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細(xì)胞核內(nèi)的DNA轉(zhuǎn)錄生成各類RNA，其中mRNA（messenger RNA, 信使RNA）翻譯生成蛋白質(zhì)，ncRNA（noncoding RNA，非編碼RNA）不具備編碼能力，不能被翻譯成蛋白質(zhì)。（圖片來(lái)源：網(wǎng)絡(luò)）

2002年，德國(guó)科隆的研究人員發(fā)現(xiàn)了某一非編碼 RNA 實(shí)際上是能編碼的信使 RNA（mRNA）。這條 RNA 有679個(gè)核苷酸，因其長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸，之前被列為長(zhǎng)非編碼RNA（lncRNA）。轉(zhuǎn)錄該 RNA 的基因是 early nodulin 40（ENOD40），它的兩個(gè)開放閱讀框（ORFs，Open Reading Frames）能夠分別編碼12和24個(gè)氨基酸的微肽。豆類植物樣本的研究證實(shí)了這些微肽在植物中確實(shí)存在，并且與蔗糖合成酶有互作關(guān)系。

mRNA（messenger RNA, 信使 RNA）翻譯成蛋白質(zhì)的過(guò)程簡(jiǎn)圖。如今已發(fā)現(xiàn)某些被列為非編碼 RNA 的序列內(nèi)也含有開放閱讀框，也具備編碼翻譯成蛋白質(zhì)的功能。（圖片來(lái)源：Cell）

五年后，日本的研究人員在果蠅中發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)含 ORF、“冒充” lncRNA 的 mRNA。在這項(xiàng)研究中，研究人員通過(guò)抑制每個(gè) lncRNAs 的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)來(lái)分析其在果蠅胚胎中的功能。其中只有一個(gè)表現(xiàn)出明顯的表型，缺失這種 lncRNA 的果蠅胚胎缺少特定的角質(zhì)層特征，這使得它們產(chǎn)生了如稻谷粒樣的光滑外觀，因而該 RNA 被命名為“polished rice”（pri）。pri 基因能編碼四種微肽，其中三種含11個(gè)氨基酸，一種含32個(gè)氨基酸，它們對(duì)激活發(fā)育相關(guān)的某一關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子至關(guān)重要。

此后，又有一些 lncRNAs 加入到 mRNA 的隊(duì)伍中，它們的長(zhǎng)度短于300個(gè)核苷酸，且含有編碼微肽的較短開放閱讀框（short ORFs, sORFs）。數(shù)據(jù)庫(kù)里已有記錄的 lncRNAs 數(shù)目眾多，其中大部分的功能都未知，有很高的機(jī)率發(fā)現(xiàn)其他具備微肽編碼功能的 RNA。搜尋這些微小寶藏的工作已經(jīng)開始，但卻極富有挑戰(zhàn)性，畢竟它們之前被忽略了這么久也是有原因的。

90年代末到21世紀(jì)，隨著不同物種基因組測(cè)序的陸續(xù)完成及相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)的完善，新基因及相關(guān) mRNA 的搜尋工作也隨之展開。研究人員用計(jì)算機(jī)輔助的快捷方法對(duì)數(shù)百萬(wàn)甚至上億的核苷酸進(jìn)行分析，以便明確基因和 mRNA 的序列特征，例如啟動(dòng)子區(qū)、外顯子/內(nèi)含子的剪接位點(diǎn)、開放閱讀框等。

位于起始密碼子和終止密碼子之間能最終編碼蛋白質(zhì)的基因序列即開放閱讀框。（圖片來(lái)源：BRYAN SATALINO）

ORF 可存在于幾乎任何 RNA 序列中，但許多并不編碼實(shí)際的蛋白質(zhì)。由于 ORF 編碼蛋白質(zhì)的機(jī)率隨其長(zhǎng)度增加而增加，因此之前大部分搜尋 ORF 的算法限于300個(gè)核苷酸以上，即至少翻譯100個(gè)氨基酸。這使研究人員能夠過(guò)濾掉那些隨機(jī)存在毫無(wú)意義的 ORF。然而，由于這些算法排除了長(zhǎng)度小于300個(gè)核苷酸的開放閱讀框，不可避免地遺漏了微肽編碼序列，它們作為“算法產(chǎn)生的垃圾”被篩除在外而慘遭遺忘。

除了算法規(guī)則和人為疏忽，還有其他技術(shù)原因?qū)е逻@種情況。比如，利用電泳分離不同大小的肽段往往意味著會(huì)丟失微肽。因?yàn)榕艿鞍踪|(zhì)凝膠電泳時(shí)，微肽很容易從凝膠底部跑出去。蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)微肽的確定也存在問題，因?yàn)橘|(zhì)譜實(shí)驗(yàn)步驟中有一步是洗脫，只有較大的蛋白質(zhì)被保留了下來(lái)用做后續(xù)分析。

比起序列更長(zhǎng)的 ORF，小鼠、果蠅和魚等模式動(dòng)物器官中較短的 ORF在隨機(jī)突變的篩選中很難被發(fā)現(xiàn)，意味著對(duì)它們功能的揭示也更困難。另外，許多重要蛋白質(zhì)是基于不同物種間的保守性來(lái)確定的，ORF 越短就越難被發(fā)現(xiàn)，與其他物種基因組進(jìn)行比對(duì)、分析其是否保守也會(huì)越困難。

不過(guò)，隨著對(duì)基因組中更多 lncRNAs 功能分析的進(jìn)行，編碼微肽的 IncRNA 不斷地被發(fā)現(xiàn)。例如，2014年2月，哈佛大學(xué)的研究人員在斑馬魚中發(fā)現(xiàn)了一個(gè) lncRNA，其編碼的微肽有58個(gè)氨基酸，它是斑馬魚胚胎早期發(fā)育相關(guān)的細(xì)胞移動(dòng)所必需的一類信號(hào)蛋白。另一項(xiàng)研究在小鼠胚胎心臟和骨骼肌里發(fā)現(xiàn)了多個(gè)候選目標(biāo)，其中有一個(gè)序列高度保守的 IncRNAs，在其序列保守區(qū)既有起始密碼子又有終止密碼子，能編碼46個(gè)氨基酸。研究者稱之為 myoregulin，它是參與調(diào)控肌肉緊張度的一個(gè)重要的鈣泵調(diào)節(jié)器。

諸如此類多年來(lái)躲在雷達(dá)下的微肽就像金礦一樣存在著，等待我們積極地去挖掘。

研究者們開展了大量的 RNA 測(cè)序去識(shí)別 sORFs，并用質(zhì)譜尋找可能的肽段。但是這項(xiàng)技術(shù)每次只能分析少量的 sORFs。直到2009年，一種叫做核糖體圖譜分析（ribosome profiling）的新方法被開發(fā)出來(lái)，結(jié)合核糖體相關(guān) RNA 的深度測(cè)序技術(shù)，能夠快速地在全基因組水平對(duì)不同大小的開放閱讀框進(jìn)行大規(guī)模分析。

這項(xiàng)技術(shù)是由核糖體足跡分析（ribosome footprints）方法發(fā)展而來(lái)，該方法是明確與蛋白質(zhì)翻譯機(jī)器相關(guān)的 RNA 的最直接的方法。在核糖體足跡分析中，研究人員首先將核糖體相關(guān) RNA 分離出來(lái)，用核酸酶消化掉不被核糖體保護(hù)的 RNA，分離回收被核糖體保護(hù)的 RNA，然后對(duì)這部分 RNA 短片段測(cè)序并進(jìn)行后續(xù)分析。由于非編碼 RNA 有時(shí)也會(huì)與核糖體有關(guān)聯(lián)，該方法仍需要質(zhì)譜技術(shù)驗(yàn)證所得 RNA 產(chǎn)生的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中是否存在。

用于搜尋與蛋白質(zhì)翻譯有關(guān)的編碼 RNA 的核糖體足跡分析方法。（圖片來(lái)源：BRYAN SATALINO）

之前的核糖體足跡分析方法只能分析單個(gè)特定的轉(zhuǎn)錄翻譯信息，無(wú)法用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的所有事件。當(dāng)新一代測(cè)序技術(shù)出現(xiàn)之后，才得以一次性讀取成百上千的“足跡”，由核糖體足跡分析技術(shù)改進(jìn)成的核糖體圖譜分析技術(shù)，能最大程度地獲得整個(gè)轉(zhuǎn)錄組的翻譯信息。

Ingolia 等人設(shè)計(jì)的核糖體圖譜分析技術(shù)的主要步驟。圖片來(lái)源：WIREs RNA

2011年，Ingolia 等人報(bào)道了小鼠胚胎干細(xì)胞基因組中，非編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄出的大多數(shù) lncRNAs 實(shí)際上與核糖體有關(guān)聯(lián)。這篇論文是一個(gè)里程碑，它證明了編碼區(qū)以外也存在很多蛋白質(zhì)翻譯事件。

編碼微肽的 sORFs 相關(guān)轉(zhuǎn)錄組的確存在。除此之外，他們還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核內(nèi)某些有明確功能的 lncRNAs 也與核糖體有關(guān)聯(lián)。例如，端粒酶 RNA 作為經(jīng)典 lncRNA，其實(shí)是端粒 DNA 復(fù)制的模板；參與 RNA 剪接的小核 RNA，在核糖體圖譜分析中顯示出了高度的翻譯特性。需要注意的是，占用核糖體（ribosome occupancy）的 RNA 并不表示就一定真正的翻譯成蛋白質(zhì)。

與核糖體關(guān)聯(lián)的某些 RNA 可能僅僅參與翻譯調(diào)控，與核糖體也可能只是隨機(jī)互作，這種互作關(guān)系甚至?xí)a(chǎn)生微小的非功能肽，或因其不穩(wěn)定而被迅速降解。為了辨別核糖體圖譜分析得到的真正翻譯事件，核糖體釋放分?jǐn)?shù)（ribosome release score）作為度量標(biāo)準(zhǔn)被提出來(lái)，該標(biāo)準(zhǔn)基于核糖體結(jié)合的 RNA 片段在全長(zhǎng) mRNA 分子上的分布狀態(tài)。當(dāng)核糖體沿著 ORF 翻譯至終止密碼子時(shí)，核糖體與轉(zhuǎn)錄本的關(guān)系也隨之終止，它們會(huì)從 mRNA 上釋放下來(lái)。翻譯成蛋白質(zhì)的 RNA 編碼區(qū)相比下游非翻譯區(qū)，應(yīng)顯示出更大比例的核糖體足跡片段，意味著終止密碼子之后的 RNA 片段與核糖體的關(guān)聯(lián)在核糖體圖譜中會(huì)有顯著下降，而對(duì)于經(jīng)典的非編碼 RNA 則不是這樣。

核糖體釋放分?jǐn)?shù)簡(jiǎn)圖。（圖片來(lái)源：Guttman lab）

核糖體釋放分?jǐn)?shù)評(píng)估了與核糖體結(jié)合的RNA片段沿整個(gè) RNA 分子的分布情況。真正編碼的 RNA 的 ORF 應(yīng)該比終止密碼子后的序列有更大比例的核糖體關(guān)聯(lián)區(qū)域。（圖片來(lái)源：BRYAN SATALINO）

使用了該標(biāo)準(zhǔn)的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)基因間的 lncRNAs 確實(shí)是不編碼的，但有5%左右的 lncRNAs 的核糖體釋放分?jǐn)?shù)與編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄本類似。對(duì)于數(shù)以萬(wàn)計(jì)的 lncRNAs 來(lái)說(shuō)，5%是一個(gè)龐大的數(shù)字，暗示著可能會(huì)有數(shù)量龐大的微肽存在。

為了證實(shí) sORF 的翻譯事件并明確其產(chǎn)生的微肽，基于核糖體足跡圖譜、序列保守性、同義突變頻率及其他特征的研究，研究者們研發(fā)出了新的度量標(biāo)準(zhǔn)和算法（比如：Fragment Length Organization Similarity Score （FLOSS），Phylogenetic Conservation Score of a sORF （PhyloCSF））。2015年11月研究者們建立了名為 sORFs.org 的 sORF 數(shù)據(jù)庫(kù)，用于積累和搜集有關(guān) sORFs 及其翻譯能力的數(shù)據(jù)。

現(xiàn)在，數(shù)據(jù)庫(kù)里有小鼠、果蠅和人類核糖體圖譜分析研究所確定的全部 sORFs，目前存有高達(dá)266342個(gè) sORFs，但各類篩選指標(biāo)能將這個(gè)龐大的列表進(jìn)一步縮小。經(jīng)過(guò)嚴(yán)格篩選，來(lái)自人類的數(shù)據(jù)列表已降至約400個(gè)強(qiáng)候選 sORFs。同時(shí)，研究者們系統(tǒng)地開展了蛋白質(zhì)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)，用以明確算法得到的微肽是否真的在細(xì)胞中存在。

一旦確定了某個(gè)新的微肽，就要用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)探索其功能。這個(gè)過(guò)程進(jìn)展較慢。不過(guò)研究者們已經(jīng)明確了幾個(gè)新的微肽的功能。2016年1月，研究者報(bào)道了一個(gè) lncRNA 編碼的被稱作 dwarf open reading frame（DWORF）的微肽，它是含有34個(gè)氨基酸的肌肉特異性微肽，在小鼠心臟中大量表達(dá)，能夠調(diào)節(jié)肌肉收縮，但在缺血人體心臟組織中的表達(dá)被抑制，提示可能與心臟衰竭有關(guān)。另一項(xiàng)新發(fā)現(xiàn)是一類感染人類巨細(xì)胞的病毒 lncRNA編碼的微肽，它能在以前感染過(guò)的患者中引起T細(xì)胞免疫應(yīng)答，提示這類微肽很可能具有免疫原性，也說(shuō)明了微肽在某些疾病發(fā)生過(guò)程中的重要性。

隨著研究人員對(duì)基因組小片段進(jìn)行更仔細(xì)地梳理，更多微肽的生物學(xué)功能將會(huì)被發(fā)現(xiàn)。如你所見，它們可能因短小的序列而被忽視，其 sORFs 也可能被埋在統(tǒng)計(jì)學(xué)噪聲里，而翻譯微肽的 RNA 也可能被錯(cuò)誤歸類，但這都并不妨礙它們扮演重要角色，行使著舉足輕重的基本生物學(xué)功能。