一、甲基化的功能
DNA甲基化能關閉某些基因的活性，去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構、DNA構象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達。
二、甲基化與疾病
甲基化狀態(tài)的改變是引起腫瘤的一個重要因素,這種變化包括基因組整體甲基化水平降低和CpG島局部甲基化水平的異常升高,從而導致基因組的不穩(wěn)定(如染色體的不穩(wěn)定、可移動遺傳因子的激活、原癌基因的表達)和抑癌基因的不表達。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，則發(fā)生癌癥的機率提高,例如：胰島素樣生長因子-2（IGF-2）基因印記丟失導致多種腫瘤。
目前腫瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。這是因為人們發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生可能與抑癌基因啟動子區(qū)的CpG島甲基化造成抑癌基因關閉有關。由于CpG島的局部高度甲基化早于細胞的惡性增生，因此甲基化的診斷可以用于腫瘤發(fā)生的早期預測，而且全基因組的低甲基化也隨著腫瘤發(fā)生而出現(xiàn)，并且其隨著腫瘤惡性度的增加而顯著，因此甲基化的檢測可用于腫瘤的分級。
三、甲基化的發(fā)生機制
DNA甲基化主要是通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族來催化完成的。研究人員在真核生物中發(fā)現(xiàn)了3類DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3a、Dnmt3b).Dnmt1一種是維持性甲基化酶;Dnmt2可與DNA上特異位點結(jié)合，但具體作用尚不清楚;Dnmt3a和Dnmt3b是重新甲基化酶，它們使去甲基化的CpG位點重新甲基化，即參與DNA的從頭甲基化。在哺乳動物的生殖細胞發(fā)育時期和植入前胚胎期，其基因組范圍內(nèi)的甲基化模式通過大規(guī)模的去甲基化和接下來的再甲基化過程發(fā)生重編程，從而產(chǎn)生具有發(fā)育潛能的細胞；在細胞分化的過程中，基因的甲基化狀態(tài)將遺傳給后代細胞。
四、甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的機制
①直接抑制
CPG島甲基化直接干擾tf與調(diào)控區(qū)DNA的結(jié)合。例如camp反應元件結(jié)合蛋白(creb)，ap-2，e2f，nfkb等tf不能與相應的DNA位點相結(jié)合。但有些tf如sp1，ctf與甲基化和非甲基化位點都能結(jié)合，這表明甲基化單獨不足以阻止體內(nèi)tf與DNA相結(jié)合。
②間接機制
近年來發(fā)現(xiàn)一些甲基化DNA結(jié)合蛋白如mdbp1，mdb2以及甲基化CPG結(jié)合蛋白如mecp1，mecp2與甲基化DNA特異結(jié)合，抑制基因轉(zhuǎn)錄。其介導轉(zhuǎn)錄抑制的程度取決于甲基化密度和啟動子的強度。如低密度甲基化可完全抑制一些弱的啟動子，但對強的啟動子則收效甚微。
③影響染色體結(jié)構
DNA甲基化還可通過影響染色體結(jié)構來抑制轉(zhuǎn)錄。不僅甲基化啟動子區(qū)形成的核小體抑制體外起始轉(zhuǎn)錄，而且mecp1與甲基化啟動子CPG位點結(jié)合后，可引起染色質(zhì)聚縮成非活性高級結(jié)構，以至于轉(zhuǎn)錄因子不能與其相結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄。DNA甲基化狀態(tài)并非固定不變。在許多哺乳動物組織內(nèi)，基因組甲基脫氧胞嘧啶水平隨老化而下降，在鮭魚、小鼠、大鼠、牛與人類的腦、肝臟、大腸粘膜、心臟和脾臟內(nèi)發(fā)現(xiàn)DNA脫甲基化作用。相反，大鼠肺則不發(fā)生脫甲基化，大鼠腎內(nèi)甲基脫氧胞苷總含量增加。這說明甲基化狀態(tài)隨老化而變化，即發(fā)生甲基化和脫甲基化，但總的說來，更常見的變化似乎是進行性的脫甲基化。這些變化均可導致隨老化而發(fā)生的基因表達變化。
五、DNA甲基化測序方法
1、甲基化特異性的PCR（Methylation-specificPCR，MSP）
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變；隨后設計針對甲基化和非甲基化序列的引物進行PCR。通過電泳檢測MSP擴增產(chǎn)物，如果用針對處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴增片段，則說明該位點存在甲基化；反之，說明被檢測的位點不存在甲基化。
2、亞硫酸氫鹽測序法（BisulfitesequencingPCR，BSP）
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，則未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。隨后設計BSP引物進行PCR，在擴增過程中尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，通過對PCR產(chǎn)物進行測序就可以判斷CpG位點是否發(fā)生甲基化稱為BSP-直接測序方法。將PCR產(chǎn)物克隆至載體后進行測序，可以提高測序成功率，這種方法稱為BSP-克隆測序法。
3、高分辨率熔解曲線法（HighResolutionMelting，HRM）
在非CpG島位置設計一對針對亞硫酸氫鹽修飾后的DNA雙鏈的引物，這對引物中間的片段包含感興趣的CpG島。若這些CpG島發(fā)生了甲基化，用亞硫酸氫鹽處理后，未甲基化的胞嘧啶經(jīng)PCR擴增后轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，樣品中的GC含量發(fā)生改變，從而導致熔解溫度的變化。
六、甲基化的類別
1.DNA甲基化
DNA甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）和少量的N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）及7-甲基鳥嘌呤（7-mG）。在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要出現(xiàn)在CpG序列、CpXpG、CCA/TGG和GATC中。脊椎動物的DNA甲基化一般發(fā)生在CpG位點。經(jīng)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-甲基胞嘧啶。人類基因中約80%-90%的CpG位點已被甲基化，但是在某些特定區(qū)域，如富含胞嘧啶和鳥嘌呤的CpG島則未被甲基化。這與包含所有廣泛表達基因在內(nèi)的56%的哺乳動物基因中的啟動子有關。1%-2%的人類基因組是CpG群，并且CpG甲基化與轉(zhuǎn)錄活性成反比。
2. 蛋白質(zhì)甲基化
蛋白質(zhì)甲基化一般指精氨酸或賴氨酸在蛋白質(zhì)序列中的甲基化。精氨酸可以被甲基化一次（稱為一甲基精氨酸）或兩次（精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（PRMTs）將兩個甲基同時轉(zhuǎn)移到精氨酸多肽末端的同一個氮原子上成為非對稱性甲基精氨酸，或者在每個氮端各加一個甲基成為對稱性二甲基精氨酸）賴氨酸經(jīng)賴氨酸轉(zhuǎn)移酶的催化可以甲基化一次、兩次或三次。在組蛋白中，蛋白質(zhì)甲基化是被研究較多的一類。在組蛋白轉(zhuǎn)移酶的催化下，S-腺苷甲硫氨酸的甲基轉(zhuǎn)移到組蛋白。某些組蛋白殘基通過甲基化可以抑制或激活基因表達，從而形成為表觀遺傳。蛋白質(zhì)甲基化是翻譯后修飾的一種形式。
七、甲基化在胚胎發(fā)育過程的變化
（1）在受精之前，精子和卵細胞中的DNA甲基化程度都很高；而在受精之后，父母的表觀遺傳記憶都被大規(guī)模擦除，到植入前的囊胚階段，胚胎的DNA甲基化水平降到低點。但是在這一全基因組范圍的DNA去甲基化過程中，標記著印記基因的DNA甲基化得以精確維持和保留。
（2）在受精之前，精子基因組DNA甲基化程度顯著高于卵細胞，而在受精之后來自精子的父源DNA去甲基化的速度快于來自卵細胞的母源DNA。到受精卵晚期，父源DNA甲基化程度已經(jīng)低于母源DNA的甲基化程度。
（3）受精卵基因組DNA去甲基化過程呈現(xiàn)強烈的異質(zhì)性，在相同發(fā)育階段的不同受精卵中，基因組DNA的甲基化程度有顯著差異。
（4）在人類早期胚胎DNA甲基化組的大規(guī)模去甲基化過程中，相比于進化上更年輕、更活躍的轉(zhuǎn)座子，進化上更古老的轉(zhuǎn)座子重復序列上的DNA去甲基化程度更徹底，說明人類早期胚胎在植入前的發(fā)育過程中巧妙地在擦去表觀遺傳記憶和抑制轉(zhuǎn)座子重復序列的轉(zhuǎn)座活性之間取得了平衡。
（5）在人類卵母細胞中的非CpG位點上存在相對較高的DNA甲基化修飾，基因區(qū)的非CpG位點的甲基化程度跟相應基因的表達成正相關關系，說明非CpG位點的甲基化可能參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。
八、甲基化在衰老過程的變化
對于多數(shù)脊椎動物的組織，其基因組中總甲基胞嘧啶的含量隨衰老而傾向于減少，從而引起基因組中低甲基化。主要由于：
1.DNA甲基化外源性調(diào)節(jié)與衰老
外源性因素，如與衰老相關的營養(yǎng)因素參與了DNA 低甲基化。食物甲基化供體攝入的不足有可能導致某些基因啟動子發(fā)生去甲基化，而這些標記的改變可能會導致病理情況的發(fā)生和發(fā)展，如肥胖、2 型糖尿病、癌癥、心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)退行性疾病和免疫性疾病等一系列老年性疾病。此外，食物中微量元素的不足也會影響DNA 的甲基化。在老年人中，微量元素鋅、硒等的缺乏會導致一碳代謝的改變，從而也會引起基因組DNA 的低甲基化。
2.DNA甲基化內(nèi)源性調(diào)節(jié)與衰老
DNA 甲基化的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因素主要指機體內(nèi)DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶的活性水平和體內(nèi)其他因素對DNA 甲基化水平的調(diào)節(jié)。
(1)DNA甲基化酶活性改變
隨著年齡的增加，對于保持異染色質(zhì)DNA 超甲基化狀態(tài)起重要作用的Dnmt1 活性逐漸降低，引起被動去甲基化，進而引起在衰老過程中，基因組的DNA 甲基化被逐漸消耗。從出生到衰老的過程中，Dnmt1 的表達量顯著減少，并且Dnmt1 的活性降低可能導致在有絲分裂過程中甲基化模式復制減少。
(2)葉酸代謝的障礙
隨著年齡的增加，作為甲基供體之一的葉酸的攝入及其可利用率降低，葉酸也逐漸減少。衰老時由葉酸調(diào)節(jié)一碳代謝通路中的高半胱氨酸含量增加。而一碳代謝中甲基轉(zhuǎn)移的紊亂是引起血液中高同型半胱氨酸增加的一個主要原因，這也同時增加細胞的S- 腺苷高半胱氨酸，進而抑制DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶活性，導致基因組低DNA 甲基化狀態(tài)。
(3)激素水平的改變
隨著年齡的增大，動物機體內(nèi)的激素水平也相應地發(fā)生一系列的變化。這些激素對于基因組的DNA 甲基化狀態(tài)也產(chǎn)生了一定的影響。隨著年齡的增加，性激素的減少可能會引起低DNA 甲基化。
九、甲基化與X染色體失活
哺乳動物中GpC島胞嘧啶的甲基化與X染色體失活密切相關,若GpC島甲基化缺失,X染色體失活狀態(tài)將不穩(wěn)定。
哺乳動物中, 雌性體細胞內(nèi)存在兩條X染色體, 而在雄性體細胞內(nèi)只存在一條X染色體, 這就要求必須對不同數(shù)量的X染色體進行劑量補償,使雌性個體中的一條X染色體失活。X染色體失活一旦建立則保持穩(wěn)定,其所有的子細胞均失活同一條X染色體。
當一個卵子與精子形成一個雌性胚胎時,X特異性失活轉(zhuǎn)錄本(Xinactive-specifictranscript,xist)可以通過甲基化使來自于父方的那條染色體失活。xist基因5′端在活性的X染色體中是完全甲基化的, 而在失活的X染色體上則是非甲基化的, 也就是說xist基因是在失活X染色體上轉(zhuǎn)錄而在活性X染色體上不轉(zhuǎn)錄的唯一基因, 即xist基因的甲基化是相應染色體保持活性的保證。
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