核酸適配體為研究細胞膜受體分子提供了強有力的分子工具。然而，在核酸適配體的篩選過程中，核酸適配體與受體分子在單分子層面的結(jié)合并不能被直接觀測到。此外，大多數(shù)核酸適配體的靶分子在細胞膜表面是高表達的，這些受體分子的分布密度高、運動速度快，極難實現(xiàn)原位分析。為了進一步發(fā)掘核酸適配體在膜受體分析領(lǐng)域的應(yīng)用潛力，同時也為了闡明核酸適配體和受體分子之間的具體結(jié)合模式，湖南大學(xué)的譚蔚泓院士/呂一帆副教授團隊提出了一種基于熒光成像中單分子定位和數(shù)學(xué)中隨機取樣的分析策略，稱為配體稀釋分析技術(shù)。與經(jīng)典成像技術(shù)中采用過量熒光探針與盡可能多的受體分子相結(jié)合這一策略所不同的是，配體稀釋分析技術(shù)同時使用熒光探針與非熒光探針兩種探針對樣品進行標記。這兩種探針的識別區(qū)域在結(jié)構(gòu)上是相同的，因此熒光探針可以以一個類似隨機取樣的過程被非熒光探針均勻稀釋。當(dāng)稀釋倍數(shù)足夠大時，相鄰兩個熒光探針之間的距離可以被單分子定位技術(shù)有效區(qū)分。 圖1. 配體稀釋分析的基本概念驗證（來源：Angewandte Chemie International Edition）
基于該項技術(shù)研究團隊構(gòu)建了可以計算細胞表面受體密度的回歸模型。通過協(xié)同配體稀釋技術(shù)進一步在單分子層面上實現(xiàn)了核酸適配體和單克隆抗體在同一個膜受體分子上的共定位，在此基礎(chǔ)上，通過分子對接和分子動力學(xué)模擬，可以進一步確定核酸適配體與膜受體分子的精確結(jié)合位點和具體結(jié)合模式。利用配體稀釋技術(shù)，還可以實現(xiàn)基于核酸適配體的受體分子動態(tài)分析，從而生成時間相關(guān)的受體分布圖譜，實現(xiàn)高表達受體分子在活細胞膜表面的二維以及三維運動和漲落分析。具體來說，研究團隊首先通過理論推導(dǎo)說明配體稀釋是一個在分子層面隨機取樣的過程，并巧妙利用DNA分子工具構(gòu)建了兩種研究模型，通過實驗證實了配體稀釋在分子層面具有隨機取樣的性質(zhì)，能夠更加精確地反映出受體分子在細胞膜表面地的分布情況。 圖2. 構(gòu)建密度依賴和結(jié)合力依賴的取樣模型驗證配體稀釋技術(shù)的隨機取樣性質(zhì)（來源：Angewandte Chemie International Edition）
同時，基于該配體稀釋技術(shù)，研究團隊構(gòu)建了能夠用于計算細胞表面受體密度的回歸模型，并對CEM細胞表面PTK7蛋白的密度進行測定。此外，研究團隊還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)直接對受體蛋白進行稀疏標記時，熒光探針的數(shù)量容易受到細胞數(shù)量的影響。采用配體稀釋技術(shù)，單個細胞上熒光探針的數(shù)量能夠得到有效控制，不受細胞數(shù)量影響。 圖3. 配體稀釋技術(shù)用于細胞膜表面受體分子的密度分析（來源：Angewandte Chemie International Edition）
研究團隊進一步提出了基于AuNP淬滅和基于DNA雜交的兩種協(xié)同配體稀釋技術(shù)，在單分子層面實現(xiàn)了局部超分辨能力的共定位以及區(qū)分核酸適配體和抗體在同一個受體分子上的不同結(jié)合位點。與此同時，通過分子對接和分子動力學(xué)模擬實驗，研究團隊進一步確定了核酸適配體與膜受體分子的精確結(jié)合位點和具體結(jié)合模式（核酸適配體sgc8c在膜蛋白PTK7表面的結(jié)合位點被預(yù)測位于Ig3和Ig4之間的凹陷處），彰顯了配體稀釋技術(shù)在研究核酸適配體與膜受體分子相互作用中的重要意義。 圖4. 核酸適配體和受體分子在單分子水平上的熒光共定位（來源：Angewandte Chemie International Edition）
最后，研究團隊利用配體稀釋技術(shù)的隨機取樣特性降低成像范圍內(nèi)熒光光斑的數(shù)目，以實現(xiàn)對單個受體分子二維坐標的精確定位以及運動情況的實時跟蹤，進而實現(xiàn)了活細胞表面高密度受體的二維運動分析。結(jié)合入射角依賴的相關(guān)計算，還可以精確定位單個受體分子包括軸向坐標在內(nèi)的三維坐標，并實時跟蹤單個受體分子的側(cè)向運動和軸向漲落，實現(xiàn)活細胞表面高密度受體的三維運動分析。 圖5. 基于核酸適配體的配體稀釋技術(shù)用于活細胞表面受體分子的三維運動分析（來源：Angewandte Chemie International Edition）
該研究成果發(fā)表于國際化學(xué)領(lǐng)域權(quán)威期刊《德國應(yīng)用化學(xué)》（Angewandte Chemie International Edition）。該論文第一作者為湖南大學(xué)的博士生堵玉林，通訊作者為湖南大學(xué)譚蔚泓院士和呂一帆副教授。該研究工作得到了國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金委員會、深圳市優(yōu)秀科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)項目的大力資助。
