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近期，Molecular Cell和Cell Research刊登了三篇有關(guān)環(huán)狀RNA具有翻譯能力的研究，可謂一石激起千層浪，打破了傳統(tǒng)的環(huán)狀RNA是非編碼RNA的概念，進(jìn)一步拓展了環(huán)狀RNA的功能，豐富了蛋白質(zhì)組的組成，意義重大。由此，我們不禁要問(wèn)，其他的非編碼RNA，特別是長(zhǎng)非編碼RNA，擁有與mRNA類(lèi)似的結(jié)構(gòu)和小的開(kāi)放閱讀框，是否也具有編碼的能力呢？有趣的是，雖然長(zhǎng)非編碼RNA一經(jīng)鑒定出來(lái)就被定義為非編碼RNA，但是關(guān)于它們編碼潛能的探索，卻沒(méi)有停止。
小編將通過(guò)9幅圖，給大家梳理環(huán)狀RNA和長(zhǎng)非編碼RNA翻譯能力的研究進(jìn)展。需要注意的是，雖然已有個(gè)別非編碼RNA被實(shí)驗(yàn)證明可以翻譯出小肽，有大量非編碼RNA被生物信息學(xué)預(yù)測(cè)可以翻譯出小肽，但也有研究發(fā)現(xiàn)，絕大部分非編碼RNA即使結(jié)合在核糖體上，也仍然是不翻譯的。這兩個(gè)陣營(yíng)的研究都在9幅圖里，希望幫大家快速了解有關(guān)非編碼RNA的編碼研究。
中國(guó)科學(xué)院王澤峰研究員在Cell Research上發(fā)表題為《Extensive translation of circular RNAs driven by N6-methyladenosine》的研究論文，發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA上的甲基化修飾m6A可以驅(qū)動(dòng)非帽依賴(lài)性的翻譯機(jī)制來(lái)合成蛋白質(zhì)。RNA m6A修飾是近年來(lái)RNA表觀遺傳學(xué)的研究熱點(diǎn)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)m6A與胚胎發(fā)育和疾病，特別是腫瘤，都密切相關(guān)。RNA m6A的研究多集中在mRNA上，可影響mRNA的翻譯效率和穩(wěn)定性，而環(huán)狀RNA上的m6A修飾，此前尚屬空白。王澤峰研究員此前已發(fā)現(xiàn)在環(huán)狀RNA上插入IRES（核糖體進(jìn)入位點(diǎn)）序列可促進(jìn)環(huán)狀RNA的翻譯，然而在對(duì)照序列樣品中，竟然也發(fā)現(xiàn)有蛋白的翻譯。通過(guò)對(duì)這個(gè)看似矛盾的現(xiàn)象進(jìn)行仔細(xì)的分析，研究人員發(fā)現(xiàn)所有的對(duì)照序列竟然都包含m6A修飾位點(diǎn)，這提示m6A修飾可促進(jìn)環(huán)狀RNA的翻譯（圖1）。
研究人員通過(guò)分析MeRIP-seq數(shù)據(jù)，證明內(nèi)源環(huán)狀RNA確實(shí)含有m6A修飾，并利用IP，RIP和CLIP-seq等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)m6A的閱讀蛋白YTHDF3可與翻譯起始因子eIF4G2高結(jié)合，促進(jìn)翻譯（圖2）。
以上實(shí)驗(yàn)證明在體外構(gòu)建含m6A修飾的環(huán)狀RNA，導(dǎo)入細(xì)胞后可以翻譯，那么內(nèi)源的含m6A修飾的環(huán)狀RNA是否可以翻譯呢？遺憾的是，研究人員在對(duì)蛋白質(zhì)組的質(zhì)譜進(jìn)行分析后，并未找到符合他們預(yù)測(cè)的環(huán)狀RNA編碼的肽段。
如果說(shuō)找到內(nèi)源可翻譯的環(huán)狀RNA是為它摘掉“非編碼”帽子的鐵證，那么接下來(lái)這兩篇Molecular Cell的文章可以說(shuō)大大減少了上篇文章的遺憾。
意大利科學(xué)家Irene Bozzoni發(fā)表《Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis》的研究，證明在肌肉發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的環(huán)狀RNA Circ-ZNF609，可翻譯小肽。
研究者首先通過(guò)RNA測(cè)序技術(shù)，在人和老鼠的肌肉發(fā)育模型中鑒定到一系列差異表達(dá)的環(huán)狀RNA，通過(guò)大規(guī)模的功能篩選，最終確定circ-ZNF609在肌肉發(fā)育中扮演重要角色。在探究circ-ZNF609促進(jìn)肌肉發(fā)育的分子機(jī)制時(shí)，研究人員驚喜的發(fā)現(xiàn)circ-ZNF609具有開(kāi)放閱讀框，暗示其具有編碼蛋白的能力。將體外構(gòu)建的含F(xiàn)LAG標(biāo)簽的環(huán)狀RNA載體導(dǎo)入細(xì)胞后，通過(guò)western blot的檢測(cè)，可以看到在目的位置有明顯的條帶，說(shuō)明人工構(gòu)建的帶FLAG標(biāo)簽的circ-ZNF609是可以翻譯的（圖3）。
那么，內(nèi)源的circ-ZNF609同樣可以翻譯嗎？為了解決這個(gè)問(wèn)題，研究者利用CRISPR技術(shù)，將FLAG標(biāo)簽敲入circ-ZNF609的編碼區(qū)域以檢測(cè)內(nèi)源蛋白的表達(dá)。由于篩選到的單克隆細(xì)胞只成功地在一個(gè)circ-ZNF609基因座位插入了FLAG標(biāo)簽，而circ-ZNF609的等位基因則仍是野生型，理論上導(dǎo)致能檢測(cè)到的蛋白量減半，所以并未能通過(guò)western blot檢測(cè)到內(nèi)源蛋白的表達(dá)。研究者將目光轉(zhuǎn)向蛋白質(zhì)譜的方法，并在質(zhì)譜的肽段比對(duì)中成功得到了circ-ZNF609的肽段（圖4）。
綜合以上結(jié)果，研究者證明了環(huán)狀RNA circ-ZNF609具有翻譯的能力，但是關(guān)于circ-ZNF609促進(jìn)肌肉細(xì)胞發(fā)育的功能，研究者并沒(méi)有解釋這是環(huán)狀RNA本身的功能，還是其編碼的蛋白的功能。未來(lái)還需要更多的研究來(lái)探索該類(lèi)新來(lái)源的蛋白的功能及機(jī)制。
以色列科學(xué)家Sebastian Kadener的文章《Translation of CircRNAs》則是通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)環(huán)狀RNA的開(kāi)放閱讀框，結(jié)合核糖體展示技術(shù)的數(shù)據(jù)，分析可與核糖體結(jié)合的環(huán)狀RNA，從而系統(tǒng)地分析了果蠅中具有編碼潛能的環(huán)狀RNA，表明環(huán)狀RNA的翻譯能力在進(jìn)化上可能是保守的，并發(fā)現(xiàn)果蠅中大部分可翻譯的環(huán)狀RNA與其線性的mRNA共享翻譯起始序列，暗示環(huán)狀RNA翻譯的產(chǎn)物與線性mRNA的產(chǎn)物具有類(lèi)似的5’端結(jié)構(gòu)（圖5）。
以上三篇文章，在人，小鼠和果蠅中鑒定了一批具有翻譯潛能的環(huán)狀RNA，那么同樣是非編碼RNA的長(zhǎng)非編碼RNA可以翻譯出蛋白嗎？其實(shí)早在2011年，美國(guó)科學(xué)家Jonathan S. Weissman就通過(guò)核糖體展示技術(shù)發(fā)現(xiàn)有大量的lincRNA結(jié)合在核糖體上，表明它們有可能被翻譯（圖6）。黑點(diǎn)表示lincRNA，藍(lán)點(diǎn)表示蛋白編碼基因的編碼區(qū)（protein-coding），可以看出有很多l(xiāng)incRNA與protein coding有相同的翻譯效率（translational efficiency）。
2016年，Nature上發(fā)表John G. Clohessy和 Pier Paolo Pandolfi的研究成果《mTORC1 and muscle regeneration are regulated by the LINC00961-encoded SPAR polypeptide》，發(fā)現(xiàn)之前被鑒定為長(zhǎng)非編碼RNA的LINC00961有編碼的能力，其編碼的小肽SPAR可抑制mTORC1的活性。值得注意的是，研究人員制備了SPAR的內(nèi)源抗體，證明該非編碼RNA編碼的小肽確實(shí)在體內(nèi)存在。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明，如果突變小肽的起始密碼子ATG，可以在不影響LINC00961表達(dá)的情況下，使小肽不表達(dá)，而這樣的變體是不具備抑制mTORC1活性的功能的。該實(shí)驗(yàn)說(shuō)明LINC00961以其編碼的小肽發(fā)揮功能，而不是RNA本身（圖7）。
看到這，大家是不是已經(jīng)躍躍欲試了呢？小編要啰嗦幾句，關(guān)于非編碼RNA可編碼的研究，還需大膽假設(shè)，小心求證。
2012年，nature chemical biology發(fā)表John L rinn和alan saghatelian的論文《peptidomic discovery of short open reading frame–encoded peptides in human cells》。該研究通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)譜的分析，鑒定了新的小肽，并利用肽段序列比對(duì)回基因組來(lái)確定產(chǎn)生的新的小肽的基因。他們發(fā)現(xiàn)只有極少數(shù)的小肽來(lái)源于ncRNA，說(shuō)明大部分ncRNA是不翻譯的（圖8）。
而2013年Cell上的文章，則更加直白，Eric S. Lander發(fā)表題為《Ribosome Profiling Provides Evidence that Large Noncoding RNAs Do Not Encode Proteins》，該研究認(rèn)為，現(xiàn)在大部分關(guān)于非編碼RNA可編碼的研究都基于對(duì)核糖體展示技術(shù)的數(shù)據(jù)分析，不可否認(rèn)，確實(shí)有很多非編碼RNA結(jié)合在核糖體上，但這并不意味著它們被翻譯了。得出這樣驚人的結(jié)論，主要是基于核糖體在mRNA的結(jié)合是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程（圖9.1）。40S的核糖體小亞基首先結(jié)合在5’UTR區(qū)，識(shí)別到起始密碼子的時(shí)候，60S的核糖體大亞基才會(huì)與小亞基結(jié)合，形成80S的復(fù)合體。這樣的翻譯復(fù)合體在遇到終止密碼時(shí)會(huì)分離開(kāi)，所以理論上3’UTR是不應(yīng)該存在核糖體結(jié)合的。傳統(tǒng)的RNA翻譯效率的計(jì)算，只考慮了RNA在核糖體上結(jié)合的數(shù)量，而沒(méi)有考慮核糖體在RNA的非翻譯區(qū)的釋放過(guò)程，所以研究者重新定義了翻譯效率的計(jì)算公式（圖9.2），只有當(dāng)核糖體在同一條RNA的翻譯區(qū)（ORF）結(jié)合量明顯高于非翻譯區(qū)的結(jié)合量，才認(rèn)為該RNA是被翻譯的。經(jīng)過(guò)這樣的計(jì)算，大部分的lincRNA與mRNA的翻譯區(qū)都區(qū)別開(kāi)了（圖9.3）
通過(guò)以上9幅圖的梳理，我們可以看出，有關(guān)非編碼RNA可編碼的研究，一直非編碼RNA領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，雖然個(gè)別環(huán)狀RNA和長(zhǎng)非編碼RNA產(chǎn)生的小肽被證明有功能，但是大部分的研究多還集中在鑒定和預(yù)測(cè)上。如果想要在該領(lǐng)域取得突破的成績(jī)，并不輕松，難點(diǎn)在與如何證明非編碼RNA產(chǎn)生的小肽是內(nèi)源的以及他們的功能機(jī)制又是什么。未來(lái)期待有更多的研究和方法，打開(kāi)非編碼RNA的編碼大門(mén)！
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