糖尿病的危害不僅僅是血糖升高，更嚴(yán)重的是由高血糖導(dǎo)致的一系列糖尿病并發(fā)癥。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞外泌體對(duì)糖尿病并發(fā)癥的治療具有一定的作用，給糖尿病并發(fā)癥的治療帶來(lái)了曙光。近期，來(lái)自中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院的徐向進(jìn)教授2021年7月2～3日在山東濟(jì)南召開(kāi)的“中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)糖尿病胰島調(diào)控與再生醫(yī)學(xué)學(xué)組2021年學(xué)術(shù)年會(huì)”上詳細(xì)介紹了干細(xì)胞外泌體在糖尿病并發(fā)癥中的應(yīng)用進(jìn)展及前景。
什么是干細(xì)胞?
01
干細(xì)胞概述
干細(xì)胞具有無(wú)限增殖能力、多向分化潛能、分泌多種活化因子、調(diào)節(jié)微環(huán)境、活化內(nèi)源性祖細(xì)胞等特性。干細(xì)胞在細(xì)胞替代治療、發(fā)育生物學(xué)等領(lǐng)域的研究中有著獨(dú)特的作用和優(yōu)越性 [1]。
02
干細(xì)胞可用于治療疾病
1999年，干細(xì)胞研究被美國(guó)《科學(xué)》雜志評(píng)為當(dāng)年世界十大科學(xué)成就之首，干細(xì)胞技術(shù)隨即成為社會(huì)各界普遍關(guān)注的熱門議題。干細(xì)胞治療已經(jīng)在皮膚、心臟、眼睛、骨骼肌、神經(jīng)組織、胰腺、血液等方面建立起了相應(yīng)的疾病模型。目前干細(xì)胞可能治療的疾病有：糖尿病及其并發(fā)癥、阿爾茨海默病、心血管疾病、腦卒中、急慢性胰腺炎、皮膚創(chuàng)傷、皮膚衰老、各種癌癥等。
03
干細(xì)胞治療T2DM的動(dòng)物研究
研究表明 [2~3]，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（HUC-MSCs）對(duì)T2DM大鼠胰島功能改善的作用機(jī)制可能與下調(diào)TLR4及NF-κB炎癥信號(hào)通路相關(guān)，利拉魯肽聯(lián)合HUC-MSCs干預(yù)對(duì)T2DM大鼠的糖代謝及胰島分泌功能具有改善作用，HUC-MSCs移植通過(guò)介導(dǎo)T2DM大鼠ASK1/JNK/BAX通路抑制胰島細(xì)胞凋亡。
04
干細(xì)胞治療T2DM的臨床研究
在基礎(chǔ)研究的基礎(chǔ)上，研究者也對(duì)部分2型糖尿病患者進(jìn)行了臨床觀察 [2]，共納入12例男性T2DM，年齡55~65歲，病程＞10年，服用磺脲類、二甲雙胍聯(lián)合預(yù)混或基礎(chǔ)胰島素類似物治療并維持穩(wěn)定至少6個(gè)月，并進(jìn)一步加用GLP-1受體激動(dòng)劑利拉魯肽治療6個(gè)月后，血糖仍控制不達(dá)標(biāo)。受試者分為兩組：A組（n=6）為利拉魯肽聯(lián)合HUC-MSCs假移植組；B組（n=6）為利拉魯肽聯(lián)合HUC-MSCs移植組，隨訪觀察24周，結(jié)果顯示，HUC-MSCs對(duì)T2DM患者的糖代謝和胰島功能有顯著改善作用。
05
干細(xì)胞治療糖尿病的前景 [4]
干細(xì)胞針對(duì)糖尿病發(fā)病的核心——胰島功能細(xì)胞。實(shí)體器官胰腺移植或胰島移植，理論上可實(shí)現(xiàn)胰島結(jié)構(gòu)恢復(fù)和代謝功能，但由于胰島組織的來(lái)源有限、手術(shù)創(chuàng)傷大、術(shù)后并發(fā)癥、免疫排斥等一系列問(wèn)題，難以作為糖尿病治療的常規(guī)手段。干細(xì)胞來(lái)源的胰島素分泌細(xì)胞可創(chuàng)造無(wú)限數(shù)量的β細(xì)胞替代，適合于廣泛應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)治愈糖尿病目的，是目前糖尿病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。但干細(xì)胞治療糖尿病的關(guān)鍵技術(shù)和核心問(wèn)題仍有待深入研究和克服。
06
干細(xì)胞治療糖尿病的挑戰(zhàn)
胰島細(xì)胞治療中存在的免疫問(wèn)題；
如何保證穩(wěn)定的細(xì)胞來(lái)源和足夠的移植細(xì)胞量；
如何獲得維持細(xì)胞活性的細(xì)胞保存技術(shù)；
如何保證干細(xì)胞移植治療的安全性；
如何有效提高干細(xì)胞治療的治療效果，急需尋找安全、有效的方式克服以上問(wèn)題。
什么是外泌體?
01
外泌體概述
細(xì)胞外囊泡是機(jī)體遠(yuǎn)距離細(xì)胞間交流的一種手段，目前主要被分為3大類：外泌體、微囊泡和凋亡小體，臨床研究中主要關(guān)注的是外泌體（圖1）。外泌體是一種直徑為25~200nm的納米級(jí)脂質(zhì)包裹體結(jié)構(gòu)，富含RNA和蛋白質(zhì)。1983年，外泌體首次于綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。1987年，Johnstone將其命名為"exosome"，外泌體由細(xì)胞分泌釋放出來(lái)，在血液等體液內(nèi)傳播，之后又可被其他細(xì)胞吞噬，是細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì)，來(lái)源于不同組織的外泌體不僅具有其特異性蛋白分子，還包含其行使功能的關(guān)鍵分子 [5]。
圖1. 外泌體形成及組成示意圖
02
干細(xì)胞外泌體
干細(xì)胞外泌體，是一種能被大多數(shù)干細(xì)胞分泌的微小囊泡，外泌體通過(guò)胞吐作用從干細(xì)胞中釋放，復(fù)雜的混合因子能作為信號(hào)分子傳遞給其他細(xì)胞，從而改變其他細(xì)胞的功能；外泌體是干細(xì)胞旁分泌作用的主要介質(zhì)，它們的內(nèi)容物包含mRNA、microRNA、各種抗凋亡和促血管生成因子等；外泌體被包裹在堅(jiān)硬的雙層膜中，雙層膜保護(hù)外泌體的內(nèi)容物，使外泌體能夠在組織中長(zhǎng)距離移動(dòng)。干細(xì)胞外泌體因在組織中的增殖、遷移、再生和炎癥等方面的作用，有望成為“無(wú)細(xì)胞的細(xì)胞治療”工具。
03
干細(xì)胞外泌體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的方式 [6]
直接作用： 外泌體表面的蛋白分子或脂質(zhì)配體直接激活靶細(xì)胞表面的受體，產(chǎn)生信號(hào)復(fù)合體并激活胞內(nèi)信號(hào)通路；
遞送作用： 外泌體可以與靶細(xì)胞的質(zhì)膜融合或內(nèi)吞直接進(jìn)入細(xì)胞，將自身攜帶的蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等活性分子帶到細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的功能及生物學(xué)行為。
04
干細(xì)胞外泌體的分離方法 [6]:
超速離心法（最標(biāo)準(zhǔn)、常用）：包括100000G超速離心法和連續(xù)梯度蔗糖密度梯度離心法兩種。100000G超速離心法的優(yōu)勢(shì)是簡(jiǎn)單實(shí)用，劣勢(shì)是樣本小、反復(fù)高速離心導(dǎo)致外泌體破裂影響質(zhì)量；連續(xù)梯度蔗糖密度梯度離心法的優(yōu)勢(shì)是所獲外泌體純度高，劣勢(shì)是難以去除高密度化學(xué)物，不適合臨床應(yīng)用。
超濾法：用孔徑小于100nm的超濾膜低速離心分離得到外泌體。優(yōu)勢(shì)：快速；劣勢(shì)：超濾時(shí)施加的壓力大，導(dǎo)致體積大的囊泡變形和破裂。
異性蛋白的抗體分離法：優(yōu)勢(shì)：特異性高、精準(zhǔn)分離；劣勢(shì)：技術(shù)難度大。
聚合物沉淀法：基于聚乙二醇（PEG6000）等聚合物沉淀的方法。
聲流體裝置分離法：將微流控技術(shù)和聲學(xué)結(jié)合，首先，利用較低頻率聲波去除血液中尺寸較大的紅細(xì)胞、白細(xì)胞以及血小板等；然后采用較高頻率的聲波將外泌體與細(xì)胞外囊泡亞組成分（凋亡小體、較大的細(xì)胞外囊泡等）進(jìn)行分離，并在通道的指定出口對(duì)外泌體進(jìn)行收集。
05
干細(xì)胞外泌體VS干細(xì)胞：干細(xì)胞外泌體與干細(xì)胞相比具有諸多優(yōu)勢(shì) [7]
效果好：可直接與靶細(xì)胞發(fā)生融合進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，作用效率更高；
性質(zhì)更穩(wěn)定：外泌體可保護(hù)其內(nèi)容物免于降解，從而防止某些活性成分快速降解；
保存運(yùn)輸更方便：外泌體在-20°C下儲(chǔ)存6個(gè)月、-80°C長(zhǎng)期保存，同時(shí)不會(huì)損失其生化活性；
可量產(chǎn)：外泌體可在培養(yǎng)基內(nèi)大量富集；
可控制：外泌體功能可通過(guò)改變細(xì)胞環(huán)境來(lái)改變；沒(méi)有移植細(xì)胞帶來(lái)的免疫排斥反應(yīng)和腫瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)；
免疫原性低：外泌體比細(xì)胞具有更低的免疫原性，更容易地開(kāi)發(fā)“貨架”產(chǎn)品。
干細(xì)胞外泌體治療糖尿病及并發(fā)癥的機(jī)制及應(yīng)用
01
干細(xì)胞外泌體治療糖尿病的細(xì)胞研究
研究表明 [8]，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）外泌體可促進(jìn)低氧條件下的小鼠胰島內(nèi)皮細(xì)胞血管生成，其機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào) HIF1-α，調(diào)節(jié) VEGF 表達(dá)，激活 mTOR 信號(hào)通路，促進(jìn)胰島內(nèi)皮細(xì)胞血管生成。另一項(xiàng)研究表明 [9]，利用hucMSC-ex來(lái)減輕HFD和STZ誘導(dǎo)的T2DM大鼠模型具有可行性和有效性；靜脈輸注人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體（hucMSC-ex）可以通過(guò)增強(qiáng)外周器官胰島素敏感性和減輕胰島破壞來(lái)降低T2DM大鼠的血糖水平；hucMSC-ex可以通過(guò)促進(jìn)肌肉中GLUT4的表達(dá)和膜轉(zhuǎn)運(yùn)以及依賴于胰島素的肝糖原儲(chǔ)存來(lái)恢復(fù)T2DM的葡萄糖穩(wěn)態(tài)；hucMSC-ex通過(guò)抑制β細(xì)胞凋亡來(lái)緩解T2DM中的胰島素分泌功能障礙。
02
干細(xì)胞外泌體治療糖尿病的機(jī)制
目前已發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞來(lái)源外泌體可用于修復(fù)或預(yù)防糖尿病造成的損傷，其免疫調(diào)節(jié)和修復(fù)特性可以保護(hù)甚至恢復(fù)早期糖尿病患者的原始胰島免受自身免疫破壞，并且可能抑制胰島移植的排斥反應(yīng)。MSC外泌體可以通過(guò)多種渠道在T2DM中發(fā)揮作用（圖2）。
圖2.人體充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體對(duì)2型糖尿病的作用示意圖
03
干細(xì)胞外泌體治療糖尿病慢性皮膚創(chuàng)傷
皮膚創(chuàng)傷是糖尿病常見(jiàn)的并發(fā)癥，會(huì)使肌膚屏障受損。近年來(lái)的研究表明，干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)中具有巨大的治療潛力，通過(guò)分泌抗炎、抗纖維化和促血管生成活性的因子，如可溶性分子（生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子）或細(xì)胞外囊泡（微粒子、外泌體）等來(lái)改善創(chuàng)面愈合過(guò)程，尤其是干細(xì)胞外泌體，表現(xiàn)出強(qiáng)大的皮膚修復(fù)作用。一項(xiàng)探究尿源性干細(xì)胞外泌體對(duì)鏈脲菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的傷口愈合影響的研究 [10]表明, 人尿源干細(xì)胞釋放外泌體攜帶DMBT1通過(guò)促進(jìn)血管生成來(lái)促進(jìn)糖尿病性創(chuàng)傷修復(fù)。另一項(xiàng)研究表明 [11]，來(lái)自MSC外泌體可以加速真皮成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移和增殖，并激活A(yù)KT通路，改善皮膚細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞）的遷移和增殖。
04
干細(xì)胞外泌體治療糖尿病足
以糖尿病足為代表的糖尿病慢性創(chuàng)面并發(fā)癥是最嚴(yán)重、花費(fèi)最多、致死致殘率最高的糖尿病慢性并發(fā)癥之一。傳統(tǒng)治療方案如局部清創(chuàng)換藥、負(fù)壓創(chuàng)面治療、經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)等存在治療效果欠佳、治療適應(yīng)證狹窄等缺陷，導(dǎo)致我國(guó)目前糖尿病足病的治療存在保肢率低、治療時(shí)間長(zhǎng)、花費(fèi)高等一系列亟需解決的問(wèn)題。因此，如何促進(jìn)糖尿病慢性創(chuàng)面愈合、降低截肢率、提高患者生存率已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者共同的研究目標(biāo)。研究表明 [12]，脂多糖預(yù)處理的MSC衍生的外泌體可促進(jìn)糖尿病皮膚傷口的愈合。MSC外泌體在糖尿病創(chuàng)面愈合以及糖尿病足中的作用機(jī)制如下圖所示（圖3）。
圖3. MSC外泌體在糖尿病創(chuàng)面愈合以及糖尿病足中的作用機(jī)制
05
干細(xì)胞外泌體治療糖尿病腎病
糖尿病腎病或慢性腎臟疾病是糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，干細(xì)胞在T2DM大鼠模型的腎損傷中均可起到有效的腎臟保護(hù)作用，表現(xiàn)為輸注干細(xì)胞后，血肌酐、尿素氮以及尿微量白蛋白/ 肌酐降低，腎小球硬化和腎臟纖維化等病理改變均有一定程度緩解，但具體作用機(jī)制尚未明確，目前研究發(fā)現(xiàn)可能的機(jī)制包括 [13]：促進(jìn)新生血管形成、營(yíng)養(yǎng)作用、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗氧化應(yīng)激等。
06
干細(xì)胞外泌體治療糖尿病心血管疾病 [14~15]
外泌體被證明是有效的生物信號(hào)傳遞者，涉及正常心臟生理以及疾病中控制心臟功能的多個(gè)過(guò)程。干細(xì)胞外泌體的心臟保護(hù)機(jī)制為研究熱點(diǎn)，干細(xì)胞外泌體具有與干細(xì)胞相似的心臟保護(hù)功能。MSC外泌體能顯著提高心肌細(xì)胞的存活率、并能抗心肌細(xì)胞損傷、促進(jìn)新生血管形成、改善心臟功能，其機(jī)制可能與抑制TGF-β1/Smad2信號(hào)通路有關(guān)。干細(xì)胞外泌體具有較好的穩(wěn)定性，較少引起受體細(xì)胞的突變以及免疫排斥反應(yīng)，有望成為治療糖尿病心血管疾病的有效方法。
此外，干細(xì)胞外泌體還在糖尿病并發(fā)癥其他領(lǐng)域（如：糖尿病神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥、阿爾茨海默病等）進(jìn)行著相關(guān)研究。
干細(xì)胞外泌體治療糖尿病及其并發(fā)癥的展望
01
干細(xì)胞外泌體臨床研究廣泛
目前已有關(guān)于干細(xì)胞外泌體治療疾病的相關(guān)研究包括：2型糖尿病、炎性腸病、皮膚傷口愈合、腎臟疾病、肝臟疾病、移植物抗宿主病等十多種疾病。常見(jiàn)疾病的前景及機(jī)制如（圖4）。截止于2021年1月， 干細(xì)胞外泌體治療共有16項(xiàng)注冊(cè)臨床試驗(yàn) [16]，包括自身免疫性疾病（4項(xiàng)）、心血管疾病（1項(xiàng)）、皮膚傷口愈合（2項(xiàng)）、神經(jīng)系統(tǒng)疾病（3項(xiàng)）、腫瘤（1項(xiàng)）、COVID-19（5項(xiàng)）。
圖4.外泌體臨床應(yīng)用前景及相關(guān)機(jī)制
02
干細(xì)胞外泌體在糖尿病及其并發(fā)癥的應(yīng)用前景及挑戰(zhàn)并存
前景： 糖尿病及其并發(fā)癥的治療中，外泌體可以避免干細(xì)胞治療的一些缺陷（免疫排斥、倫理問(wèn)題等），并且外泌體具有高穩(wěn)定性、易于儲(chǔ)存、無(wú)需增殖、便于定量使用以及向損傷處聚集等優(yōu)勢(shì)。外泌體因包含多種蛋白和RNA，與某種單一的細(xì)胞因子相比，具有較高的安全性和更大的組織再生潛能，因此，干細(xì)胞外泌體在糖尿病及其并發(fā)癥的治療中具有極大優(yōu)勢(shì)。
挑戰(zhàn)： 外泌體的提取方法及其復(fù)雜的分類系統(tǒng)阻礙了它的應(yīng)用，外泌體高效提存技術(shù)成為臨床應(yīng)用前的有待解決的重要問(wèn)題。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)局部注射干細(xì)胞外泌體后損傷處外泌體的濃度未知，外泌體促進(jìn)胰腺或其他組織再生或者免疫調(diào)節(jié)時(shí)的最佳濃度、半衰期需要更深入的研究。由不同細(xì)胞或者同一細(xì)胞不同生理狀態(tài)下分泌的外泌體可能存在差異，外泌體發(fā)揮作用的內(nèi)容物及機(jī)制有待進(jìn)一步探索。外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)多種生物分子，如何在體內(nèi)調(diào)節(jié)受體細(xì)胞、改變細(xì)胞的具體機(jī)制尚未闡明，需要進(jìn)一步的深入探索及研究。
總結(jié)
糖尿病發(fā)病率不斷攀升，糖尿病并發(fā)癥也逐年增加。相信隨著研究的不斷深入和臨床技術(shù)的不斷成熟，未來(lái)干細(xì)胞外泌體在治療糖尿病并發(fā)癥的作用會(huì)被更加廣泛的證實(shí)，成為糖尿病并發(fā)癥治療的又一武器。
專家簡(jiǎn)介
徐向進(jìn)
教授，博士研究生導(dǎo)師
中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第900醫(yī)院內(nèi)分泌科主任醫(yī)師
中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)常委
中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)糖尿病胰島調(diào)控與再生醫(yī)學(xué)學(xué)組組長(zhǎng)
全軍內(nèi)分泌專業(yè)委員會(huì)副主任委員
福建省醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)主任委員
福建省醫(yī)師協(xié)會(huì)內(nèi)分泌代謝科醫(yī)師分會(huì)副主任委員
福建省醫(yī)學(xué)會(huì)內(nèi)分泌學(xué)分會(huì)常委
《中華內(nèi)科雜志》、《中華糖尿病雜志》、 《 中 華內(nèi)分 泌代謝雜志》《國(guó)際內(nèi)分泌代謝雜志》等雜志編委和通信編委
參考文獻(xiàn)
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