如果你的研究課題要接觸熒光定量PCR實驗，那么本篇文章將非常適合你，因為作者從實驗設計到數(shù)據(jù)分析，以及每一步的注意事項都寫得很詳細和到位。推薦給每一位有需要的同學收藏和閱讀！
實時熒光定量PCR（后續(xù)簡稱為qPCR）顧名思義就是在PCR反應體系中加入熒光物質，通過熒光信號的實時接收監(jiān)測PCR反應進程，由于其模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關系，以此為依據(jù)進而達到定量的目的。簡單來講，qPCR可分為熒光染料法（以SYBR GreenⅠ最常用）與熒光探針法（TaqMan 探針）兩種，而其結果分析方法也有絕對定量和相對定量之分。在此不一一贅述，此次分享以SYBR GreenⅠ法為例，結果分析選用相對定量法。實驗設計是科學研究中重要一環(huán)，好的實驗設計在確保實驗嚴謹有序進行的同時也為研究者差缺補漏、原始數(shù)據(jù)的保存、實驗條件的優(yōu)化等提供了便利，因此，在開始實驗前做好實驗設計是很有必要的。想要做好實驗設計，實驗前的準備工作是十分關鍵的，對實驗流程越熟悉，邏輯上越成環(huán)，實驗設計也會越發(fā)巧妙和完備，以我個人經(jīng)驗來說，做好實驗設計需要從以下幾方面入手：全面充分地了解實驗原理，掌握實驗背后的底層邏輯；
熟悉實驗的規(guī)范化操作流程，從一開始就養(yǎng)成規(guī)范操作的習慣（注：這點非常重要，有的同學可能做實驗的時候馬馬虎虎，只追求結果，實驗做出來了卻連規(guī)范化的實驗怎么做都不清楚，稀里糊涂的，還有可能把別人帶“坑”里，查原始數(shù)據(jù)才發(fā)現(xiàn)實驗都是錯的，瞎折騰）；
盡可能地了解你所用到的實驗設備和試劑，當然也要對比別的同學所用耗材，事無巨細，這是我們查找實驗問題最關鍵的一步（注：此步在實驗設計階段盡可能有個大致了解，具體了解基本上是等實驗正式開始真正用到了，但最起碼得知道要用到什么東西吧）；
養(yǎng)成做好實驗記錄的好習慣：好記性不如爛筆頭，最初實驗設計是咋樣的，后續(xù)進行了怎樣的優(yōu)化等等，越詳細越好，任何一個被忽略掉的細節(jié)都有可能導致實驗失敗哦；
- 好的實驗設計關鍵在于“靈活”，能保證條件隨處可調的同時卻不打亂實驗節(jié)奏！
2.3 實操環(huán)節(jié)——RT-qRCR實驗設計（注：此處以最基本的兩組（實驗組、對照組）三樣本為例做一演示，其他增加組別或者增大樣本量什么的都是在此基礎上的衍生，要活學活用哦?。?/span>背景假設：倘若要用RT-qRCR實驗看A、B、C、D四個基因的相對表達量，并以此進行實驗設計。2.3.1 實驗前準備：提取三個樣本的RNA并逆轉錄得到三個樣本的cDNA。（注：a. 要確保逆轉錄得到的cDNA量要滿足此次實驗的需要，當然別忘了把預實驗的用量也包含在內哦；b. 為盡可能消除個體差異帶來的影響（組織），可以在提取RNA的時候將組織多混一，如5個組織各取一些混在一管提取RNA作為樣本1等）2.3.2 計算：我們首先要通過預實驗看其熔解曲線（用于判斷引物特異性）、Ct值（即大致表達情況）、模板的稀釋倍數(shù)等情況。4個基因，在不知道稀釋倍數(shù)如何的情況下可以多設置幾個稀釋梯度，如：原液、5倍、10倍、20倍等等，當然有經(jīng)驗值是最好不過了，比如我們課題組所做基因基本稀釋3倍、5倍基本可以，故而實驗設計如下：注：新手若沒有經(jīng)驗值的情況下，最好先嚴格按照試劑說明書來操作，后續(xù)再進行下一步調整哦！按照所需量，稀釋各樣本（注：不可將原液一次性稀釋哦，用多少取多少）此處需要考慮兩個要素：1 A基因模板不同稀釋倍數(shù)各需兩孔，為避免加樣掛壁導致樣本不夠，可以多算一兩孔，如：A基因原本需要2（模板量）×2（孔數(shù)）=4ul，那現(xiàn)在就變成2（模板量）×4（孔數(shù)）=8ul。2 我們有3個樣本，但不能在預實驗的時候只用一個樣本來做，這樣會造成后期正式實驗的時候出現(xiàn)某個樣本用完的情況，那就有兩個思路：其他基因行同樣的操作哦（小tip：新手怕條件太多加錯樣，最好不要怕麻煩寫個小紙條哦；也可將相同的組分先混合，然后再加不同組分，這樣不但能提高加樣速度，而且還會減少多次加樣帶來的加樣誤差，加樣組分變少，也不易出錯）
注：理想狀態(tài)下，模板濃度增加10倍，Ct值減小3.32，但實驗過程中由于受到加樣誤差、反應條件等多方面的影響，有可能出現(xiàn)Ct值不變或者不降反增的情況，所以要在調整實驗時具體問題具體分析。2.3.3 預實驗結果解析：預實驗結果的判讀極其重要，首先判斷熔解曲線是否單峰，單峰即代表引物特異性可以，該引物可用；其次看Ct值，是否在15-30之間，若要更加嚴格的話可以控制在15-25，表達量太低著實也沒有研究的必要了。熔解曲線與Ct值均可的話代表可以進行正式實驗，若二者有一者不太好則需要優(yōu)化實驗條件，即：a. 雜峰在主峰之前，即代表有引物二聚體的存在，此種情況下大概率需要重新設計引物了，改變條件對其影響不大（如圖1）；b. 雜峰在主峰之后，大多由非特異性擴增引起，可通過調整稀釋倍數(shù)、減少引物等來進行調整（如圖2）；注：實驗條件的改善有很多方面，不僅局限于上述提到的幾個哦。2.3.4 預實驗結果記錄：我一般是按照加樣的孔進行記錄（注：記錄的目的在于理清實驗思路，做好原始記錄以及方便實驗調整，根據(jù)自己的習慣和方式來記錄即可）：我習慣用符號記錄，“√”代表可以進行預實驗；“×”代表需要重新設計引物；“?”則代表可以微調，一般會在表格后方再加一列以注明如何調整，至此，A-D基因的預實驗完成，按照兩組三樣本三次平行重復來講，96孔板可放下4個基因，由此衍生出以下實驗設計思路：4個基因部分可以部分不可以，或者可以做正式實驗的兩個基因不同稀釋倍數(shù)，如：A與B可以，C與D不行，或者A稀釋3倍進行正式，而B需要稀釋5倍。此時，可以先將A與B做在同一板上，剩余的孔用于其他基因C/D/E/F等的預實驗，即正式實驗 預實驗；或者先將A/B待定，其他基因的預實驗一板全上完，然后湊正式（注：基因少的情況下最好選前者，總之靈活選擇，并沒有固定模式）。2.3.5 布板：顧名思義就是你的樣本在96孔板上如何加的問題，尤其是正式實驗的時候，巧妙的布板方式省時省力。主體思路就是先加大體積后加小體積，相同組分先混合再加樣，最后加不同組分（一定要注意組分一定要混合均勻），至于樣本如何放置，則比較靈活，按個人習慣就行，但需注意目的基因和內參基因一定要在同一板上，且要保證模板的稀釋倍數(shù)一致，否則無意義。3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析
3.1 背景介紹
實時熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR，qPCR）的數(shù)據(jù)分析主要有絕對定量法和相對定量法兩種方法。
所謂絕對定量法，即對未知樣品的拷貝數(shù)進行測定的方法，如血樣中的病毒、支原體、衣原體的定量分析、食品中某一轉基因成分的含量分析等。
而相對定量法主要是以某一內參基因做對照，進而比較兩個或多個樣本之間某一目的基因表達量的差異，常用于檢測mRNA表達量的變化，以及在不同組織中mRNA表達量的差異等。其中，相對定量法是最常用的方法，其數(shù)據(jù)處理又包含雙標準曲線法和2－△△Ct 法兩種，并以2－△△Ct法最為常用。
因此，接下來主要圍繞相對定量法中的2－△△Ct法簡要介紹qPCR的數(shù)據(jù)分析過程，并進一步通過GraphPad Prism 8.0對統(tǒng)計分析及繪圖作一簡單介紹。
3.2 相對定量法
(1)目的基因Ct值的歸一化：
ΔCt（實驗組）=Ct（實驗組的目的基因）-Ct（實驗組的內參基因）
ΔCt（對照組）=Ct（對照組的目的基因）-Ct（對照組的內參基因）
(2)實驗組ΔCt的歸一化：ΔΔCt=各樣本的ΔCt-對照組的ΔCt
(3)表達水平的差異倍數(shù)：2 –ΔΔCT
3.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析
(1)qPCR結束，得到原始數(shù)據(jù)，粘貼到Excel表格中，僅保留位置及Cq值（注：Ct值與Cq值表達的意思基本一致，實驗指南建議用Cq值來命名，所以不必糾結兩者的名稱，同等看待即可；此外，一定要明確自己的加樣位置，以防分析出錯）；
(2)我們一般在實驗中會設置復孔，所以第一步先求其平均值；
(3)第二步：計算ΔCt，用目的基因的Ct值減去內參基因的Ct值；
(4)第三步：計算對照組ΔCt的平均值；
(5)第四步：計算ΔΔCt，用ΔCt值減去對照組ΔCt的平均值即可；
(6)第五步：計算2–ΔΔCT（注：數(shù)據(jù)的排布方式可以按照個人習慣自由布局，另外樣本較多時也僅需在此基礎上添加即可，靈活變換哦）；
(7)復制粘貼2–ΔΔCT值為數(shù)據(jù)模式，打開GraphPad Prism 8.0，新建Column（注：此處以兩組間比較為例）；
(8)復制粘貼數(shù)據(jù)至GraphPad Prism 8.0，點擊Analyze，選擇Normality and Lognormality Tests進行正態(tài)性檢驗，默認選項，點擊OK，即可得到正態(tài)性檢驗結果；
(9)返回Table，點擊t Tests，進行t檢驗 ；
(10)方差齊性檢驗：默認方差齊，方差不齊時返回Table，再次進行t檢驗，此時注意勾選第二個，即可得到統(tǒng)計結果。
(11)繪圖：點擊側面Graphs里面的Data1（注：文件名都是可以重新命名的），即可生成圖片；
(12)圖片的美化及相關信息完善：此步操作簡單，雙擊即可彈出格式設置窗口，按個人喜好選擇即可，但仍需強調的是，一定要展示統(tǒng)計分析結果添加星號哦！
(13)全部處理完成，點擊File→Export即可輸出圖片，還可以根據(jù)需要更改圖片格式哦！（注：最好保留原始格式，這樣后期只需要修改即可，無需再次分析和作圖）
