一、實驗?zāi)康暮蛢?nèi)容
目的：復(fù)習(xí)顯微鏡低倍鏡和高倍鏡的使用技術(shù)，了解油浸系物鏡的基本原理，掌握油浸系物鏡的使用方法。
內(nèi)容：1．學(xué)習(xí)油浸系物鏡的使用方法。
2．用油鏡觀察枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌染色裝片。
二、實驗材料和用具
枯草芽孢桿菌(Bacillus subitilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的染色裝片。
香柏油、二甲苯、顯微鏡、擦鏡紙。
三、操作步驟
(一)觀察前的準(zhǔn)備
1．將顯微鏡置于平穩(wěn)的實驗臺上，鏡座距實驗臺邊沿約為4cm。坐正，練習(xí)用左眼觀察。
2．調(diào)節(jié)光源：將低倍物鏡轉(zhuǎn)到工作位置，把光圈完全打開，聚光器升至與載物臺相距約1mm左右。轉(zhuǎn)動反光鏡采集光源，光線較強的天然光源宜用平面鏡，光線較弱的天然光源或人工光源宜用凹面鏡，對光至視野內(nèi)均勻明亮為止。觀察染色裝片時，光線宜強；觀察末染色裝片時，光線不宜太強。
(二)低倍鏡觀察染色裝片
首先上升鏡簡，將枯草芽孢桿菌染色裝片置于載物臺上，用標(biāo)本夾夾住，將觀察位置移至物鏡正下方，物鏡降至距裝片0.5cm處，適當(dāng)縮小光圈然后兩眼從目鏡觀察，轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器使物鏡逐漸上升(或使鏡臺下降)至發(fā)現(xiàn)物像時，改用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)到物像清楚為止。移動裝片，把合適的觀察部位移至視野中心。
(三)高倍鏡觀察
眼睛離開目鏡從側(cè)面觀察，旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換器，將高倍鏡轉(zhuǎn)至正下方，注意避免鏡頭與玻片相懂。再由目鏡觀察，仔細(xì)調(diào)節(jié)光圈，使光線的明亮度適宜。用細(xì)調(diào)節(jié)器校正焦距使物鏡清晰為止。將最適宜觀察部位移至視野中心，繪圖。不要移動裝片位置，準(zhǔn)備用油鏡觀察。
(四)油鏡觀察
1．提起鏡筒約2cm，將油鏡轉(zhuǎn)至正下方。在玻片標(biāo)本的鏡檢部位(鏡頭的正下方)滴一滴香柏油。
2．從側(cè)面注視，小心慢慢降下鏡筒，使油鏡浸在油中至油圈不擴大為止，鏡頭幾乎與裝片接觸，但不可壓及裝片，以免壓碎玻片，損壞鏡頭。
3．將光線調(diào)亮，左眼從目鏡觀察，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐上升(切忌反方向旋轉(zhuǎn))，當(dāng)視野中有物像出現(xiàn)時，再用細(xì)調(diào)節(jié)器校正焦距。如因鏡頭下降未到位或鏡頭上升太快末找到物像，必須再從側(cè)面觀察，將油鏡降下，重復(fù)操作直至物像看清為止。仔細(xì)觀察并繪圖。
4．再次觀察 提起鏡筒，換上金黃色葡萄球菌染色裝片，依次用低倍鏡、高倍鏡和油鏡觀察，繪圖。重復(fù)觀察時可比第一次少加香柏油。
(五)鏡檢完畢后的工作
1．移開物鏡鏡頭。
2．取出裝片。
3．清潔油鏡，油鏡使用完畢后，須用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油，再用擦鏡紙沾少許二甲苯擦掉殘留的香柏油，最后再用干凈的擦鏡紙擦干殘留的二甲苯。
4．擦凈顯微鏡，將各部分還原。將接物鏡呈“八”字形降下，不可使其正對聚光器，同時降下聚光器，轉(zhuǎn)動反光鏡使其鏡面垂直于鏡座。最后套上鏡罩，對號放入鏡箱中，置陰涼干燥處存放。
四、注意事項
1．使用油鏡必須按先用低倍鏡和高倍鏡觀察，再用油鏡觀察
2．下降鏡頭時，一定要從側(cè)面注視，切忌用眼睛對著目鏡，邊觀察邊下降鏡頭的錯誤操作，以免壓碎玻片而損壞鏡頭。
3．使用二甲苯擦鏡頭時，注意二甲苯不能過多，以防溶解固定透鏡的樹脂。
4．注意保持顯微鏡的潔凈，對金屬部分要用軟布擦拭，擦鏡頭必須用擦鏡紙，切勿用手或用普通布、紙等，以免損壞鏡頭。
五、實驗報告
分別繪出在高倍鏡和油鏡下觀察到的枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌的形態(tài)，注明物鏡放大倍數(shù)和總放大率。
六、問題和思考
1．用油鏡便于觀察細(xì)菌的依據(jù)是什么？
2．使用油鏡應(yīng)特別注意哪些問題？
3．當(dāng)物鏡從低倍鏡轉(zhuǎn)到高倍鏡和油鏡時，對照明度有何要求？應(yīng)如何調(diào)節(jié)？
油鏡的基本原理
（一）油鏡頭的辨認(rèn)
油鏡頭上?？逃蠴I(oil immersion)或HI（homogeneneous immersion）字樣，有的還刻有一圈紅線或黑線標(biāo)記，在低倍物鏡、高倍物鏡和油鏡3物鏡中，油鏡的放大倍數(shù)和數(shù)值孔徑（numerical aperture）最大，而工作距離最短（圖1—1）
圖1—1 顯微鏡物鏡參數(shù)示意圖
（二）顯微鏡的分辨率
顯微鏡性能的優(yōu)劣不單是看它的總放大倍數(shù)，更重要的是看它分辯率的大小。分辨率是指顯微鏡能分辨出物體兩點間最小距離（D）的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值與光線的波長（λ）成正比，與物鏡的數(shù)值孔徑（NA）成反比。
從上式可看出，縮短光波長和增大數(shù)值孔徑都可提高分辨率。
數(shù)值孔徑指光線投射到物鏡上的最大角度（稱鏡口角，α）的一半正弦與介質(zhì)折射率（n）的乘積；
影響數(shù)值孔徑大小的因數(shù)，一是鏡口角，二是介質(zhì)的折射率。
當(dāng)鏡與裝片之間的介質(zhì)為空氣時，由于空氣（n= 1.52）的折射率不同，光線會發(fā)生折射，不僅使進入物鏡的光線減少，降低了視野的照明度，而且會減少鏡口角（圖5—2A）。當(dāng)以香柏油（n=1.515）為介質(zhì)時，由于它的折射率與玻璃相近，光線經(jīng)過載玻片后可直接通過香柏油進入物鏡而不發(fā)生折射（圖5—2B），不僅增加了視野的照明度，更重要的是通過增加數(shù)值孔徑達(dá)到提高分辨率的目的?？梢姽獾牟ㄩL平均為0.55μm。當(dāng)使用數(shù)值孔徑為0.65的高倍鏡時，它能辨別兩點之間的距離為0.42μm；而使用數(shù)值孔徑為1.25的油鏡時，能辨別兩點之間的距離則為0.22μm。
圖1—2 介質(zhì)為空氣（A）與介質(zhì)為香柏油（B）時光線通過的比較
B.細(xì)菌單染色法
一、實驗?zāi)康暮蛢?nèi)容
目的：鞏固無菌操作技術(shù)，掌握細(xì)菌的涂片和單染色技術(shù)
內(nèi)容：1.學(xué)習(xí)細(xì)菌單染色操作技術(shù)。
二、實驗材料和用具
大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylocosccus aureus)的斜面菌種。
結(jié)晶紫染液、香柏油、二甲苯、無菌水；顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、酒精燈、載玻片、吸水紙。
三、操作步驟
(一)單染色法
1．涂片 在潔凈無脂的載玻片中央滴一小滴無菌水，用無菌操作方法從菌種斜面挑取少量菌體與水滴充分混勻，涂成薄膜，涂布面積約1～1.5cm2。
2．干燥 將涂片于室溫中自然干燥。
3．固定 手扶載片一端，使涂菌的一面向上，將載片通過微火2～3次。在火上固定時，用手摸涂片反面，以不燙手為宜。不能將載片在火上烤，否則細(xì)菌形態(tài)毀壞。
4．染色 將涂片置于水平位置，滴加染色液覆蓋于涂菌處，染色約2min
5．水洗 傾去染色液，斜置載片，用自來水的細(xì)水流由載片上端流下，不得直接沖在涂菌處，直洗至從載片上流下的水中無染色液的顏色為止。
6．干燥 自然晾干或用吸水紙輕輕地吸干，注意不要擦掉菌體。
7．待標(biāo)本完全干燥后，先用低倍鏡和高倍鏡觀察，將典型部位移至視野中央，再用油鏡觀察。
單染色的方法
C.細(xì)菌芽孢觀察
一、實驗?zāi)康暮蛢?nèi)容
目的：掌握細(xì)菌的芽孢觀察方法。
內(nèi)容：細(xì)菌的芽泡染色。
二、實驗材料和用具
枯草芽孢桿菌、褐球固氮菌的斜面菌種。
二甲苯、香柏油、蒸餾水、5%孔雀綠水溶液、0.5%沙黃水溶液；
顯微鏡、接種環(huán)、酒精燈、載玻片、蓋玻片、小試管(l×6.5cm)、燒杯(300mL)、滴管、試管夾、擦鏡紙、吸水紙。
三、操作步驟
1．方法1
(1)取37℃培養(yǎng)18～24h的枯草芽孢桿菌作涂片，并干燥，固定(參見“細(xì)胞單染色法”)。
(2)于涂片上滴人3～5滴5%孔雀綠水溶液。
(3)用試管夾夾住載玻片在火焰上用微火加熱，自載玻片上出現(xiàn)蒸汽時，開始計算時間約4～5min。加熱過程中切勿使染料蒸干，必要時可添加少許染料。
(4)傾去染液，待玻片冷卻后，用自來水沖洗至孔雀綠不再褪色為止。
(5)用0.5%沙黃水溶液(或0.05%堿性復(fù)紅)復(fù)染lmin，水洗。
(6)制片干燥后用油鏡觀察。芽孢呈綠色，菌體紅色。
2．方法2
(1)加1～2滴自來水于小試管中，用接種環(huán)從斜面上挑取2～3環(huán)培養(yǎng)18～24h的枯草芽孢桿菌菌苔于試管中，并充分混勻打散，制成濃稠的菌液。
(2)加5%孔雀綠水溶液2～3滴于小試管中，用接種環(huán)攪拌使染料與菌液充分混合。
(3)將此試管浸于沸水浴(燒杯)中，加熱15～20min。
(4)用接種環(huán)從試管底部挑數(shù)環(huán)菌于潔凈的載玻片上，并涂成薄膜，將涂片通過微火3次固定。
(5)水洗，至流出的水中無孔雀綠顏色為止。
(6)加沙黃水溶液，染2～3min后，傾去染液，不用水洗，直接用吸水紙吸干。
(7)干燥后用油鏡觀察。芽孢綠色，菌體紅色。
四、注意事項
供芽孢染色用的菌種應(yīng)控制菌齡，使大部分芽孢仍保留在菌體上為宜。
五、實驗報告
(一)繪圖
1．枯草芽孢桿菌菌體及芽孢形態(tài)，芽孢的著生位置。
七、問題和思考
1．為什么芽孢染色要加熱?為什么芽孢及營養(yǎng)體能染成不同的顏色?
2．試設(shè)計實驗如何鑒定某一產(chǎn)芽孢菌株的芽孢形態(tài)、著生位置及所屬分類地位。聯(lián)系客服
