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佐劑的概念
1.1常規(guī)免疫佐劑：傳統(tǒng)的概念認(rèn)為，當(dāng)一種物質(zhì)先于抗原或與抗原混合同時(shí)注射于動(dòng)物體內(nèi)，能非特異性地改變或增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原的特異性免疫應(yīng)答，發(fā)揮其輔佐作用者，都稱之為佐劑。最新的概念認(rèn)為，凡是可以增強(qiáng)抗原特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)均稱為佐劑。其本身可以有抗原性，也可以沒有抗原性。
1.2新型免疫佐劑：對(duì)于新型免疫佐劑目前還無具體概念，新型免疫佐劑是應(yīng)新型疫苗而產(chǎn)生，狹義上講是指可以增強(qiáng)新型疫苗免疫應(yīng)答的佐劑。廣義上將近年來將在鋁佐劑、礦物油乳劑和蜂膠佐劑基礎(chǔ)上研究和開發(fā)的免疫佐劑統(tǒng)稱為新型免疫佐劑。
1.3 佐劑的作用機(jī)理
1.3.1增加抗原分子的表面積，提高抗原物質(zhì)的免疫原性。某些免疫增強(qiáng)劑表面可以吸附許多抗原，使抗原表面積明顯增加，促進(jìn)了巨噬細(xì)胞對(duì)抗原的加工遞。
1.3.2延緩抗原的釋放，保護(hù)抗原不被水解。如油佐劑、納米乳、聚乙二醇等。
1.3.3激活單核巨噬細(xì)胞，活化T細(xì)胞和B細(xì)胞。某些免疫增強(qiáng)劑，如葡聚糖、短小棒狀桿菌，主要作用于巨噬細(xì)胞，使之激活，大量分化增殖，釋放白細(xì)胞介素-I（IL-1）等細(xì)胞因子，再進(jìn)一步活化T細(xì)胞和B細(xì)胞。
1.3.4誘導(dǎo)T細(xì)胞的作用。一些佐劑的主要作用對(duì)象是T細(xì)胞，通過T細(xì)胞的介導(dǎo)，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，如胸腺肽、分支桿菌及其相關(guān)成分（如卡介苗、香菇多糖、左旋咪唑、二乙胺基二硫代甲酸鈉等）均為T細(xì)胞免疫增強(qiáng)劑。它們作用于胸腺淋巴系統(tǒng)，誘導(dǎo)T細(xì)胞分化增殖，形成效應(yīng)細(xì)胞，產(chǎn)生淋巴因子。
1.3.5誘導(dǎo)B細(xì)胞的敏感性。某些佐劑直接作用于B細(xì)胞，如細(xì)菌脂多糖等以B細(xì)胞為主要靶細(xì)胞，使之克隆增殖，并誘導(dǎo)B細(xì)胞對(duì)Th細(xì)胞的敏感性，從而增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答，提高抗體水平。
1.3.6非特異性免疫的增強(qiáng)作用。主要是加強(qiáng)NK細(xì)胞和K細(xì)胞的活性，增強(qiáng)機(jī)體的非特異性抗感染能力。這種作用部分是通過誘導(dǎo)干擾素生成而形成的，如香菇多糖、葡萄糖、云芝多糖、果聚糖等在體內(nèi)都能誘生干擾素。目前最為經(jīng)典的是以新城疫病毒疫苗做為干擾素誘生劑來代替常規(guī)昂貴的干擾素制劑。
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新型佐劑的分類
2.1動(dòng)植物來源佐劑
2.1.1植物來源佐劑
目前已發(fā)現(xiàn)至少有200多種植物具有免疫調(diào)節(jié)功能，按分子量分為低分子量和高分子量。低分子量：烷基胺、酚類成分、奎寧、皂角素等。高分子量：蛋白質(zhì)、多肽、多糖、糖脂和植物血凝素等。
免疫機(jī)理：加強(qiáng)細(xì)胞的吞噬功能；刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生各種細(xì)胞因子；刺激抗體的產(chǎn)生。
2.1.2動(dòng)物來源佐劑
殼聚糖：具有激活機(jī)體系統(tǒng)、介導(dǎo)機(jī)體系統(tǒng)的系列生物學(xué)效應(yīng)，提高吞噬細(xì)胞的系統(tǒng)功能。巨噬細(xì)胞表面存在著細(xì)菌多糖的受體，而殼聚糖作為細(xì)菌多糖的類似物，能刺激巨噬細(xì)胞活化，產(chǎn)生如下反應(yīng)：促進(jìn)其吞噬功能，增強(qiáng)它在其它免疫應(yīng)答中的協(xié)同效應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)機(jī)體對(duì)T細(xì)胞、NK細(xì)胞和B細(xì)胞的調(diào)節(jié)，介導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。
盤尾絲蟲的活化相關(guān)的分泌蛋白（Activation-associated secreted protein-1，ASP-1蛋白）：研究發(fā)現(xiàn)ASP-1與多種模式抗原共同免疫時(shí)能誘導(dǎo)Th1型偏倚的Th1/Th2型體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，具有良好的佐劑活性。
艾美耳球蟲profilin蛋白：該蛋白能被固有免疫病原模式識(shí)別受體Toll樣受體11（Toll-like receptors，TLRs）識(shí)別，是TLR11的強(qiáng)效激動(dòng)劑。由于TLR11在IL-12的分泌過程中起著重要作用，然而IL-12主要參與細(xì)胞免疫應(yīng)答，能誘導(dǎo)NK細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，具有較高的佐劑活性。
2.2細(xì)菌來源佐劑
霍亂毒素（cholera toxin，CT）：提高對(duì)多種口服天然抗原的局部黏膜免疫力。
大腸桿菌不耐熱毒素（Heat labile enterotoxin，LT）：協(xié)助DNA疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。
破傷風(fēng)類毒素（tetanus toxoid，TT）：誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生高水平的IgG抗體應(yīng)答。
沙門菌菌毛蛋白（Flagellin）：誘導(dǎo)DCs細(xì)胞增殖和增強(qiáng)對(duì)抗原的遞呈。
細(xì)菌的熱休克蛋白Hsp70：促進(jìn)巨噬細(xì)胞和DCs細(xì)胞對(duì)抗原的遞呈，并傳遞MHC I和MHC II分子。同時(shí)可作用于TLR，增加疫苗的天然免疫效果。
卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）：減毒的牛型分枝桿菌。是預(yù)防結(jié)核病的減毒活苗，也是人類最早使用的疫苗之一。研究發(fā)現(xiàn)卡介苗具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，其主要成分為一類海藻糖合成衍生物可通過刺激機(jī)體產(chǎn)生IFN來增強(qiáng)疫苗的免疫效果。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用最廣泛的佐劑——完全福氏佐劑的主要成分就是分枝桿菌。
細(xì)菌的脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）：存在于G-細(xì)菌的細(xì)胞壁，由一種獨(dú)特的疏水脂和一條很長的重復(fù)的多鏈連接而成。包括O-特異性多糖區(qū)，核心區(qū)和脂A區(qū)。脂A區(qū)具有LPS的主要生物學(xué)活性（包括佐劑活性），主要作用于淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。
2.3人工合成佐劑
脂質(zhì)體：為人工制備的同心磷脂雙層球體，被水間隔。主要組成為卵磷脂（磷脂酰膽堿）、膽固醇、硬脂酰胺、磷脂酸等。最初作為生物膜的模型。1974年發(fā)現(xiàn)它既是生物活性物質(zhì)的載體又是很強(qiáng)的免疫佐劑。
MF59佐劑：MF59佐劑由4.3%的角鯊烯（三十碳六烯）、0.5%的吐溫80、和0.5%的Span85組成。
免疫刺激復(fù)合物（Immunostimulating Complex，ISCOM）：由膽固醇磷脂、可溶性抗原與皂角苷QuilA的質(zhì)量比為1:1:5。這些成分混合形成疏水性結(jié)合的膠體微泡，像籠子一樣的結(jié)構(gòu)，抗原被包在微泡中。作用機(jī)制：1）刺激B細(xì)胞活化，增加抗體的產(chǎn)生；2）誘導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)，刺激產(chǎn)生CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)能吞噬病毒的CTL作用；3）皂角苷QuilA單獨(dú)作用時(shí)具有毒性，但是在形成免疫刺激復(fù)合物時(shí)毒性大大降低，在皮下、腹腔、口服和滴鼻免疫均有佐劑活性。
2.4細(xì)胞因子佐劑
2.4.1白細(xì)胞介素-1（IL-1）：在抗感染免疫、抑制腫瘤細(xì)胞生長（抗腫瘤免疫）及維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡（免疫自穩(wěn)）中起著重要作用。
2.4.2、白細(xì)胞介素-2（IL-2）：促進(jìn)T細(xì)胞生長、誘導(dǎo)或增強(qiáng)CTL細(xì)胞的殺傷活性、協(xié)同刺激B細(xì)胞增殖及分泌抗體、增強(qiáng)活化的T細(xì)胞產(chǎn)生IFN和CSF、誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞表達(dá)IL-2R、促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的成熟和增殖及增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬殺傷能力等免疫生物學(xué)效應(yīng)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)IL-2有助于打破免疫耐受。
2.4.3白細(xì)胞介素-4（IL-4）：激活T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和自身受體IL-4R，增強(qiáng)或抑制抗體的合成。
2.4.4白細(xì)胞介素-12（IL-12）：主要參與細(xì)胞免疫應(yīng)答。誘導(dǎo)NK細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，對(duì)滅活疫苗、腫瘤和寄生蟲抗原具有有效的佐劑活性。誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，對(duì)于以細(xì)胞免疫為主的疫病防治，意義更為重大。
2.4.5白細(xì)胞介素-10（IL-10）：IL-10是一種能促進(jìn)B細(xì)胞分化與增殖的細(xì)胞因子，并且可促進(jìn)產(chǎn)生IgA細(xì)胞的增殖。在口服疫苗方面已證明具有很好的佐劑功能。
2.4.6白細(xì)胞介素-15（IL-15）：IL-15與IL-2有非常相似的生物學(xué)活性，能夠促進(jìn)B細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞和LAK細(xì)胞的增殖分化及細(xì)胞活性，IL-2、4、7、15細(xì)胞因子在記憶性T細(xì)胞產(chǎn)生和存活中發(fā)揮著重要作用，其中IL-15發(fā)揮著更為核心的作用。
2.4.7γ-干擾素（interferons-γ，IFN-γ）：誘導(dǎo)MHC Ⅱ的表達(dá)。IFN-γ主要由T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生。IFN-γ能增強(qiáng)CTL和NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的能力，誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)IL-2R，促進(jìn)Th0向Th1分化，抑制Th2類細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而促進(jìn)T細(xì)胞增殖，進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)。IFN-γ是檢測(cè)疫苗免疫后細(xì)胞免疫水平的重要指標(biāo)。
2.4.8集落刺激因子(colony stimulating factor，CSF)：CSF它能夠增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞（APC）的功能，增加細(xì)胞表面MHC分子、協(xié)同刺激分子（CM）和粘附分子的表達(dá)，以及促進(jìn)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子等。
2.5核酸佐劑
20世紀(jì)最后10年興起的核酸疫苗，代表了第三次疫苗革命。在這一新的疫苗研究熱中，除了研究核酸疫苗的免疫機(jī)理和免疫途徑外，還發(fā)現(xiàn)核酸本身具有佐劑功能。
2.5.1CpG基序（免疫刺激序列或胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸）
CpG ODN（CpG oligonucleotide）是人工合成的含有非甲基化的胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸（CpG）的寡脫氧核苷酸（ODN），可模擬細(xì)菌DNA刺激多種哺乳動(dòng)物包括人的免疫細(xì)胞。
近年來研究發(fā)現(xiàn)，人工合成的CpG DNA在18個(gè)堿基以上，一般不超過22-30個(gè)堿基，其中以含有1-2個(gè)CpG結(jié)構(gòu)的作用最佳。
對(duì)人體特異性最強(qiáng)的CpG結(jié)構(gòu)：5’-TGTCGTT-3’
對(duì)小鼠特異性最強(qiáng)的CpG結(jié)構(gòu)：5’-TGACGTT-3’
CpG ODN免疫佐劑的功能：1）對(duì)B淋巴細(xì)胞的作用：直接激活B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白；2）對(duì)巨噬細(xì)胞的作用：直接激活巨噬細(xì)胞，并激活多種Th1類細(xì)胞因子的分泌，如IL-12、TNF-α和IFN-β等；3）對(duì)NK細(xì)胞的作用：通過輔助細(xì)胞刺激細(xì)胞因子（如IL-12、IFN-α/β和TNF-β）的釋放，間接地作用于NK細(xì)胞；4）對(duì)淋巴細(xì)胞的作用：在單核細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子（如IFN-γ）的作用下間接激活T淋巴細(xì)胞。
CpG-ODN應(yīng)用前景：合成的CpG-ODN可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL-2、NK細(xì)胞分泌IFN-γ，這些細(xì)胞因子可誘導(dǎo)Th1細(xì)胞的分化。CpG-ODN與鋁鹽佐劑、細(xì)胞因子佐劑、細(xì)菌源佐劑、和植物源佐劑均具有協(xié)同刺激活性，能誘導(dǎo)強(qiáng)的體液免疫、細(xì)胞免疫和粘膜免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，CpG-ODN對(duì)治療病毒感染、哮喘、過敏性疾病及腫瘤均有良好效果，顯示了強(qiáng)大的應(yīng)用前景。
2.5.25-氮胞苷（5-azacytidine，5AC）
5AC可與CpG-ODN發(fā)揮聯(lián)合佐劑功能，對(duì)于MHCI分子缺陷的腫瘤，5AC可以使抑癌基因基因去甲基化，激活腫瘤細(xì)胞中MHCI分子的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞可以被機(jī)體免疫系統(tǒng)所識(shí)別。
2.5.3雙鏈RNA
雙鏈RNA侵入機(jī)體后，能夠被TLR3所識(shí)別，誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路活化，產(chǎn)生I型干擾素，進(jìn)而誘導(dǎo)NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、DC等天然免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子及趨化因子，調(diào)節(jié)和增強(qiáng)免疫應(yīng)答，長期以來被認(rèn)為是非常好的干擾素誘生劑。poly (I:C)（聚肌苷酸胞苷酸）是一種人工合成的雙鏈RNA類似物，同樣與TLR3結(jié)合，是高效的干擾素誘導(dǎo)劑，也是免疫調(diào)節(jié)劑，具有抗病毒、抗腫瘤作用。poly(I:C)及一些動(dòng)物的肝臟組織已成功地應(yīng)于臨床，預(yù)防和治療病毒性傳染病和免疫低下等相關(guān)疾病。如雙鏈RNA與狂犬病疫苗聯(lián)合應(yīng)用可明顯增強(qiáng)疫苗的免疫效果。
2.6其他類型佐劑
如胸腺肽、轉(zhuǎn)移因子、宿主保護(hù)肽、抗菌肽和增加疫苗靶向性或抗原遞呈效果的配體元件。
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新型佐劑展望
隨著疫苗學(xué)及基礎(chǔ)免疫學(xué)的飛速發(fā)展，新型佐劑的研發(fā)與應(yīng)用面臨著巨大挑戰(zhàn)，然而佐劑作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍不夠深入，使得新型佐劑的進(jìn)一步發(fā)展困難重重。新型佐劑的安全性、有效性、選擇性和可控性的有機(jī)結(jié)合將成為發(fā)展的必然趨勢(shì)，也是佐劑最終通過臨床試驗(yàn)考核，全面應(yīng)用所應(yīng)具備的基本條件。
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