盡管微RNA芯片和微RNA測(cè)序檢測(cè)方法已經(jīng)普遍使用，但qRT-PCR的依舊是檢驗(yàn)的微RNA表達(dá)定量的金標(biāo)準(zhǔn)。
由于微RNA的結(jié)構(gòu)特殊，長(zhǎng)度只有18-25個(gè)堿基，無(wú)法直接采用常規(guī)的PCR技術(shù)擴(kuò)增，因此RT-qPCR的的引物設(shè)計(jì)對(duì)很多剛剛接觸的微小RNA的同學(xué)都是一個(gè)難題。在針對(duì)微小RNA的PCR技術(shù)中，設(shè)計(jì)其引物的理念是基于延長(zhǎng)待測(cè)微小RNA的長(zhǎng)度，構(gòu)建出一個(gè)足夠長(zhǎng)的PCR模板，才能進(jìn)一步應(yīng)用PCR技術(shù)來(lái)定量分析。
最常用的microRNA反轉(zhuǎn)錄PCR方法就是莖環(huán)法（莖環(huán)）和加尾法（poly-A tail）。由于莖環(huán)法反轉(zhuǎn)錄的引物設(shè)計(jì)原理限制，加尾法的檢測(cè)通量比莖環(huán)法更高，因此加尾法也被實(shí)驗(yàn)室普遍使用。
今天小編就給大家介紹一個(gè)批量設(shè)計(jì)的微小RNA加尾法反轉(zhuǎn)錄PCR引物的軟件miRprimer，的英文重點(diǎn)一鍵完成哦！
下載網(wǎng)站：https ://sourceforge.net/projects/miRprimer/
網(wǎng)站后臺(tái)文件直接下載miRprimer地址：
https://jaist.dl.sourceforge.net/project/miRprimer/miRprimer2_installer.zip
miRprimer2_installer.zip，整個(gè)軟件的壓縮包只有2.68M（2848kb）大小。
提醒：
軟件支持在Windows XP或更高系統(tǒng)中運(yùn)行，還沒(méi)在蘋(píng)果電腦Mac OS系統(tǒng)測(cè)試（原因是小編的錢包羞澀~~）
2.經(jīng)小編測(cè)試，最新版本，在不同的電腦中安裝Ruby腳本環(huán)境。
第一步
miRprimer2_installer.zip壓縮包2.68M大小，下載后解壓縮生成同名文件夾，內(nèi)有三個(gè)文件：input_miRs.txt，miRprimer2.exe，README.txt文件。
特別提示：不要更改這些文件的文件名。
第二步
input_miRs.txt，F(xiàn)ASTA格式儲(chǔ)存的是需要設(shè)計(jì)引物的微小RNA名字和序列。
可以按照模板形式輸入待設(shè)計(jì)引物的微小RNA名字和序列：
> miR名
microRNA序列
第三步
這個(gè)時(shí)間
- 恭喜你，引物設(shè)計(jì)完成了！
小編推薦用MS Excel程序打開(kāi)查看使用，方便編輯復(fù)制提交。
result_best_primer_pairs.txt文件包含了每個(gè)微小RNA最佳引物的評(píng)分，正向和反向引物的評(píng)分，以及引物二聚體形成的評(píng)分。這里只有評(píng)分最高的引物對(duì)，小編推薦優(yōu)先采納這個(gè)文件中給出的最佳引物對(duì)，將序列提交引物合成服務(wù)商。
如果上面提供的最佳引物實(shí)驗(yàn)效果不佳，或者溶解曲線不理想的話，其他四個(gè)文件就派上用場(chǎng)。
result_all_primer_pairs.txt文件包含了每個(gè)微小RNA的所有引物對(duì)評(píng)分和引物二聚體的評(píng)分信息。
result_f_primers.txt和result_r_primers.txt文件，包含了每個(gè)正向引物和反向引物的長(zhǎng)度，評(píng)分，基于評(píng)分的排名和詳細(xì)評(píng)分?jǐn)?shù);
result_comparison_of_pairs.txt文件，目的是便于人工檢查所有正向和反向引物間兩兩之間序列相似度差異.Similarty to other pairs相似度越低，引物間差異越大;序列完全相同的引物，相似度是1。
如果軟件提供的最佳引物對(duì)在反轉(zhuǎn)錄中工作不如意，不如試試那些相似度低的備選引物試試看。
那么問(wèn)題來(lái)了，有朋友問(wèn)小編：
人和其他模式動(dòng)物
[1] miR-181d通過(guò)NF-κB途徑調(diào)節(jié)人樹(shù)突狀細(xì)胞成熟。細(xì)胞產(chǎn)品 2017年7月21日。doi：10.1111 / cpr.12358。（人微小RNA）
[2]低級(jí)膠質(zhì)和glioneuronal腫瘤的MicroRNA分析顯示了簇14q32.31成員miR-487b的獨(dú)立作用。Mod Pathol。2017年2月; 30（2）：204-216。doi：10.1038 / modpathol.2016.177。（人微小RNA）
[3]瘦素和胰島素上調(diào)miR-4443以抑制NCOA1和TRAF4，并降低人結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲力。BMC癌癥。2016年11月14日; 16（1）：882。（人微小RNA）
[4]用于SCA6的miRNA介導(dǎo)的治療阻斷了CACNA1A第二順?lè)醋拥腎RES驅(qū)動(dòng)翻譯。Sci Transl Med 2016年7月13日; 8（347）：347ra94。doi：10.1126 / scitranslmed.aaf5660。（人微小RNA）
[5]星形膠質(zhì)細(xì)胞可以采用p53依賴方式的內(nèi)皮細(xì)胞命運(yùn)。莫爾神經(jīng)元 2017年8月; 54（6）：4584-4596。doi：10.1007 / s12035-016-9974-3。（小鼠微RNA）
[6]循環(huán)miRNA在小鼠實(shí)驗(yàn)子宮內(nèi)膜異位癥。Reprod科學(xué) 2017年3月; 24（3）：376-381。doi：10.1177 / 1933719116667228。（小鼠微RNA）
[7]在自身免疫性起泡疾病的小鼠模型中解剖皮膚miRNA的遺傳學(xué)。BMC基因組學(xué)。2016年2月16日; 17：112。doi：10.1186 / s12864-016-2455-2。（小鼠微RNA）
[8]雷帕霉素（西羅莫司）改變了小鼠減數(shù)分裂精母細(xì)胞中雷帕霉素途徑調(diào)節(jié)和微小RNA表達(dá)的機(jī)制目標(biāo)。男科。2015年9月; 3（5）：979-90。doi：10.1111 / andr.12075。（小鼠微RNA）
[9] 17β-雌二醇和孕酮對(duì)大鼠模型缺血后炎癥和凋亡微小RNA表達(dá)的影響。J Steroid Biochem Mol Biol。2017年3月; 167：126-134。doi：10.1016 / j.jsbmb.2016.11.018。（大鼠微RNA）
[10]循環(huán)let-7g在具有彌散性組織細(xì)胞肉瘤和癌癥的伯爾尼山犬中下調(diào) - 一項(xiàng)前瞻性研究。獸醫(yī)Comp Oncol 2017年6月15日（2）：525-533。doi：10.1111 / vco.12196。（狗微小RNA）
[11] miRNA和mRNA的聯(lián)合分析顯示了G?ttingen小型肥胖模型中miRNA介導(dǎo)的基因調(diào)控。PLoS One。2016年11月30日; 11（11）：e0167285。doi：10.1371 / journal.pone.0167285。（小型豬微小RNA）
[12]具有高“膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白”（CETP）活性的豬中炎癥基因和微小RNA的肝表達(dá)。哺乳動(dòng)物基因組。2016 Oct; 27（9-10）：503-10。doi：10.1007 / s00335-016-9649-4。（豬微小RNA）
[13]感染鼠傷寒沙門(mén)氏菌的豬腸粘膜的轉(zhuǎn)錄分析顯示回腸中大量的炎癥反應(yīng)和膽汁酸吸收的破壞。獸醫(yī)研究 2016年1月7日; 47：11。doi：10.1186 / s13567-015-0286-9。（豬微小RNA）
[14]瘦素和肥胖脂肪組織中性別和肥胖特異性微小RNA表達(dá)。PLoS One。2015年7月29日; 10（7）：e0131650。doi：10.1371 / journal.pone.0131650。（豬微小RNA）
植物
[15]時(shí)間過(guò)程小RNA分析揭示了水稻miRNA及其靶基因?qū)λ緱l紋病毒感染的響應(yīng)。PLoS One。2016年9月14日; 11（9）：e0162319。doi：10.1371 / journal.pone.0162319。（水稻微小RNA）
[16]短纖維突變體發(fā)育纖維的小RNA測(cè)序和降解組分析Ligon-lintles-1（Li 1）和-2（Li 2）顯示了miRNA及其靶標(biāo)在棉纖維伸長(zhǎng)中的作用。BMC基因組學(xué)。2016年5月17日; 17：360。doi：10.1186 / s12864-016-2715-1。（棉花微RNA）
[17]番茄花粉中新型小ncRNA的鑒定。BMC基因組學(xué)。2015年9月18日; 16：714。doi：10.1186 / s12864-015-1901-x。（西紅柿小非編碼RNA）
微生物
[18]操縱病毒微RNA作為治療巨細(xì)胞病毒感染的潛在抗病毒策略。病毒。2017年5月19日; 9（5）。（病毒微小RNA）
[19]莖環(huán)RT-qPCR作為在賈第鞭毛蟲(chóng)中檢測(cè)和定量小RNA的有效工具。基因（巴塞爾）。2016 Dec 20; 7（12）。pii：E131。doi：10.3390 / genes7120131。（鞭毛蟲(chóng)微小RNA）
[20] EBV而不是HPV使煙草相關(guān)的頭頸癌細(xì)胞系FaDu對(duì)放射治療敏感。耳鼻喉科 2016; 136（4）：354-62。doi：10.3109 / 00016489.2015.1114182。（病毒和人微RNA）
綜述和方法學(xué)文獻(xiàn)
[21]用于分子診斷的微小RNA PCR測(cè)定的優(yōu)化的考慮。Expert Rev Mol Diagn。2016; 16（4）：407-14。doi：10.1586 / 14737159.2016.1152184。（綜述）
[22]為了識(shí)別自適應(yīng)演化的軌跡。方法Ecol Evol。2015年4月; 6（4）：445-464。（綜述）
[23]微小RNAome基因組：癌癥診斷和治療的寶庫(kù)。CA Cancer J Clin。2014年9月 - 10月; 64（5）：311-36。doi：10.3322 / caac.21244。（綜述）
[24]通過(guò)簡(jiǎn)單且特異的qPCR方法定量miRNA。方法Mol Biol。2014; 1182：73-81。doi：10.1007 / 978-1-4939-1062-5_7。（方法學(xué)）
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