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睡眠現(xiàn)象從無脊椎動物到哺乳動物中廣泛存在，但其分子機制仍是現(xiàn)代生物學界一個巨大的未解之謎。近日（6月14日），日本筑波大學國際綜合睡眠醫(yī)學研究所劉清華課題組等科學家，在國際著名期刊Nature上發(fā)表了睡眠調(diào)控機制研究領(lǐng)域的重要突破。研究者運用蛋白組學與磷酸化組學的研究方法，從“磷酸化/去磷酸化循環(huán)調(diào)控”角度提出了睡眠分子調(diào)控的新理論，研究揭示SNIPP磷酸化是睡眠需求的分子標記，SNIPP的磷酸化-去磷酸化循環(huán)是睡眠-覺醒穩(wěn)態(tài)與突觸平衡的主要調(diào)節(jié)機制。

1、蛋白質(zhì)組學、修飾組學分析樣本差異

圖1 技術(shù)路線

為了研究“睡眠需求物質(zhì)”是否是某種未知的蛋白質(zhì)？研究人員首先通過蛋白質(zhì)組學方法，對三種不同處理的小鼠的全腦組織蛋白質(zhì)組進行分析：睡眠6小時，睡眠剝奪6小時和剝奪6小時睡眠后補充睡眠3小時。研究結(jié)果顯示，不同樣本間在蛋白表達水平上，并沒有發(fā)現(xiàn)有意義的變化。

蛋白質(zhì)本身表達水平未變，并不意味著其它方面未受調(diào)控。在生物學上蛋白質(zhì)的功能除轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控外，還包含眾多蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTM）的調(diào)控。磷酸化修飾是蛋白質(zhì)修飾調(diào)控中最常見的一個，參與幾乎所有的生物過程。除了作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的核心機制，還參與線粒體功能、細胞骨架調(diào)控、細胞膜蛋白功能、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等生物過程，在生命科學各領(lǐng)域的研究均有涉及。之前也有科學家揭示磷酸化修飾在代謝穩(wěn)態(tài)與生物節(jié)律中發(fā)揮關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用（詳情請見：核蛋白組及磷酸化組學繪制哺乳動物晝夜節(jié)律調(diào)控全景圖）。

研究人員繼續(xù)采用高通量磷酸化蛋白質(zhì)組學方法對Sleepy小鼠和經(jīng)典的睡眠剝奪小鼠模型的磷酸化水平進行分析。研究結(jié)果表明，睡眠剝奪6小時組的蛋白磷酸化程度顯著高于其它兩組，說明睡眠剝奪使大腦增加的極有可能就是蛋白磷酸化的程度。Sleepy小鼠的研究也得出了同樣的結(jié)論：蛋白質(zhì)含量不變，但Sleepy小鼠中許多蛋白質(zhì)的磷酸化程度顯著增高。兩者間存在大量相同的磷酸化程度升高的蛋白質(zhì)，結(jié)果證明：磷酸化修飾在睡眠需求中發(fā)揮關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用。

圖2 小鼠腦組織樣本中存在大量磷酸化程度升高的蛋白質(zhì)

2、修飾組學分析，篩選控制睡眠內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要分子標記

為了從差異蛋白中篩選到控制睡眠內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要分子標記，也既是“睡眠需求物質(zhì)”，接下來，研究者對這些存在差異的磷酸化蛋白進行分析。并從中篩選得到80個整體上磷酸化程度變化最大超磷酸化蛋白，將之命名為SNIPPs蛋白（Sleep-Need-Index-PhosphoProteins）。其中69個可歸類于神經(jīng)突觸蛋白，而且其中12個蛋白已報道證明其可能導(dǎo)致小鼠或人類睡眠的異常。結(jié)果表明：這些SNIPPs整體或大部分可能是睡眠需求的分子基礎(chǔ)。

3、分析SNIPPs蛋白的磷酸化程度介導(dǎo)睡眠需求的分子機制

為了研究SNIPPs蛋白的磷酸化程度介導(dǎo)睡眠需求的分子機制，研究者對小鼠腦組織蛋白質(zhì)磷酸化在不同時期的變化展開分析。

研究發(fā)現(xiàn)SNIPPs蛋白的磷酸化水平隨著睡眠剝奪時間的增加而逐漸積累。說明了腦內(nèi)蛋白磷酸化水平，尤其是SNIPPs蛋白的磷酸化水平的逐漸積累，與睡眠需求的積累是正相關(guān)的。Sleepy小鼠模型實驗也證實了這一點：小鼠通過磷酸化結(jié)合蛋白提高SNIPPs蛋白的磷酸化水平，從而使大腦產(chǎn)生強烈的睡眠需求。

圖3 磷酸化/去磷酸化循環(huán)調(diào)控模型

4、動物實驗驗證，磷酸化/去磷酸化循環(huán)調(diào)控模型

最后，研究人員使用特異性抑制劑HG-9-91-01抑制小鼠的Sik3 蛋白激酶活性，對分子機制進行驗證。研究發(fā)現(xiàn)在腦室注射HG-9-91-01后， SNIPPs蛋白磷酸化水平也有所降低，同時顯著降低了小鼠睡眠需求（慢波強度）。這些結(jié)果都說明SNIPPs的磷酸化程度在睡眠內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)控中起到重要作用。

當常規(guī)的蛋白質(zhì)組學研究發(fā)現(xiàn)樣本間不存在有意義的差異變化后，研究者從從“磷酸化/去磷酸化循環(huán)調(diào)控”角度提出了睡眠分子調(diào)控的新理論。研究發(fā)現(xiàn)清醒狀態(tài)下，SNIPPs 蛋白的磷酸化水平特異性的升高，其磷酸化的程度決定了清醒過程持續(xù)的時間和清醒程度；SNIPPs蛋白磷酸化水平的變化伴隨著其蛋白質(zhì)功能上的改變和睡眠需求的積累，從而決定了后續(xù)睡眠的質(zhì)量和持續(xù)時間。睡眠將促使SNIPPs蛋白去磷酸化，同時起著修復(fù)大腦損傷、參與記憶的形成和鞏固過程。

“磷酸化/去磷酸化循環(huán)調(diào)控”這一睡眠內(nèi)穩(wěn)態(tài)機制為維持睡眠和清醒系統(tǒng)的平衡，并防止由于SNIPPs等重要神經(jīng)突觸蛋白的過度磷酸化而造成大腦的系統(tǒng)性損傷提供了重要的保障機制。研究為睡眠研究的未來走向提供了嶄新的視角，也為神經(jīng)突觸穩(wěn)態(tài)及睡眠穩(wěn)態(tài)機制研究提供了重要的引導(dǎo)作用。

值得一提的是，生命科學的研究將不僅僅停留在基因組學或常規(guī)蛋白質(zhì)組學層面，除了文中所提到的磷酸化修飾，其他如泛素化修飾、巴豆?；揎椀鹊鞍踪|(zhì)翻譯后修飾，同樣在包括晝夜節(jié)律、腫瘤轉(zhuǎn)導(dǎo)等各個生命活動中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。如泛素化修飾與節(jié)律：泛素化修飾與晝夜節(jié)律調(diào)控機制；二羥基異丁?；c糖酵解：Mol. Cell：P300作為二羥基異丁酰轉(zhuǎn)移酶調(diào)控糖酵解途徑。在科學研究中靈活選擇蛋白質(zhì)翻譯后修飾，勢必為生命科學的研究，如表觀遺傳學、分子機制、生物標志物發(fā)現(xiàn)、臨床檢測等帶來新的啟發(fā)與可能。