這里說的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建是指慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，可以構(gòu)建表達(dá)細(xì)胞系，也能構(gòu)建敲降細(xì)胞系，經(jīng)常有人問我什么叫穩(wěn)轉(zhuǎn)和順轉(zhuǎn)的區(qū)別。瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞系，一般情況下能夠穩(wěn)定表達(dá)最多長(zhǎng)一周左右，而穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，只要構(gòu)建成功就能穩(wěn)定表達(dá)，沒有時(shí)間限制，但是也不是肯定的，一般實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的細(xì)胞系超過 10 代以后，這個(gè)細(xì)胞系就有可能不靠譜了。
接下來，咱們講講穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建。
一般來講 shRNA 用的是 HIV 病毒，雖然已經(jīng)經(jīng)過處理，但是一聽這名字也覺得滲人，無論如何保護(hù)自己是在實(shí)驗(yàn)室永葆青春的基礎(chǔ)，所以一定要保護(hù)好自己，需要生物安全柜（往里吹風(fēng)最好），或者超凈臺(tái)（把風(fēng)給關(guān)了 （*^__^*））。（下圖是慢病毒構(gòu)建載體示意圖）
病毒來了，需要分裝，-80 保存，反復(fù)凍融影響病毒活性，一般情況系，我是將病毒分成 10 ul 一管。其次是看清你自己的病毒情況，是熒光標(biāo)記（一般 GFP），還是非熒光標(biāo)記 （一般標(biāo)簽蛋白是過表達(dá)是 Flag，敲降是 scramble）。
元元做的是腫瘤相關(guān)實(shí)驗(yàn)，所以咱們這里講的是貼壁的腫瘤細(xì)胞的穩(wěn)轉(zhuǎn)，一定注意，元元講的是普適的方法，一定要看廠家的說明書。一般先用帶有 GFP 熒光的病毒摸一下合適的病毒量。先做一下預(yù)實(shí)驗(yàn)，（別人都講 MOI 值，即感染時(shí)病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值），元元不講。
1. 慢病毒轉(zhuǎn)染前 18～24 小時(shí)，將貼壁細(xì)胞 以 1×10^5（根據(jù)細(xì)胞大小而定，一般轉(zhuǎn)染前細(xì)胞長(zhǎng)到 40-60% 為宜）孔鋪到 24 孔板中。使細(xì)胞在慢病毒轉(zhuǎn)染時(shí)的數(shù)量為 2×10^5/孔左右。
2. 加入 polybrene6-8 ug/ml（這個(gè)相當(dāng)是破膜劑，只有細(xì)胞膜破了，病毒才有機(jī)會(huì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用），設(shè)置合適的病毒濃度梯度，比如 24 孔板，設(shè)置 5 個(gè)梯度，分別加入病毒量是 0，1，2，3，4，5 ul，37 ℃ 孵育。這時(shí)候用的是無血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。
3. 4～6 h 換液 （正常的含血清的新鮮培養(yǎng)基），繼續(xù)培養(yǎng)，如果慢病毒含有熒光蛋白，一般轉(zhuǎn)染 48 小時(shí)后可見明顯熒光表達(dá)，72 小時(shí)后更加明顯。用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，一般病毒量達(dá)到一定程度之后就熒光強(qiáng)度就不再增加了。
4. 選擇一個(gè)合適的病毒量就可以做實(shí)驗(yàn)了，如果 3ul 的時(shí)候病毒的轉(zhuǎn)染效率已經(jīng)和后面的沒有區(qū)別了，在 24 孔板里，合適的病毒量就是 3ul。這時(shí)候就可以構(gòu)建的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系了。
5. 當(dāng)你把實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組轉(zhuǎn)完病毒后 24 h 就可以進(jìn)行嘌呤篩選，因?yàn)椴《巨D(zhuǎn)完之后轉(zhuǎn)染效率不可能達(dá)到 100%，而慢病毒在構(gòu)建的時(shí)候就含有嘌呤抗性基因，一旦轉(zhuǎn)入細(xì)胞，嘌呤抗性基因就能表達(dá)嘌呤抗性蛋白，可以抵抗嘌呤對(duì)細(xì)胞的殺傷作用。有人問了，嘌呤濃度怎么定
（一句話摸濃度，在 24 孔板里，設(shè)置不同濃度梯度，48 h 細(xì)胞全部殺死的濃度即為你要的嘌呤濃度），一般在 1 ug/ml 左右，所以設(shè)定濃度一般在 0～4 ug/ml。
常見問題解答
1. 元元，我病毒轉(zhuǎn)染效率不高怎么辦？
答：最簡(jiǎn)單粗暴的方法是加大病毒量，不好使，那么就得從步驟入手了第一：4～6 h 換液的時(shí)間延長(zhǎng)，8～10 h，設(shè)置過夜試試。還有一種是 4～6 小時(shí)換液的時(shí)候用的等量的有血清新鮮培養(yǎng)基稀釋原有的無血清的培養(yǎng)基，不撤掉病毒，繼續(xù)培養(yǎng) 24 小時(shí)，用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基。
2. 元元，我著急做實(shí)驗(yàn)，我不用 24 孔板，行不行，我用瓶，用平皿行不行？
答：如果你病毒量足夠的話，完全可以。那怎么換算呢，根據(jù)細(xì)胞量或者培養(yǎng)基以及底面積自己算個(gè)大概的病毒量就行。
自己換算吧，元元數(shù)學(xué)不好。
3. 元元，還有個(gè)問題是不是擴(kuò)增倍數(shù)越多越好？
答：這個(gè)不是的，HIV 病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒，會(huì)隨機(jī)插入基因組，擴(kuò)增倍數(shù)越大，說明插入基因組的數(shù)量越多，這樣基因被損壞的越多，一般文章非編碼 6～8 倍左右，編碼基因 2～4 倍即可，太多了不好。
4.元元，還有個(gè)問題......
答：今天打烊了。
作者：元元
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