生物合成有抑制作用，篩選去磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株對于生產(chǎn)抗生素是很有意義的。因為要提高抗生素的產(chǎn)量，既要使生產(chǎn)菌生長到一定的量，又要使產(chǎn)生較多的抗生素。這樣培養(yǎng)基中必須加入一定量的磷酸鹽，以供菌體生長的需要，但菌體生長所需要的磷酸鹽濃度往往對抗生素有抑制作用，去磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株可消除或減弱這種抑制作用以獲得高產(chǎn)。
篩選能在磷酸鹽抑制濃度條件下，正常產(chǎn)生抗生素的突變株的過程：將孢子懸浮液誘變處理后，將孢子接種于完全培養(yǎng)基上，使突變株得以表達，再把完全培養(yǎng)基上的菌落影印接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(含正常濃度的磷酸鹽、加瓊脂)，待菌落長出后，用打孔器把長有單個菌落的瓊脂塊轉(zhuǎn)移到一張浸有高濃度磷酸鹽的濾紙上培養(yǎng)、發(fā)酵，然后進行生物測定。抑菌活力(抑菌圈直徑／菌落直徑)明顯大于其他菌落的可能就是去磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株，從影印平板挑取相應的菌落，搖瓶發(fā)酵測定抗生素產(chǎn)量。
篩選磷酸鹽結(jié)構類似物(如砷酸鹽、釩酸鹽)抗性突變株的過程：磷酸鹽結(jié)構類似物對菌體結(jié)構具有毒性，其抗性菌株可能對磷酸鹽調(diào)節(jié)不敏感。例如，釩酸鈉是一種ATP酶的抑制劑，粗糙脈孢菌(
Neurospora crassa)細胞內(nèi)有兩種磷酸鹽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)：一是低親和力的磷酸鹽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)Ⅰ，一是高親和力的磷酸鹽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)Ⅱ。釩酸鈉抗性突變株，缺失磷酸鹽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)Ⅱ，因而避免了過多地吸收釩酸鈉而導致菌的死亡，同時也避免了過多地吸收磷酸鹽而導致磷酸鹽抑制。
(d) 篩選去碳源分解代謝調(diào)節(jié)突變株。能被菌快速利用的碳源在被快速分解利用時，往往對許多其他代謝途徑中的酶(包括許多抗生素合成酶和其他的酶)有阻遏或抑制作用，成為抗生素發(fā)酵產(chǎn)量的限制因素，不利于發(fā)酵生產(chǎn)工藝的控制。篩選去碳源分解代謝調(diào)節(jié)突變株，對于提高抗生素發(fā)酵產(chǎn)量，簡化發(fā)酵生產(chǎn)工藝具有重要意義?？股厣a(chǎn)中最常見的碳源分解代謝調(diào)節(jié)是“葡萄糖效應”，葡萄糖被快速分解代謝所積累的分解代謝產(chǎn)物在抑制抗生素合成的同時也抑制其他某些碳、氮源的分解利用。因此，可以利用這些碳(或氮)源作為惟一可供菌利用的碳(或氮)源，進行抗葡萄糖分解代謝調(diào)節(jié)突變株的篩選。例如，將菌在含有葡萄糖(阻遏性碳源)和組氨酸為惟一氮源的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代后，可選出去葡萄糖分解代謝調(diào)節(jié)突變株。正常的組氨酸分解酶類是被葡萄糖分解代謝物阻遏的，如果突變株能在這種培養(yǎng)基中生長，說明它具有能分解組氨酸而獲得氮源的酶。這樣的結(jié)果，可有兩種解釋：一是組氨酸分解酶發(fā)生了突變，不再受到原有的分解代謝物阻遏；二是葡萄糖分解代謝有關的酶發(fā)生了突變，不再產(chǎn)生或積累那么多的分解代謝阻遏物。第二種解釋符合許多去葡萄糖分解代謝調(diào)節(jié)突變株的特性，因為同時有許多酶(受分解代謝調(diào)節(jié)的酶)的生成都不再受到葡萄糖分解代謝物阻遏。這種現(xiàn)象也是在抗生素育種工作中選擇這種方法篩選去碳源分解代謝調(diào)節(jié)突變株的依據(jù)。
葡萄糖的（毒性）結(jié)構類似物也可用于篩選去碳源分解代謝調(diào)節(jié)突變株。例如，以半乳糖作為可供菌生長利用的惟一碳源，再于培養(yǎng)基中添加葡萄糖的結(jié)構類似物，該結(jié)構類似物不能為菌所利用，但可抑制菌利用半乳糖。所以，在這種培養(yǎng)條件下，只有去葡萄糖分解代謝調(diào)節(jié)突變株能夠利用半乳糖進行生長，原始菌株由于不能利用半乳糖而不能生長。因而可選出去碳源分解代謝調(diào)節(jié)突變株。篩選去碳源分解代謝調(diào)節(jié)突變株還應注意避免走向另一個極端，即片面追求葡萄糖分解代謝速率下降，因為保持合適的葡萄糖分解代謝速率是抗生素高產(chǎn)的關鍵。
圖4-7 葡萄糖的（毒性）結(jié)構類似物
此外，篩選淀粉酶活性高的突變株，以利于在發(fā)酵培養(yǎng)基中增加淀粉類物質(zhì)作為補充碳源，也可以減弱碳分解代謝調(diào)節(jié)對抗生素生產(chǎn)的抑制作用。
(e) 篩選氨基酸結(jié)構類似物抗性突變株。許多抗生素和氨基酸有共同的前體或者有些氨基酸本身可以作為某些抗生素的前體。因此，氨基酸的代謝和抗生素合成有著密切的聯(lián)系，打破菌的氨基酸代謝的調(diào)節(jié)，可能導致抗生素高產(chǎn)。
在培養(yǎng)基中加入氨基酸結(jié)構類似物，氨基酸結(jié)構類似物對菌的生長有抑制作用，因此可以篩選到解除了氨基酸反饋調(diào)節(jié)的突變株。這些突變株能夠在含有氨基酸結(jié)構類似物的培養(yǎng)基中生長，抗性的機制可能在于生成較多的氨基酸，從而提高抗生素前體的量。例如，在青霉素生物合成途徑中，半胱氨酸和纈氨酸是青霉素母核的前體，篩選抗半胱氨酸結(jié)構類似物或抗纈氨酸結(jié)構類似物的抗性突變株，可能提高半胱氨酸或纈氨酸的生成量，進而提高青霉素產(chǎn)量。又如賴氨酸和青霉素有共同的中間代謝產(chǎn)物
α-氨基己二酸，篩選賴氨酸結(jié)構類似物抗性突變株，可以解除賴氨酸對
α-氨基己二酸生成的反饋調(diào)節(jié)，使
α-氨基己二酸生成量增加而促進青霉素合成。
篩選氨基酸結(jié)構類似物抗性突變株的方法：將菌種誘變處理，接種于含抑制濃度的氨基酸結(jié)構類似物的培養(yǎng)基中，由于此種培養(yǎng)條件使得正常菌株不能生長，而抗氨基酸反饋調(diào)節(jié)的突變株或其他抗性突變株能夠生長，因此可篩選出氨基酸結(jié)構類似物抗性突變株。在實際操作過程中，有許多氨基酸結(jié)構類似物并不抑制菌的生長，或只有在高濃度時才抑制菌的生長。因此要選擇合適的氨基酸結(jié)構類似物用于篩選。還有一些氨基酸結(jié)構類似物僅抑制菌落的生長和減少孢子的數(shù)量，且高濃度都不抑制菌落形成和孢子形成，在此情況下，正常大小或正常產(chǎn)孢子的菌落被視為抗性菌。還可以用加入抗代謝抑制劑(如多烯類抗生素)方法，使細胞膜透性增加而提高篩選效果。
(f) 篩選二價金屬離子抗性突變株。加入能和產(chǎn)物(抗生素)或其中間體結(jié)合的生長抑制劑(二價金屬離子)，抑制劑達到一定濃度，抗生素低產(chǎn)菌株不能生長而高產(chǎn)菌株能夠幸存下來，因而可能篩選到高產(chǎn)菌株?？剐缘臋C制為形成大量產(chǎn)物或中間體和二價金屬離子結(jié)合以解除二價金屬離子對生產(chǎn)菌的毒性。但是用此方法，細胞膜透性降低而對二價金屬離子具有抗性的菌株也會存留下來，需要進一步進行搖瓶篩選，通過抗生素產(chǎn)量的比較去除那些并不高產(chǎn)的抗性突變株。
采用上述方法篩選出青霉素和桿菌肽等抗生素的高產(chǎn)菌株。桿菌肽能和二價金屬離子結(jié)合，具有輸送二價金屬離子進出細胞的生理功能。選育桿菌肽高產(chǎn)菌株時，于培養(yǎng)基中添加適量的硫酸亞鐵，在此條件下篩選到的抗性菌株多數(shù)表現(xiàn)出高產(chǎn)的特性，其可能的抗性機理是：生產(chǎn)菌形成大量的桿菌肽和二價鐵離子結(jié)合，將二價鐵離子送出細胞外，從而避免了二價鐵離子對生產(chǎn)菌的毒性作用。
(g) 篩選前體或前體結(jié)構類似物抗性突變株。前體或前體結(jié)構類似物對某些抗生素產(chǎn)生菌的生長有抑制作用，且可抑制或促進抗生素的生物合成。篩選對前體或前體結(jié)構類似物的抗性突變株，可以消除前體結(jié)構類似物對生產(chǎn)菌的生長及其抗生素合成的抑制作用，提高抗生素產(chǎn)量。例如，灰黃霉素發(fā)酵使用氯化物為前體，篩選抗氯化物的突變株，提高了灰黃毒素的產(chǎn)量；以苯氧乙酸為青霉素前體，選用抗苯氧乙酸突變株，提高了青霉素V的發(fā)酵產(chǎn)量；以青霉素的前體纈氨酸、
α-氨基己二酸或半胱氨酸、纈氨酸的結(jié)構類似物，篩選抗性菌株，提高了青霉素的發(fā)酵產(chǎn)量。
依據(jù)前體特性的不同，篩選抗性突變株的增產(chǎn)機理也有所不同。第一類前體是產(chǎn)生菌不能合成或很少合成的化合物，這一類前體通常需要人為地添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中以促進提高抗生素產(chǎn)量或提高抗生素某一組分的產(chǎn)量。例如青霉素側(cè)鏈前體苯氧乙酸、苯乙酸等，這一類前體通常對產(chǎn)生菌的生長具有毒性作用。對這些前體具有抗性的高產(chǎn)菌株可以通過高活性的酰基轉(zhuǎn)移酶將前體摻入青霉素分子的側(cè)鏈中，以合成青霉素，并解除前體對產(chǎn)生菌的毒性，使產(chǎn)生菌在高濃度的毒性前體存在時也能生長。篩選這一類前體的抗性突變株，應注意避免那些由于細胞膜透性下降使前體吸收減少的低產(chǎn)突變株或那些由于加強了對前體氧化分解的低產(chǎn)突變株。第二類前體是產(chǎn)生菌能夠合成但不能大量積累的初級代謝中間產(chǎn)物，發(fā)酵生產(chǎn)中需要在發(fā)酵培養(yǎng)基中補充這一類前體以提高抗生素產(chǎn)量。例如紅霉素發(fā)酵生產(chǎn)中添加丙醇以提高發(fā)酵產(chǎn)量。這一類物質(zhì)過多會干擾產(chǎn)生菌的初級代謝而抑制菌的生長?？剐跃甑脑霎a(chǎn)機理可能在于迅速將丙酸衍生物合成為紅霉素，從而避免丙酸衍生物對初級代謝的干擾作用。第三類前體是初級代謝終產(chǎn)物，這一類前體一般對自身的抗生素合成有反饋調(diào)節(jié)作用，因而難以在細胞內(nèi)大量積累。例如青霉素發(fā)酵生產(chǎn)中纈氨酸反饋抑制乙酰羥酸合成酶，從而抑制了纈氨酸的合成。篩選纈氨酸結(jié)構類似物抗性突變株，可使乙酰羥酸合成酶對纈氨酸的反饋抑制的敏感性減弱，促使細胞的內(nèi)源纈氨酸的濃度增加而提高青霉素產(chǎn)量。
(h) 篩選自身所產(chǎn)的抗生素抗性突變株。某些抗生素產(chǎn)生菌的不同生產(chǎn)能力的菌株，對其自身所產(chǎn)的抗生素的耐受能力不同，高產(chǎn)菌株的耐受能力大于低產(chǎn)菌株。因此，可用自產(chǎn)的抗生素來篩選高產(chǎn)菌株。例如有人把金霉素產(chǎn)生菌多次移種到金霉素濃度不斷提高的培養(yǎng)基中去，最后獲得一株提高生產(chǎn)能力4倍的突變株。此方法在抗生素高產(chǎn)菌株選育中有廣泛應用，青霉素、鏈霉素、慶大霉素等抗生素的產(chǎn)生菌均有用此方法來提高產(chǎn)量的例子。此方法還適用于進一步純化高產(chǎn)菌株。
用于菌種理性化篩選的還有各種類型的突變株，如組成型突變株、消除無益組分的突變株、能有效利用廉價碳源或氮源的突變株、細胞形態(tài)改變更有利于分離提取工藝的突變株、抗噬菌體的突變株等等。這些突變株均有重大的經(jīng)濟價值，而且這些篩選目標雖然不以產(chǎn)量為惟一目標，但突變株所具有的優(yōu)良特性卻往往能導致產(chǎn)量的提高。例如紅霉素生產(chǎn)中的抗噬菌體菌種，其紅霉素產(chǎn)量表現(xiàn)出較大的變異范圍，得到比原種產(chǎn)量高的突變株。這可能是由于發(fā)生了抗噬菌體突變后，動搖了菌種原有的遺傳基礎，使之更容易獲得高產(chǎn)突變株。
?、?突變基因的表現(xiàn)
菌種的發(fā)酵產(chǎn)量決定于菌種的遺傳特性和菌種的培養(yǎng)條件。突變株的遺傳特性改變了，其培養(yǎng)條件也應該作出相應的改變。在菌種選育過程的每個階段，都需不斷改進培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，以鑒別帶有新特點的突變株，尋找符合生產(chǎn)上某些特殊要求的菌株。高產(chǎn)菌株被篩選出來以后，要進行最佳發(fā)酵條件的研究，使高產(chǎn)基因能在生產(chǎn)規(guī)模上得以表達。例如，誘變處理四環(huán)素產(chǎn)生菌得到的突變株，在原培養(yǎng)基上與出發(fā)菌株相比較，發(fā)酵單位的提高并不明顯，但是在原培養(yǎng)基配方中增加碳、氮濃度，調(diào)整磷的濃度，該菌株就表現(xiàn)出代謝速度快、發(fā)酵產(chǎn)量高的特性。用該菌株進行生產(chǎn)，并采用通氨補料的工藝來適應該突變株代謝速度快的特點，使產(chǎn)量有了新的突破。
