十幾年前，microRNA（miRNA）還儼然一個不起眼的小分子，無人關(guān)注。然而近幾年，它已經(jīng)配角變主角，成為研究人員競相研究的對象。這種非編碼的單鏈RNA分子廣泛存在于植物、線蟲及人類的細(xì)胞中，發(fā)揮著重要作用。別看它小，只有~22個核苷酸，但控制著包括細(xì)胞增殖、凋亡、器官發(fā)生、發(fā)育、造血以及腫瘤發(fā)生等若干途徑。
miRNA不僅影響或者調(diào)控了細(xì)胞增殖、分化過程中的mRNA和關(guān)鍵蛋白質(zhì)，還可能同時具有腫瘤抑制因子和原癌基因的功能，在癌癥的診斷和治療中發(fā)揮重要的作用。最新的研究還表明，miRNA可在細(xì)胞間游走，介導(dǎo)細(xì)胞間和組織器官間的信息傳遞。此外，miRNA對多種植物激素的調(diào)控對于植物體的發(fā)育也具有重要意義。
如何研究miRNA的功能呢？一般來說，研究人員收集發(fā)育或分化的不同階段的樣品，或者疾病及正常組織的樣品，從中提取出miRNA。然后利用miRNA特異的芯片繪制出細(xì)胞和組織的miRNA表達(dá)譜，找出表達(dá)差異的miRNA。通過生物信息學(xué)分析，研究人員通常會挑出幾個候選的miRNA，開展進(jìn)一步的分析，如熒光定量PCR驗(yàn)證。當(dāng)然，基因表達(dá)分析所常用的過表達(dá)和沉默，也是一種有力的方法來研究miRNA的功能。
miRNA的研究看起來并不復(fù)雜，但是因?yàn)閙iRNA很小，也就讓每一步都充滿了挑戰(zhàn)。首先便是miRNA的提取，以往傳統(tǒng)的RNA提取試劑盒都是為回收mRNA而設(shè)計(jì)的，往往會棄去較小的RNA分子以提高mRNA產(chǎn)率，這樣一來主角miRNA反而不見了。因此，我們必須采用專門的miRNA提取試劑盒。
不少進(jìn)口品牌早就推出了miRNA提取試劑盒，但大多價格不菲，讓miRNA研究人員直呼吃不消。大家都希望有一些國際品質(zhì)國產(chǎn)價格的試劑盒，如今天根公司真的推出了。想當(dāng)年，天根公司質(zhì)優(yōu)價廉的核酸純化試劑盒真正讓國內(nèi)的實(shí)驗(yàn)室擺脫了酚氯仿，走進(jìn)了kit純化的新時代。
天根（Tiangen）公司這一款miRcutemiRNA提取分離試劑盒就是專門為miRNA的提取而開發(fā)的。試劑盒中的吸附柱采用了特殊的硅基質(zhì)膜填料，大大增強(qiáng)了對RNA的吸附能力，尤其是200nt以下的小RNA。高效的裂解液能夠輕松地裂解各種樣本，包括細(xì)胞、動物組織、植物組織、血清、血漿等。提取過程也很簡單，樣品裂解后用氯仿抽提，然后洗滌幾次，一小時內(nèi)就能輕松完成。除了miRNA，此試劑盒還能得到siRNA、snRNA等小片段RNA，將操作步驟略微修改，還能進(jìn)行總RNA的提取，真是用途多多。至于提取效果如何，有圖1為證。
圖1. 血漿中提取miRNA后，通過KR201+FP401檢測miR-16和miR-24的電泳圖。Marker為50 bp Marker；1-3為血漿中miR-24；4-6為血清中miR-24；7-9為血漿中miR-16；10-12為血清中miR-16。
除了提取，miRNA的定量也是個難題。miRNA長度很短，僅有21-23個核苷酸，并且沒有mRNA3’端的poly(A)尾巴，因此無法采用普通的反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR來檢測miRNA。目前，miRNA的反轉(zhuǎn)錄主要采用兩種方法，一種是莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄法（見圖2），另一種是加尾反轉(zhuǎn)錄法（見圖3）。
莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄法利用可以正確折疊為莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物對miRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以獲得人為加長后的miRNAcDNA第一鏈，然后利用合適的退火溫度將反轉(zhuǎn)錄引物的莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開并與PCR擴(kuò)增的正反向引物結(jié)合，再通過染料法或探針法進(jìn)行熒光定量PCR檢測。此種方法的特異性較高，但是對引物的要求也很高，需要引物在反轉(zhuǎn)錄階段形成莖環(huán)式的正確構(gòu)型，因此設(shè)計(jì)起來較為繁瑣和困難。采用這種方法的研究人員一般會選擇購買經(jīng)過驗(yàn)證的商品化莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物，但畢竟選擇范圍有限，如果你的研究對象不是人、小鼠或大鼠，估計(jì)很難買到，而且對財(cái)力的要求也很高啊。
加尾反轉(zhuǎn)錄法則是利用poly(A)聚合酶為成熟的miRNA加上poly(A)尾巴，然后用5’端帶通用標(biāo)簽的Oligo-dT作為反轉(zhuǎn)錄引物，獲得人為加長的miRNAcDNA第一鏈，最后用與通用標(biāo)簽序列互補(bǔ)的反向引物進(jìn)行染料法的熒光定量PCR檢測。這種方法可以批量地將所有成熟miRNA加上poly(A)尾巴，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和檢測，無需繁瑣的引物設(shè)計(jì)，因此被很多實(shí)驗(yàn)室采用。
天根的miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒正是采用加尾反轉(zhuǎn)錄法對成熟miRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，最終生成miRNA對應(yīng)的cDNA第一鏈。該試劑盒可采用總RNA或miRNA作為模板，使用最新一代的PolyA聚合酶和第三代反轉(zhuǎn)錄酶Quant ReverseTranscriptase進(jìn)行加尾和反轉(zhuǎn)錄，具有高效的Poly(A)修飾和逆轉(zhuǎn)錄效率，可從20 pg-2 μg的總RNA中有效制備miRNA對應(yīng)的cDNA第一鏈。而且，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，產(chǎn)物中不存在抑制后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成分。試劑盒中包含了miRNA加尾和逆轉(zhuǎn)錄過程所需的所有試劑，使用起來非常方便。
對于轉(zhuǎn)錄之后的定量，天根也提供了一個配套的試劑盒—miRcutemiRNA熒光定量檢測試劑盒。此試劑盒采用SYBR® Green I嵌合熒光法的原理進(jìn)行miRNA熒光定量檢測。試劑盒內(nèi)包含了定量所需的2×miRcute miRNA premix以及與miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒（KR201）配合使用的Reverse primer。
2×miRcute miRNApremix（含SYBR，含ROX）是專門為miRNA定量檢測而研發(fā)的新一代預(yù)混形式的熒光定量PCR檢測試劑，采用抗體修飾的熱啟動DNApolymerase和特制的緩沖液體系，使檢測反應(yīng)特異性更好，靈敏度更高，可檢測pg級總RNA中miRNA的單堿基差異，且在模板大濃度梯度范圍具有優(yōu)秀的線性關(guān)系（圖4）。
如果你近期正準(zhǔn)備開展miRNA研究，那我還有個好消息要告訴你。Tiangen在11月推出了miRNA熒光定量PCR檢測的“黃金套裝”和“白金套裝”，相當(dāng)優(yōu)惠，并加贈miRNA實(shí)驗(yàn)中的“圣經(jīng)”——《miRNA實(shí)驗(yàn)指南》，絕對不容錯過。如果你想要了解更多信息，請瀏覽http://www.ebiotrade.com/custom/tiangen/101026/index.htm。（生物通 余亮）
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