之前寫過一篇培養(yǎng)細(xì)胞的文章，被我刪除了，因?yàn)椴糠钟姓`，這一次的，比較靠譜，有參考價(jià)值。
參考文獻(xiàn)：劉斌等，細(xì)胞培養(yǎng)，第三版。
正文
細(xì)胞復(fù)蘇
概述
復(fù)蘇細(xì)胞要快，快速解凍，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損害。
用品
培養(yǎng)液（復(fù)蘇細(xì)胞一般用血清濃度為20%培養(yǎng)基），吸管，離心管，培養(yǎng)瓶，水浴鍋（提前預(yù)熱）。
步驟
(1)快速解凍細(xì)胞：將凍存管從液氮罐中取出，直接投入37℃溫水中，并輕輕搖動(dòng)令其內(nèi)容物盡快融化。如果凍存管封閉不嚴(yán)，在保存過程中液氮進(jìn)入其中，從液氮罐中取出時(shí)由于溫度升高導(dǎo)致液氮急速氣化而爆炸，因此，必要時(shí)要做好防護(hù)：存取凍存管時(shí)都要佩戴防護(hù)眼鏡和手套，凍存管投人存放溫水的器皿中后應(yīng)立即把蓋子扣上，以防發(fā)生意外。
(2)加培養(yǎng)基+離心：從37 ℃水浴中取出凍存管，用酒精消毒后開啟，用吸管吸出細(xì)胞懸液，注入離心管并滴加完全培養(yǎng)液混合后低速離心，除去上清液。必要時(shí)再重復(fù)用完全培養(yǎng)液漂離心洗1次。
離心方式：800~1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心3~5分鐘。
培養(yǎng)基加多少：1~10倍體積，一般加1倍，比如1毫升細(xì)胞懸液+1毫升培養(yǎng)基。
(3)重懸細(xì)胞+培養(yǎng)：用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，接種培養(yǎng)瓶，放入 CO?培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，次日更換1 次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)細(xì)胞數(shù)可以做適當(dāng)稀釋，接種細(xì)胞密度以5x10e5/mL為宜。
注意：一般先用1毫升培養(yǎng)基，輕輕吹打細(xì)胞沉淀，吹打均勻，再加剩余的培養(yǎng)基放入溫箱。
細(xì)胞換液
物品：移液槍，吸管，PBS（必要時(shí)），培養(yǎng)基。
步驟：1.吸出舊的培養(yǎng)基；2.必要時(shí)PBS洗2~3次；3.加入新的培養(yǎng)基。
時(shí)機(jī)：營(yíng)養(yǎng)液變黃（酸性代謝產(chǎn)物增多，PH下降，營(yíng)養(yǎng)液快消耗完了，營(yíng)養(yǎng)液由桃紅色變?yōu)榈S色）；一般2~3天換液1次，生長(zhǎng)緩慢的細(xì)胞3~4天換一次，沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。
細(xì)胞傳代
原因：細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶，不傳代的話，就會(huì)死。
1.判斷死活：把培養(yǎng)小罐拿出來，顯微鏡偷窺，細(xì)胞死了就可以下班了。圓形的細(xì)胞，一般就是死球了；張牙舞爪的才是活的。
2.丟棄原培養(yǎng)基：吸走原來的培養(yǎng)基（沒有營(yíng)養(yǎng)了，只有代謝廢物，就是細(xì)胞的尿液和屁）。
3.PBS大清洗：沖洗2次左右，把原來培養(yǎng)基的殘余勢(shì)力給全部清除，另外，培養(yǎng)基會(huì)降低胰酶的功力。
4.裂開細(xì)胞：0.05%trypsin大約1ml，裂開細(xì)胞，棒打鴛鴦，讓抱團(tuán)取暖的、躺平粘在瓶底的細(xì)胞離別成單個(gè)光棍細(xì)胞。37度溫箱，1.5~2分鐘左右（然后顯微鏡觀察細(xì)胞的消化情況，據(jù)情況調(diào)整時(shí)間）。然后吹打細(xì)胞（培養(yǎng)瓶的每個(gè)角落都要吹打，盡量避免氣泡），讓他們徹底成為一盤散沙。
5.終止分裂：盡快加入培養(yǎng)基，終止trypsin的七傷拳。培養(yǎng)基的量：trypsin的2倍左右。
6.離心機(jī)（可選）：必要時(shí)，或者閑著沒事干，800轉(zhuǎn)左右，離心3~5分鐘，吸走上清液，徹底清除胰酶的七傷拳。
7.三國演義：把細(xì)胞平均分成3份左右，分裝在新的培養(yǎng)瓶。按照瓶子大?。?/span>T25號(hào)4~5ml），加入培養(yǎng)基（10~20%FBS+雙抗）。
8.培養(yǎng)：搖勻（然后顯微鏡偷窺）。放入溫箱（37度，5%CO2），讓他們自生自滅。
細(xì)胞凍存
先把凍存液配好！細(xì)胞計(jì)數(shù)器消毒（也可以不消毒）！凍存管！
細(xì)胞凍存液:70% 培養(yǎng)基 + 20% FBS + 10% DMSO（二甲基亞砜，DiMethyl SulfOxide）
1.消化細(xì)胞：去除培養(yǎng)基，PBS洗3~5次，0.05%胰蛋白酶消化細(xì)胞，37度培養(yǎng)箱1.5~3分鐘，然后加入2倍體積培養(yǎng)基終止消化。
2.離心：800~1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心3~5分鐘，去除上清液。
3.重懸：細(xì)胞凍存液（70% 培養(yǎng)基 + 20% FBS + 10% DMSO）重懸細(xì)胞，吹打均勻，密度為5~10×106個(gè)/ml，每管1毫升（25號(hào)培養(yǎng)瓶搞2管左右），標(biāo)記。
4.凍存：細(xì)胞凍存盒+異丙醇，先放-80度過夜，然后放入液氮罐。
備注：先把程序降溫盒放常溫，看看里面的異丙醇到不到刻度，不到要補(bǔ)夠（總量250ml）。凍存液不用加抗生素。
細(xì)胞鋪板
原因：把細(xì)胞分成多份，為后續(xù)研究做準(zhǔn)備，過程和細(xì)胞傳代一樣。具體鋪多少，根據(jù)研究目標(biāo)決定。細(xì)胞鋪板以后，只能使用，不能傳代了。
1.清洗+裂開細(xì)胞：PBS清洗兩三次，加入胰酶1mL裂開細(xì)胞大約2分鐘，加入培養(yǎng)基終止胰酶的七傷拳，離心細(xì)胞，丟棄上清液。
2.測(cè)細(xì)胞濃度：再次加入培養(yǎng)基1毫升吹打細(xì)胞（加多了反而不好把細(xì)胞吹打均勻），然后加入2毫升，輕輕地，吹打液體，讓細(xì)胞均勻的分布在溶液中，在玻片上滴入10~20ul細(xì)胞液測(cè)細(xì)胞濃度！
3.鋪板濃度：每個(gè)培養(yǎng)孔的細(xì)胞濃度都要相同，鋪板濃度為2～8×10e4/ml。
比如，測(cè)量下來，細(xì)胞濃度為1×10e6 = 100×10e4/ml。設(shè)定所有孔的濃度為5×10的4次方／mL，那么稀釋20倍就可以啦。
假如每個(gè)孔放1毫升營(yíng)養(yǎng)液，就是1000微升，那么，加入950微升營(yíng)養(yǎng)液+50微升之前的細(xì)胞液體。
4.收工：按照培養(yǎng)小罐的體積加入培養(yǎng)基，把培養(yǎng)基搖勻，放入37度培養(yǎng)箱。
病毒滴度測(cè)定
準(zhǔn)備：檢測(cè)前一天，將293A細(xì)胞鋪板于48孔板中，3.0-8.0 × 104/孔。
1.配制培養(yǎng)基：DMEN培養(yǎng)基+FBS（胎牛血清）+Polybrene+雙抗生素，讓FBS的濃度為10~20%，Polybrene在原來的基礎(chǔ)上稀釋2000倍，讓工作濃度為2~10ug/ml。
2.分裝培養(yǎng)基：按照培養(yǎng)瓶的要求，每個(gè)孔加入相應(yīng)體積的培養(yǎng)基。48孔板，加270μLDMEM培養(yǎng)液（含polybrene）。
3.加入病毒：慢病毒稀釋2倍。加30 μL病毒原液于第一個(gè)EP管中，充分混勻，從中再取30 μL加入下一管EP。依次進(jìn)行梯度稀釋至10萬倍。
4.門診隨訪：24小時(shí)后，PBS洗出含病毒的培養(yǎng)基（用吸管吸入離心管，放入專門的黃色垃圾袋處理），換入新的培養(yǎng)基。
48小時(shí)后，拍照，看看免疫熒光情況。
72小時(shí)后，拍照，看看免疫熒光情況。換入新的培養(yǎng)基。
5.滴度計(jì)算方法：
Virus Titer = cell numbers (of EGFP)× dilution factor/volume (ml) = Titer/ml
例如：10-6孔有六個(gè)熒光，即Virus Titer=6 × 106 /0.25 (ml) = 2.4 × 107 /ml
慢病毒感染靶細(xì)胞
1.鋪板：感染前12-18h，將靶細(xì)胞鋪板于6-孔板上（含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)），第二天感染前，不超過40%-50%的細(xì)胞融合。
2.凍融病毒：輕輕混合凍融的病毒液，不要渦旋。雖然濃縮試劑可保持凍融后的病毒活性，亦應(yīng)注意避免使用反復(fù)凍融的病毒液。
3.配置感染試劑：根據(jù)靶細(xì)胞的培養(yǎng)液的量調(diào)節(jié)病毒和聚凝胺（polybrene）的添加量。病毒感染過程中聚凝胺（polybrene）的最終濃度5-10μg/ml（根據(jù)不同細(xì)胞而不同，推薦使用5μg/ml）。
4.轉(zhuǎn)染：在靶細(xì)胞中加入病毒懸液，感染8-24h。
5.換液：感染8小時(shí)左右后，移除丟棄存留病毒的感染培養(yǎng)液，換成新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)液。注意：廢棄的培養(yǎng)液包含可感染的慢病毒。所有接觸慢病毒的物品，最后均需要滅活處理再丟棄。
6.培養(yǎng)：繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24-48h，在靶細(xì)胞中積累基因產(chǎn)物。
7.收集細(xì)胞：收集細(xì)胞進(jìn)行分析，或者puromycine抗生素再進(jìn)行篩選。
收集細(xì)胞：核酸篇
培養(yǎng)平板最好放置冰上，加入裂解液（6孔板加1毫升），吹打培養(yǎng)皿的底部，把細(xì)胞吹起來，然后吸入EP管，放置冰上，全部操作完成后，-80度保存?zhèn)溆谩?/span>
收集細(xì)胞：蛋白質(zhì)
1.照射熒光：轉(zhuǎn)染病毒且換液后72小時(shí)后看看熒光情況，初步了解細(xì)胞有沒有轉(zhuǎn)染病毒，沒有熒光基本上可以丟了。
2.配置裂解液：蛋白質(zhì)裂解液mRIPPA+蛋白酶抑制劑+磷酸酶抑制劑，旋渦震蕩5秒，然后放在冰上。六孔板每孔200~300ul，最好多配100~500ul，因?yàn)楹竺嬉♂尩鞍踪|(zhì)濃度。
3.裂開：培養(yǎng)皿盡量放冰上，加入混合裂解液，冰上放置5分鐘以上，然后用干凈的細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下（上下左右東西南北四面八方都盡量刮到），用移液槍收集細(xì)胞放入1.5ml的EP管內(nèi)，放置冰上待離心。
4.離心：提前預(yù)冷4°離心機(jī)，蛋白質(zhì)樣品旋渦震蕩5分鐘，12000rpm（或g）離心5~15min。
5.收集：將離心后的上清轉(zhuǎn)移至新的EP管內(nèi)，做好標(biāo)記，若不進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，于-80°冰箱長(zhǎng)期保存。
6.BCA測(cè)蛋白質(zhì)濃度
6.1配液：配置工作液，A液與B液的比例為50：1，配置好后旋渦震蕩5秒以上，放冰上。
96孔板，每孔100ul。
假如10個(gè)樣品，一個(gè)副孔，就是20*100=2000ul。
標(biāo)準(zhǔn)品減半稀釋6次，濃度分別為：1倍，1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64，總共7個(gè)孔，加上1個(gè)副孔，總共14孔，就是：14*100=1400ul。
總共的液體就是2000+1400。
6.2加液：樣本量與工作液的比例為20：1，每個(gè)孔加95ul工作液，5ul蛋白質(zhì)。
6.3孵育：加樣完成，37度孵育30分鐘。
6.4測(cè)濃度：放入機(jī)器測(cè)濃度，先開機(jī)，再打開軟件。96孔板的A對(duì)著機(jī)器的A，蓋子不能放進(jìn)去。按照機(jī)器的模式測(cè)濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照濃度最小的管子，把所有的管子的濃度稀釋成一樣的（盡量用混合裂解液稀釋，沒有么用ddH2O稀釋）。濃度最小的管子，投入的體積=體積最小的管子。剩余的樣品放-80度冰箱。
7.配置WB上樣液：加入蛋白質(zhì)loading，95度煮5~10分鐘，-20度保存。假如是5×的loading，loading的量就是蛋白質(zhì)體積的1/4，6×的就是1/5。
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