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• 大仙 (2011-8-21 12:43:37)

  請問樓主：
  你買了多少量的試劑盒，摸條件是否順利，real time 到底好做嗎？
  我一同學做real time 光摸條件就用去了100多次的試劑，試劑這么貴，呵呵，請多多指教。

• 大仙 (2011-8-21 12:44:09)

  我之前買了一個50次的試劑盒，做了兩次曲線不漂亮就不做了，后來換了寶生物的，總共做了四個基因，一個內參，三個目的基因，200次就夠了，所以有時試劑不好，你做多少次都很難調得好的。real-time做的好的話，結果比半定量的可靠得多，從結果可以看出不少內參到了20個循環(huán)就進入平臺期，我們平時做半定量的時候都是用30個循環(huán)去做，所以結果差別很大。

• 大仙 (2011-8-21 12:45:47)

  盡管有些地方值得商榷，但鼓勵大家分享心得。

• 大仙 (2011-8-21 12:46:20)

  終于把實驗做完了，做的是相對定量法。想把自己做定量PCR寫下來，和大家一起分享學習。
  1、首先要確定引物的溶解曲線，最好的是一個峰，而且TM值在80度以上，有人說太低可能是D二聚體，但我做過82度的也有D二聚體，所以一定要把產物跑電泳才能確定引物的特異性。
  
  產物的Tm并不規(guī)定一個標準的範圍，但儘量在80以上，主要還是要結合電泳結果來看。我做過Tm 79度的。
  
  2、配引物一定要在無菌操作臺里，因為定量PCR要求比較高，一點污染都會出現(xiàn)非特異性擴增，我就試過引物污染，陰性對照出現(xiàn)擴增曲線。
  恩，磨刀不誤砍柴工。支持！
  
  3、確定引物后要確定模板的濃度，我覺得說明書說的都不準，最好是自己調，把內參和目的基因的CT值調到8到26之間，最低不超過30，太高難以分辨，太低出現(xiàn)非特異性擴增，低的情況溶解曲線也變成多個峰。
  
  這個，Ct在8肯定是不準的。ABI儀器自動生成閾值的計算方法是Ct 8-16。大的不要超過35最好，不過我做過Ct 38，電泳產物大小是正確的，數值也拿來用了。哎。
  
  4、要做陰性對照，有人說陰性對照是不加引物，有人說是不加模板，我覺得是后者比較好一點。
  
  陰性對照不加引物還是頭一次聽說。
  
  5、一定要把PCR后的產物跑電泳，因為你機子分辨不了你的產物的大小。我試過溶解曲線很漂亮，但跑出來電泳多條帶。
  同感，我也遭遇過。很令人鬱悶、費解。
  
  6、有條件就做標準曲線。
  
  這個主要是看選擇什麼方法處理數據。
  
  7、好的試劑和引物對你的實驗幫助大，假如做3次曲線不漂亮，建議換引物或者試劑，定量PCR的引物設計要求比普通PCR的高，建議讓專業(yè)設計，我的是在寶生物設計的，不錯。
  
  定量引物和普通引物設計上各有側重，不能籠統(tǒng)的說要求孰高孰低哈，沒有最好的，只有最適合的，哈哈。
  
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