摘 要：角蛋白作為家禽加工和農(nóng)業(yè)廢棄物的主要成分，因其結(jié)構(gòu)中富含能抵抗普通蛋白酶和化學(xué)催化劑降解的穩(wěn)定交聯(lián)二硫鍵而難以被利用，因此每年都在環(huán)境中大量積累，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。微生物角蛋白酶可將角蛋白廢棄物轉(zhuǎn)化為可再次利用的產(chǎn)物，帶來了經(jīng)濟的可行性及環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展。本文主要綜述了角蛋白酶的生物化學(xué)特性、角蛋白酶的基本結(jié)構(gòu)及其表達特性，總結(jié)了其應(yīng)用價值及角蛋白降解機制，最后展望了微生物角蛋白酶的進一步研究方向。

角蛋白主要存在于哺乳動物、兩棲動物、爬行動物和鳥類的表皮中，其是形成蹄、指甲、角、喙、羽毛、爪、毛發(fā)和人類皮膚外層的主要結(jié)構(gòu)，包含較多的二硫鍵、氫鍵和疏水作用力，具有化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、不溶于水及難降解的特點。數(shù)百萬噸的羽毛由于自然堆積時降解緩慢，附著的糞便、血液等含氮磷物質(zhì)也易成為其他致病菌的營養(yǎng)源，處理不當(dāng)將造成環(huán)境污染，這些“難降解”的角蛋白處置和管理方式是家禽養(yǎng)殖場、屠宰場等行業(yè)面臨的主要問題之一。但從另一方面來說羽毛等角蛋白廢棄物中含有豐富的蛋白質(zhì)，其中粗蛋白含量在80%以上，角蛋白還含有大量動植物生長必需的氨基酸，如胱氨酸、賴氨酸、脯氨酸等，含量可達氨基酸總量的70%。目前工業(yè)上常用填埋法、物理法和化學(xué)法處理廢棄羽毛，但具有環(huán)境污染嚴(yán)重、必需氨基酸破壞、耗能高等缺點。此外，由于人類皮膚病原真菌很多是嗜角蛋白真菌，如毛癬菌屬(Trichophyton)、小孢子菌屬(Microsporum)及表皮癬菌屬(Epidermophyton)等，隨意丟棄羽毛會使環(huán)境中富集這類病原真菌，極大地增加人類疾病的發(fā)生概率。因此，迫切需要一種新型環(huán)保的生物催化劑來降解角蛋白。鑒于這一事實，微生物角蛋白酶作為一種有效的生物降解法引起了人們的關(guān)注，因其低成本、易獲得和無污染的特性已被應(yīng)用于皮革、紡織、制藥等工業(yè)領(lǐng)域。角蛋白酶的微生物來源廣泛、性質(zhì)各異，因此，選擇合適微生物來源的角蛋白酶用于工業(yè)生產(chǎn)意義重大。

產(chǎn)角蛋白酶的微生物分布于不同生境中，尤其在羽毛傾倒場、家禽廢物、屠宰場廢物等生境中較為豐富。目前已報道的產(chǎn)角蛋白酶的微生物主要是細菌和真菌，如蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)、枯草芽孢桿菌(B. subtilis)、地衣芽孢桿菌(B. licheniformis)等，它們產(chǎn)生的熱穩(wěn)定角蛋白酶具有活性較高、分解羽毛效果好的特點；已報道的產(chǎn)角蛋白酶放線菌主要是鏈霉菌屬(Streptomyces)菌株 ， 如白色鏈霉菌(Str. albus)、弗氏鏈霉菌(Str. fradiae)、革蘭氏鏈霉菌(Str. graminofaciens)、熱硝化鏈霉菌(Str.thermonitrificans) 和 古 巴 爾 古 鏈 霉 菌 (Str.gulbarguensis)等，它們能利用不同的角蛋白底物產(chǎn)生角蛋白酶。最早發(fā)現(xiàn)的角蛋白酶來源于真菌——馬爪甲團囊菌(Onygena equina)，隨后越來越多能產(chǎn)生角蛋白酶的真菌被報道，如小孢子菌屬(Microsporum)、金孢霉屬(Chrysosporium)、地絲霉屬(Geomyces)、毛癬菌屬(Trichophyton)、枝頂孢屬(Acremonium)、擬青霉屬(Paecilomyces)和側(cè)齒霉屬(Engyodontium)等。某些真菌角蛋白酶能破壞動物及人體皮膚外層角蛋白，從而引起頭癬、體癬和腳癬等皮膚類疾病；此外，由于真菌產(chǎn)生的角蛋白酶生物化學(xué)性質(zhì)多樣，已備受關(guān)注?；诖耍疚闹饕C述了不同微生物角蛋白酶的生化特性、分子生物學(xué)特性，并對微生物角蛋白酶的應(yīng)用進行了介紹，以期為角蛋白酶的相關(guān)研究提供參考。

1 角蛋白酶的生物化學(xué)特性

1.1 一般特性

角蛋白酶的特性因微生物的來源而異。多數(shù)微生物角蛋白酶是中性或堿性蛋白酶，pH在7.5?9.0之間，一些角蛋白酶在極端堿性或微酸性條件下也具有最佳活性。少數(shù)角蛋白酶在很寬的 pH 范圍內(nèi)也能保持活性穩(wěn)定。如擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)strain TOA-1，所產(chǎn)角蛋白酶能在30°C、pH1.5?12.0范圍內(nèi)保持酶活性24 h。

角蛋白酶的作用溫度與來源微生物的生存環(huán)境有關(guān)，多數(shù)微生物來源的角蛋白酶最適溫度在40?70 °C 之間。一株嗜熱厭氧菌閃爍桿菌屬(Fervidobacterium sp.)角蛋白酶最適溫度是80°C，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophila)DHHJ的角蛋白酶在40°C活性最大；在一些特殊條件下，來源于海島閃爍桿菌(F. islandicum)AW-1角蛋白酶的最佳活性為100°C。角蛋白酶的分子量范圍是18?240kD，但大多數(shù)角蛋白酶的分子量小于50kD。多數(shù)角蛋白酶是單體酶，也存在多聚角蛋白酶，有些角蛋白酶的分子量高達440kD，詳見表1。

表1  幾種微生物角蛋白酶的生物化學(xué)性質(zhì)

1.2 底物特異性

底物特異性是定義“角蛋白酶”的主要標(biāo)準(zhǔn)之一。角蛋白酶能有效水解酪蛋白、明膠、牛血清白蛋白等可溶性蛋白底物，也能水解羽毛、羊毛、指甲等不溶性蛋白底物。有研究者提出將 K:C(Keratinolytic:Caseinolytic)活性的比率作為參數(shù)來判斷某種酶作為角蛋白酶的潛力，即在標(biāo)準(zhǔn)條件下，用羽毛角蛋白作為角蛋白分解活性底物，酪蛋白作為酪蛋白分解活性底物 。K:C=0.5 被認(rèn)為是角蛋白酶的理想比率，K:C>0.5 是一種潛在的角蛋白酶，K:C<0.5 是非角蛋白酶。另外，角蛋白酶區(qū)別于其他蛋白酶的一個顯著特征就是能夠切割疏水性和芳香族氨基酸。角蛋白酶的底物特異性可通過胰島素氧化 B 鏈水解得到證實(圖 1)。胰島素 B 鏈由大量疏水氨基酸殘基組成，還含有幾個帶電荷的側(cè)鏈殘基，半胱氨酸殘基被氧化后能產(chǎn)生 2 個額外的負電荷，來自Thermophilic sp. VC13 的角蛋白酶在氧化半胱氨酸裂解后水解肽鍵；Doratomyces microsporus 角蛋白酶表現(xiàn)出廣泛的特異性，切割位點與蛋白酶 K 的切割位點相似，對亮氨酸(L)、纈氨酸(V)、酪氨酸(Y)和苯丙氨酸(F)的P1位點上的疏水和芳香氨基酸具有優(yōu)先選擇性。據(jù)報道，真菌 D. microsporus 角蛋白酶的切割位點最多，有 19 個。

圖1  胰島素B鏈水解顯示多種角蛋白酶的裂解位點

1.3 抑制劑、金屬離子、有機溶劑、非離子洗滌劑和還原劑的作用

根據(jù)催化類型，角蛋白酶主要分為絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶。絲氨酸蛋白酶能被苯甲基磺酰氟(Phenylmethylsulfonyl Fluoride，PMSF)強烈抑制，金屬蛋白酶活性中心含有金屬離子(Ca²⁺、Zn²⁺)，能被乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)和1,10-鄰菲羅啉抑制。Streptomycessp.角蛋白酶被PMSF和EDTA抑制，因此被鑒定為絲氨酸金屬蛋白酶。不同金屬離子對角蛋白酶活性影響各異。一些金屬離子會對角蛋白酶活性起促進作用，如Ca²⁺、Mg²⁺能增強角蛋白酶的活性，Fe²⁺及Fe³⁺能提高酶活力，有研究表明Fe²⁺能增加嗜角蛋白金孢霉(C. keratinophilum)角蛋白酶活性。一些過渡金屬離子及重金屬離子Cu⁺、Hg²⁺、Ag⁺、Pb⁺、Zn²⁺、Ba²⁺、Co⁺可能會抑制角蛋白酶的活性，這與金屬離子和底物競爭酶分子的活性位點有關(guān)。5 mmol/L的K⁺、Ca²⁺、Cu²⁺能提高B. subtilisY3-4角蛋白酶的活性，其中，Cu²⁺提高了其25%的酶活力，而5 mmol/L的Zn²⁺、Ba²⁺、Co⁺、Ni²⁺、Mn²⁺明顯降低了該菌株角蛋白酶活性，Co⁺、Ni²⁺抑制了其 40%左右的酶活，而同樣濃度的Sr²⁺、Li⁺、Na⁺、Mg²⁺則沒有顯著性影響。非離子洗滌劑和溶劑對角蛋白酶活性具有抑制、激發(fā)或穩(wěn)定的作用。角蛋白酶通常在有機溶劑、SDS、DMSO、Triton X-100 中是穩(wěn)定存在的。

對于嗜麥芽窄食單胞菌(Ste. maltophilia)菌株BBE11-1分泌的 3 種角蛋白酶中的K1、K2來說，非離子去垢劑Triton X-100和吐溫-20促進角蛋白酶活性，而離子型去垢劑SDS顯著抑制其活性。據(jù)報道，還原劑如二硫蘇糖醇(Dithiothreitol，DTT)、β-巰基乙醇(β-Mercaptoethanol，β-ME)、還原型谷胱甘肽、半胱氨酸和亞硫酸鈉能增強角蛋白酶的活性，表明這些酶能夠被硫醇激活，對于B.licheniformis MUK3所分泌的角蛋白酶，還原劑DTT和β-ME使角蛋白酶活性增加49%?73%。事實上，還原劑通過破壞二硫鍵來促進角蛋白酶的水解，體外純化的角蛋白酶只有通過加入還原劑才能發(fā)揮降解作用。

2 角蛋白酶的分子生物學(xué)特性

2.1 角蛋白酶結(jié)構(gòu)特性

對角蛋白酶核苷酸序列的研究，有助于解釋其結(jié)構(gòu)-功能的關(guān)系。多數(shù)微生物角蛋白酶與枯草桿菌蛋白酶有很高的序列同源性。目前，已有部分菌株的角蛋白酶基因成功克隆并測序，如地衣芽孢桿菌 PWD-1、鏈霉菌 SCUT-3、發(fā)癬菌KERB等，其中，以地衣芽孢桿菌角蛋白酶研究最為深入。除了少數(shù)角蛋白酶基因序列，多數(shù)角蛋白酶氮端區(qū)域(AQTVPY)高度保守。地衣芽孢桿菌PWD-1角蛋白酶的氮端序列與Subtilisin Carlsberg相同(表2)，他們同屬于絲氨酸蛋白酶家族，其編碼的基因kerA與Subtilisin Carlsberg相似性達 99%，與SubtilisinE、Subtilisin BPN相似性為65%，與Fervidolysin相似性為30%。盡管F. pennavorans產(chǎn)生的嗜熱角蛋白酶N端氨基酸序列與枯草桿菌蛋白酶不同，但其活性位點區(qū)域與枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶類似。真菌角蛋白酶 N 端氨基酸序列的比較表明它們與枯草桿菌蛋白酶的關(guān)系比放線菌角蛋白酶的關(guān)系更密切。來自鏈霉菌的角蛋白酶更接近灰色鏈霉菌(Str. griseus)蛋白酶B，后者是鏈霉素蛋白酶的主要成分。來自銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)的角蛋白酶N端氨基酸序列顯示出與其他微生物角蛋白酶的相似性較小。

Wu等報道了臺灣亞棲熱菌 (Meiothermustaiwanensis)WR-220角蛋白酶MtaKer 1.50 ? 晶體結(jié)構(gòu)，其由信號肽、N端前肽和成熟蛋白酶3部分組成，該酶是由Asp39、His72 和 Ser224殘基組成的高度保守的催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)，并且在成熟的rMtaKer 結(jié)構(gòu)中還發(fā)現(xiàn)了 2 個鈣離子結(jié)合位點及 2 個二硫鍵，其中，鈣離子對蛋白質(zhì)正確折疊和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定起著重要作用，二硫鍵可以增強該蛋白的熱穩(wěn)定性，由 Ser130-Leu131-Gly132組成的 S1 結(jié)合口袋是角蛋白酶與底物的結(jié)合位點。Kim等分析了F.pennivorans 1.7 ? 角蛋白酶晶體結(jié)構(gòu)，其由 1 個催化結(jié)構(gòu)域、1個前肽結(jié)構(gòu)域和2個β-三明治結(jié)構(gòu)域組成；其催化結(jié)構(gòu)域與枯草芽孢桿菌蛋白酶類似，其中，催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)的鈣結(jié)合位點與 Subtilisin E 完全一致，高分子量的角蛋白酶可能由多結(jié)構(gòu)域或寡聚蛋白酶組成，這種多結(jié)構(gòu)域 Fervidolysin 晶體結(jié)構(gòu)為深入了解酶原激活和非催化結(jié)構(gòu)域作用提供了依據(jù)。

表 2 角蛋白酶及枯草桿菌蛋白酶 N 端氨基酸序列的比較

2.2 角蛋白酶氨基酸序列分子進化樹

使用MEGA 6.0軟件中鄰接(Neighbor-Joining，NJ)法構(gòu)建部分角蛋白酶的系統(tǒng)發(fā)育樹。其中15個角蛋白酶的氨基酸序列從NCBI下載，發(fā)癬菌KERB氨基酸序列從文獻獲得，他們均有角蛋白酶活性。從圖2可以看出這些角蛋白酶分為2個簇，第一個簇屬于S8蛋白酶家族，其中，Actinomadura keratinilytica和Str. albidoflavus來源的角蛋白酶獨立于其他分支，第二個簇中P. aeruginosa  KS-1 KP1屬于M28蛋白酶家族，P. aeruginosa KS-1 KP2屬于M4蛋白酶家族，雖然他們都來源于P. aeruginosa KS-1菌株，但親緣關(guān)系十分疏遠。P.aeruginosa角蛋白酶獨立于其他角蛋白酶，從而擴大了角蛋白酶的范圍。據(jù)文獻報道，S8蛋白酶家族成員通過催化三聯(lián)體機制工作，Asp、His和Ser的催化三聯(lián)體及含氧陰離子空穴Asn(N)周圍的區(qū)域在角蛋白酶中都是高度保守的。可對這些保守區(qū)域設(shè)計通用引物來克隆新的角蛋白酶。

圖2  部分角蛋白酶氨基酸序列分子系統(tǒng)樹

注：分支上的數(shù)據(jù)表示 Bootstrap 檢驗的支持百分率，自展支持值(Bootstrap)≥50%的顯示在各個進化分支節(jié)點上；括號內(nèi)的GenBank 登錄號。

2.3 角蛋白酶的異源表達

隨著越來越多的角蛋白酶基因被鑒定出來，角蛋白酶在工程表達系統(tǒng)中的異源表達引起了人們的極大關(guān)注。大腸桿菌由于生長迅速、易于操作、遺傳背景簡單等優(yōu)點，是最常用的表達宿主，來源于Ste. maltophilia BBE11-1的2個角蛋白酶基因kerSMD和kerSMF在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達，P.aeruginosa KS-1的角蛋白酶基因kerP在HB101 中成功表達。但大腸桿菌表達系統(tǒng)仍存在一些問題，如形成無活性的包涵體和分泌效率低，角蛋白酶在宿主細胞中的大量累積會導(dǎo)致細胞毒性和不正確的蛋白質(zhì)折疊，最終導(dǎo)致細胞溶解和目標(biāo)蛋白前體失活。芽孢桿菌因具有外源蛋白易分泌到胞外、易分離純化、無致病性等優(yōu)勢而被廣泛研究。B.licheniformis PWD-1角蛋白酶基因kerA首次在枯草芽孢桿菌DB104中表達，Radha等在巨大芽孢桿菌MS941和巨大芽孢桿菌ATCC14945中實現(xiàn)了B.licheniformis MKU3角蛋白酶基因的穩(wěn)定表達。但是多余的內(nèi)源蛋白酶及質(zhì)粒的不穩(wěn)定性是芽孢桿菌表達系統(tǒng)面臨的主要問題。畢赤酵母因具有完善的分泌表達體系，能將外源蛋白完全分泌至胞外，并且具有外源蛋白翻譯后修飾功能，更適用于真核生物角蛋白酶基因的表達。來自 Aspergillus fumigatus 和 P.aeruginosa的角蛋白酶基因在畢赤酵母SMD1165和畢赤酵母SMD1168H中成功表達。但畢赤酵母系統(tǒng)中的表達水平強烈依賴于密碼子使用偏好性，Hu等實現(xiàn)了B.licheniformis S90的角蛋白酶在畢赤酵母中的表達，并且與在大腸桿菌系統(tǒng)中的表達相比，通過密碼子優(yōu)化策略提高了12倍的角蛋白酶產(chǎn)量。人們也在嘗試將新型宿主用于角蛋白酶的表達，昆蟲細胞桿狀病毒表達載體系統(tǒng)(Baculovirus Expression Vector System，BEVS)具有高水平的細胞內(nèi)表達、對外源基因翻譯后修飾充分、生物安全性好的優(yōu)勢，已被廣泛用于醫(yī)學(xué)研究、藥物研發(fā)、疫苗生產(chǎn)等眾多領(lǐng)域。Huang等首次使用昆蟲細胞 Spodoptera frugiperda (sf9)成功表達了來自B. licheniformis PWD-1的角蛋白酶基因，酶活635 U/mg，這為人們選擇表達宿主提供了新思路。

3 角蛋白酶的應(yīng)用

微生物角蛋白酶是用于角蛋白降解的特異酶，已在動物飼料、生物肥料、洗滌工業(yè)、皮革和紡織工業(yè)等方面得到應(yīng)用 ，在其他生物技術(shù)領(lǐng)域如制藥和生物醫(yī)學(xué)等方面也具有重要應(yīng)用潛力。

3.1 飼料及肥料中的應(yīng)用

角蛋白水解產(chǎn)物富含改善動物飼料的必需氨基酸，當(dāng)角蛋白酶與動物飼料一起添加時，能有效改善動物對飼料的吸收利用，加速動物生長，提高消化率。據(jù)報道，在含有羽毛粉的動物飼料中添加玫瑰考克氏菌(Kocuria rosea)，能有效提高組氨酸、蛋氨酸和賴氨酸的含量。角蛋白酶還能夠分解朊病毒蛋白(Prion Protein，Prp Sc)，使肉制品安全地供動物食用，Versazyme和CibenzaDP100TM是從地衣芽孢桿菌 PWD-1中獲得的2種商業(yè)角蛋白酶，在肉雞飼料中添加 Versazyme能夠促進肉雞生長及消化。金黃桿菌屬(Chryseobacterium spp.)菌株水解羽毛產(chǎn)物已經(jīng)用于提高香蕉植物的含氮量，并能促進其他植物根和芽的生長。

3.2 沼氣生產(chǎn)

將角蛋白廢棄物經(jīng)微生物處理可轉(zhuǎn)化為可再生能源沼氣，用于改善衛(wèi)生條件、保護生態(tài)環(huán)境、解決能源短缺等問題。有研究表明可通過兩步法來產(chǎn)生沼氣：第一步：由角蛋白酶產(chǎn)生菌水解角蛋白底物；第二步：由熱球菌進一步將水解產(chǎn)物降解為小分子，如氫氣；此外，通過補充角蛋白水解產(chǎn)物，進一步產(chǎn)生甲烷氣體。有研究表明用B.megaterium 作為角蛋白酶產(chǎn)生菌處理雞毛，能夠產(chǎn)生甲烷氣體，將羽毛水解物與稀釋的豬糞在厭氧條件下消化，比單獨用豬糞發(fā)酵能產(chǎn)生更多的甲烷。

3.3 洗滌劑中的應(yīng)用

角蛋白酶的生物化學(xué)性質(zhì)決定了其能夠耐受各種表面活性劑、洗滌劑及各種有機化學(xué)試劑。有研究表明B.subtilis產(chǎn)生的角蛋白酶能清除棉布衣服上的血液污漬，將角蛋白酶加入商業(yè)洗滌劑中，有強化去除污漬的效果，將B.pumilusGRK產(chǎn)生的角蛋白酶加入洗滌劑，在不損壞紡織品前提下，成功地去除了衣服上的血漬。

3.4 皮革和紡織工業(yè)中的應(yīng)用

在皮革工業(yè)中，去除動物身上的毛發(fā)而不損壞皮膚是脫毛過程遇到的巨大挑戰(zhàn)之一，角蛋白酶由于其底物特異性，可被用于皮革工業(yè)的脫毛過程，具有綠色、無二次污染、經(jīng)濟等顯著優(yōu)點。來自B.paralicheniformis MKU3的角蛋白酶能有效對羊皮進行100%的脫毛而不損壞皮革表層，這個過程因為沒有用硫化物等進行預(yù)處理，因此被稱為無化學(xué)物質(zhì)脫毛過程。

3.5 醫(yī)藥方面的應(yīng)用

角化過度通常發(fā)生在手指背面的外層皮膚，其主要成分是角蛋白，基于角蛋白酶的藥物Keratoclean? Hydra PB及Pure100可用于治療皮層角化過度癥狀。痤瘡是由于過多的角蛋白阻塞了皮脂腺而形成。Keratoclean Sensitive PB和KeratopeelPB已用于痤瘡治療。朊病毒是導(dǎo)致傳染性和致命性腦部疾病的關(guān)鍵傳染性蛋白質(zhì)之一。羽毛分解產(chǎn)生的角蛋白酶具有切割 β-角蛋白結(jié)構(gòu)的功能；因此，它們可以降解具有 β 折疊片的朊病毒蛋白(PrP Sc)。地衣芽孢桿菌PWD-1是發(fā)現(xiàn)的首個能產(chǎn)生降解PrP Sc角蛋白酶的菌株，另外，Pure100

已被用于水解手術(shù)器械中的朊病毒。由于角蛋白酶可以分解指甲等基質(zhì)中的角蛋白，因此可以增強藥物的滲透性，提高疾病的治療效果。綜上，角蛋白酶的應(yīng)用范圍非常廣，除上述領(lǐng)域外，角蛋白酶也可以應(yīng)用到化妝品和護膚品中更好地幫助營養(yǎng)成分的吸收，今后仍需在更多的應(yīng)用領(lǐng)域繼續(xù)探索。

4 展望

4.1 角蛋白降解微生物資源篩選

盡管目前已陸續(xù)報道了一些角蛋白降解微生物，但不同的微生物對不同底物的降解效果不同。因此仍有大量資源值得進一步篩選并進行降解效果評價，同時，不同角蛋白酶在不同環(huán)境條件下的酶活不同，導(dǎo)致降解效果不同；為適應(yīng)不同條件下角蛋白酶對底物進行高效降解，開發(fā)具有廣泛底物特異性和較高催化活性的新型角蛋白酶勢在必行。因此極端環(huán)境中的角蛋白降解微生物如嗜熱和嗜鹽微生物等，值得廣泛關(guān)注。此外，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，篩選的技術(shù)手段也需要改進，利用高通量測序技術(shù)、基因組數(shù)據(jù)庫及生物信息學(xué)的方法來分析和發(fā)現(xiàn)新的角蛋白酶和新的角蛋白降解微生物是一個有效途徑。

4.2 微生物角蛋白酶的生物降解機理

迄今角蛋白的生物降解機制還未探明，但有多種假設(shè)，如酶解理論、硫解理論及物理壓力理論等。但確定的是一個有效的角蛋白降解過程必然包括：二硫鍵的還原以及角蛋白多肽鏈的水解。二硫鍵的破壞是角蛋白酶進入角蛋白底物的先決條件。酶解理論認(rèn)為，二硫鍵還原酶先對底物中的二硫鍵進行還原，然后，角蛋白酶能順利進入角蛋白底物內(nèi)部進行水解。盡管羽毛角蛋白很難被蛋白水解酶降解，但角蛋白酶和真菌菌絲體機械破壞相結(jié)合可以較好地完成這項復(fù)雜工作，真菌菌絲在含有角蛋白底物的培養(yǎng)基中不斷生長并侵入角蛋白，其肽鍵逐漸暴露于角蛋白酶下，進而被降解。雞毛中的 β-角蛋白很難被普通蛋白水解酶水解，研究發(fā)現(xiàn)Microsporum fulvum 菌絲對角蛋白的物理壓力及其分泌的角蛋白酶對角蛋白的水解增強了其對底物的降解能力，最后將含角蛋白的基質(zhì)全部降解。因此，不同微生物產(chǎn)生的角蛋白酶特性不同，再加上角蛋白結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，使角蛋白酶對底物的降解可能有不同機制，未來仍需深入研究。

4.3 角蛋白酶的蛋白質(zhì)工程

在工業(yè)應(yīng)用當(dāng)中，角蛋白酶需要更高效、高產(chǎn)和耐熱的特性。蛋白質(zhì)工程中關(guān)鍵技術(shù)的成熟，為改造蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)使其具有新的特征和更高的產(chǎn)能提供了機會。

提高異源宿主中角蛋白酶產(chǎn)量最重要的因素是篩選高分泌效率的信號肽，信號肽是指導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到分泌途徑的短肽鏈。Tian等對B.subtilis SCK6 信號肽進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)使用SP LipA信號肽的角蛋白酶的胞外活性比野生型高1.95倍。Fu等構(gòu)建了包含173種不同Sec型信號肽的文庫，認(rèn)為幾乎沒有任何通用的最佳信號肽適用于所有異源蛋白質(zhì)。因此，系統(tǒng)優(yōu)化最佳信號肽是促進不同異源表達系統(tǒng)產(chǎn)生角蛋白酶的有力策略。

在前肽自主加工過程中，前肽結(jié)構(gòu)在輔助蛋白質(zhì)成熟和結(jié)構(gòu)重排中起到重要作用，“前肽工程”聚焦于對角蛋白酶前肽的修飾，以提高酶的產(chǎn)量及催化特性。Sharma等對角蛋白酶KerP的N末端區(qū)域進行隨機截短，發(fā)現(xiàn)隨著截短長度的延長，酶活性逐漸降低，只有187 bp前序列區(qū)域是角蛋白酶KerP正確折疊并且具有活性所需的最小長度。因此，前序列的大小直接影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象，從而導(dǎo)致酶動力學(xué)的改變。角蛋白酶Sfp2的氮端前序列的定點突變使酶的比活性和蛋白質(zhì)產(chǎn)量提高了9倍。“前肽工程”可利用定點突變、交換、嵌合體和基因重組手段對蛋白質(zhì)的前肽區(qū)域進行修飾，其是提高蛋白酶產(chǎn)量和產(chǎn)生特定突變體很有前途的技術(shù)。

據(jù)報道，一些不必要的氨基酸或結(jié)構(gòu)域存在于酶的碳末端，影響催化效率和酶的性質(zhì)。部分截短角蛋白酶的C末端序列可以提高其催化效率、嗜熱性、耐鹽性和耐洗滌劑性。因此，碳末端修飾已被探索為一種新的蛋白質(zhì)工程策略。

蛋白酶最重要的區(qū)域是其催化中心以及和底物的結(jié)合區(qū)。對蛋白酶催化中心的電子分析以及定點突變可以提高酶的催化效率，通過計算機模擬角蛋白酶 KerSMD的3D結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，該酶口袋的入口或底部的4個殘基可能與底物特異性相關(guān)，通過突變這些殘基使S1口袋擴大，發(fā)現(xiàn)酶的催化效率提高且可水解大分子底物。這些研究為角蛋白酶中催化中心結(jié)合囊、催化能力和底物特異性之間的互作提供了依據(jù)。

多種突變策略的組合可能會通過協(xié)同作用對角蛋白酶產(chǎn)生疊加效應(yīng)。用具有更高催化效率的同源蛋白酶KerSMF的前肽和碳末端結(jié)構(gòu)域取代KerSMD的相關(guān)區(qū)域，發(fā)現(xiàn)角蛋白酶 KerSMD的催化能力和熱穩(wěn)定性都有提高。此外，同時進行多位點突變可以作為一種有效的方法來改善和定制角蛋白酶。