導(dǎo)讀：
記憶印記是什么？
記憶印記（Memory Engram）：20世紀(jì)初，德國科學(xué)家、記憶研究者和進(jìn)化生物學(xué)家理查德·塞蒙（Richard Semon）第一次提出了記憶印記的概念。他認(rèn)為一個(gè)經(jīng)驗(yàn)/一段經(jīng)歷會(huì)激活大腦中一群稀疏的神經(jīng)元，引起這部分神經(jīng)元內(nèi)的持久的化學(xué)或物理的改變，繼而形成記憶。這群神經(jīng)元被稱為這一經(jīng)驗(yàn)的“印記神經(jīng)元”，這些神經(jīng)元內(nèi)的化學(xué)或物理變化被稱為記憶印記。當(dāng)我們處于記憶中的某個(gè)場景中，這群神經(jīng)元會(huì)被重新激活，記憶也就被提取出來。
圖1 理查德·塞蒙（Richard Semon）
在Richard Semon的有生之年，記憶印記理論并沒有得到人們的重視。因?yàn)楫?dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)無法標(biāo)記記憶印記，也就無法驗(yàn)證該理論是否正確。隨著近幾年光遺傳、藥物遺傳、轉(zhuǎn)基因工具鼠、病毒標(biāo)記等技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們在該領(lǐng)域終于獲得突破性進(jìn)展，他們利用這些技術(shù)不僅證實(shí)了學(xué)習(xí)和記憶過程中“印記神經(jīng)元”的存在，而且還能操縱這些“印記神經(jīng)元”的活性改變記憶，甚至可以操縱這些神經(jīng)元“產(chǎn)生”一個(gè)新的記憶[1]。
現(xiàn)在該領(lǐng)域仍然存在一些問題沒有解決：
一個(gè)印記中的神經(jīng)元的功能是不是異質(zhì)性的？我們是否可以通過分子和細(xì)胞手段區(qū)分印記中不同的神經(jīng)元集合？它們是否通過不同的突觸和回路機(jī)制來調(diào)節(jié)記憶引導(dǎo)的適應(yīng)行為?
1.簡介
2020年4月16日，麻省理工麥戈文大腦研究所林映晞（YingXi Lin）團(tuán)隊(duì)在《Cell》雜志發(fā)表一篇名為“Functionally Distinct Neuronal Ensembles within the Memory Engram”的文章。
通過依賴Nsap4和依賴Fos的兩套R(shí)AM報(bào)告系統(tǒng)標(biāo)記出兩群與恐懼記憶相關(guān)的印記神經(jīng)元，他們發(fā)現(xiàn)：
①Fos標(biāo)記的神經(jīng)元群介導(dǎo)記憶的泛化，并接受來自內(nèi)側(cè)內(nèi)嗅皮層的興奮性突觸輸入。
②Npas4標(biāo)記的神經(jīng)元群介導(dǎo)記憶的辨別，并接受來自表達(dá)膽囊收縮素CCK中間神經(jīng)元的抑制性輸入。
他們的研究提供了記憶印記內(nèi)功能異質(zhì)性的因果證據(jù)，并揭示了突觸和環(huán)路調(diào)控記憶泛化-記憶辨別的平衡。
2.正文
1
依賴Fos和依賴Npas4的活動(dòng)標(biāo)記報(bào)告系統(tǒng)
作者采用F-RAM/N-RAM報(bào)告系統(tǒng)，結(jié)合Tet-off調(diào)控系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了在特定的時(shí)間窗內(nèi)標(biāo)記Fos依賴或Npas4依賴的神經(jīng)元。當(dāng)給予強(qiáng)力霉素(Doxycycline，DOX)處理時(shí)，DOX會(huì)競爭性的與tTA結(jié)合，從而抑制下游報(bào)告基因的表達(dá)；而去除DOX后，tTA能與報(bào)告基因上游的TRE結(jié)合而啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)[2]。
體外實(shí)驗(yàn)：體外培養(yǎng)的神經(jīng)元激活后Fos和Npas4均表達(dá)。
體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：①條件恐懼導(dǎo)致Fos和Npas4的表達(dá)。②分別敲除Fos和Npas4，發(fā)現(xiàn)F-RAM和N-RAM標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)量明顯減少。
共同證明了F-RAM和N-RAM能夠分別標(biāo)記Fos和Npas4依賴的神經(jīng)元群。
2
Fos和Npas4分別標(biāo)記了記憶印記中的不同神經(jīng)元。
Q:DG（海馬齒狀回）中F-RAM和N-RAM標(biāo)記的神經(jīng)元是否為不同的神經(jīng)元群？
（1）利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)分別記錄了這兩群神經(jīng)元的突觸特性。條件恐懼之后：
①F-RAM標(biāo)記的神經(jīng)元與相鄰未被標(biāo)記的神經(jīng)元相比，mEPSC的頻率更高，這說明Fos 神經(jīng)元接受興奮性輸入。
②N-RAM標(biāo)記的神經(jīng)元與相鄰未被標(biāo)記的神經(jīng)元相比， mIPSC的頻率更高，這說明Npas4 神經(jīng)元接受更多的抑制性輸入，
這表明上述兩群神經(jīng)元具有不同的突觸特征。
（2）運(yùn)用Fos-CreER小鼠將表達(dá)內(nèi)源Fos的神經(jīng)元標(biāo)記為綠色。同時(shí)在小鼠的DG區(qū)分別注射F-RAM/N-RAM-mKate2（mKate2，一種紅色熒光蛋白）標(biāo)記病毒。在條件恐懼記憶回想過程中：
①F-RAM 神經(jīng)元（紅色）與內(nèi)源性的Fos-CREER 神經(jīng)元（綠色）共定位比較明顯；
②N-RAM （紅色）與Fos-CREER 神經(jīng)元（綠色）有較少的共定位。
這說明F-RAM和N-RAM標(biāo)記的是兩群不同的神經(jīng)元。
3
在記憶提取時(shí)，F(xiàn)os和Npas4標(biāo)記的神經(jīng)元群表現(xiàn)出不同的活動(dòng)模式
Q：F-RAM 和 N-RAM標(biāo)記的兩群神經(jīng)元的在條件恐懼記憶中的功能是否相同？
行為范式：第一天先將小鼠放在環(huán)境A中對(duì)其進(jìn)行了條件恐懼記憶的訓(xùn)練。第二天，分別將小鼠放到A環(huán)境，B環(huán)境（與A環(huán)境類似），C環(huán)境（與A環(huán)境完全不同）中檢測小鼠在ABC不同環(huán)境中的恐懼水平。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)：
①F-RAM標(biāo)記的神經(jīng)元對(duì)AB環(huán)境的反應(yīng)沒有差異，說明這群神經(jīng)元編碼記憶泛化。
②N-RAM標(biāo)記的神經(jīng)元對(duì)ABC反應(yīng)都不同，說明這群神經(jīng)元編碼記憶辨別。
③光纖記錄神經(jīng)元的活動(dòng)，可推測出同樣的結(jié)果。
F-RAM 神經(jīng)元群編碼記憶泛化， N-RAM 神經(jīng)元群編碼記憶辨別。
4
Fos和Npas4標(biāo)記的不同神經(jīng)元群調(diào)控記憶泛化和辨別的平衡。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證神經(jīng)元的功能，作者采用化學(xué)遺傳的方法對(duì)神經(jīng)元的活動(dòng)進(jìn)行調(diào)控，觀察小鼠的行為變化。
作者將表達(dá)hM3Dq激活型/hM4Di抑制型的化學(xué)遺傳病毒注射在DG區(qū)，使其在F-RAM或N-RAM標(biāo)記的神經(jīng)元中表達(dá)。在恐懼記憶回想時(shí)給予小鼠CNO處理，操控F-RAM或N-RAM標(biāo)記的神經(jīng)元活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：
①抑制F-RAM神經(jīng)元，記憶辨別能力增加。激活F-RAM，記憶辨別能力降低。記憶泛化能力增加。
②抑制N-RAM，記憶辨別能力降低。激活N-RAM，記憶辨別能力不變（作者解釋：被動(dòng)驅(qū)動(dòng)）。
以上結(jié)果表明F-RAM神經(jīng)元群編碼記憶泛化；N-RAM神經(jīng)元群編碼記憶辨別。
5
Fos 神經(jīng)元群接收來自內(nèi)側(cè)內(nèi)嗅皮層的興奮性輸入，Npas4 神經(jīng)元接收來自CCK中間神經(jīng)元的抑制性輸入。
Q:這兩群神經(jīng)元的功能異質(zhì)性是不是因?yàn)樗鼈兎謩e接受不同的環(huán)路輸入？
作者通過電生理實(shí)驗(yàn)對(duì)此假設(shè)加以論證。DG腦區(qū)接受來自外側(cè)內(nèi)嗅皮層（LEC）、內(nèi)側(cè)內(nèi)嗅皮層（MEC）、齒狀門（Hilus）的興奮性投射，將刺激電極分別置于這三個(gè)腦區(qū)中，記錄DG腦區(qū)F-RAM 神經(jīng)元的電生理特性，發(fā)現(xiàn)：
只有在刺激MEC時(shí)F-RAM標(biāo)記的神經(jīng)元產(chǎn)生較強(qiáng)的興奮性突觸后電流。說明DG中F-RAM標(biāo)記的神經(jīng)元主要接受來自MEC的興奮性輸入。
在DG區(qū)的GABA能神經(jīng)元中表達(dá)ChR2，然后給與不同功率的光刺激，發(fā)現(xiàn)：
激活GABA能神經(jīng)元會(huì)能誘導(dǎo)N-RAM產(chǎn)生mIPSC，并且隨著光刺激功率的增大N-RAM產(chǎn)生的mIPSC也增大，且N-RAM主要接受來自CCK神經(jīng)元的抑制性輸入。
6
神經(jīng)元群的不同突觸特性是由學(xué)習(xí)誘導(dǎo)產(chǎn)生的。
Q:前面的結(jié)果表明在同一記憶印記中存在F-RAM和N-RAM標(biāo)記的兩群神經(jīng)元，它們有不同的突觸特性，那么突觸特性差異是神經(jīng)元的內(nèi)在屬性還是通過學(xué)習(xí)獲得的？
作者在小鼠DG區(qū)注射能表達(dá)Fos和Npas4的病毒，發(fā)現(xiàn)人為的誘導(dǎo)fos和Npas4會(huì)分別導(dǎo)致突觸后EPSC和IPSC的增加。這些結(jié)果表明，激活fos/Npas4依賴的通路足以誘導(dǎo)F-RAM 神經(jīng)元和Ｎ-RAM 神經(jīng)元的突觸可塑性。
作者在小鼠條件恐懼記憶訓(xùn)練階段，給予小鼠不同強(qiáng)度的足部刺激，發(fā)現(xiàn)：
電刺激越強(qiáng)小鼠產(chǎn)生的恐懼記憶越強(qiáng)，突觸活性也越強(qiáng)。
這些結(jié)果表明：不同神經(jīng)元群的突觸特異性是由不同的活動(dòng)依賴通路驅(qū)動(dòng)的學(xué)習(xí)誘導(dǎo)的突觸修飾的結(jié)果。
7
內(nèi)側(cè)內(nèi)嗅皮層MEC的輸入介導(dǎo)記憶泛化，CCK的輸入介導(dǎo)記憶辨別。
Q:前面研究表明F-RAM及N-RAM標(biāo)記的神經(jīng)元接受不同的神經(jīng)輸入，這些輸入的神經(jīng)元對(duì)小鼠行為有沒有影響？
MEC——F-RAM 輸入：
① 化學(xué)遺傳抑制MEC，記憶辨別能力增強(qiáng)，記憶泛化能力被抑制。
② 光遺傳抑制MEC，記憶辨別能力增強(qiáng)，記憶泛化能力被抑制。
說明MEC——F-RAM 通路參與記憶泛化。
CCK——N-RAM 輸入：
化學(xué)遺傳特異性的抑制輸入到DG的CCK神經(jīng)元，記憶辨別能力降低。
說明CCK——N-RAM 通路參與記憶辨別。
3.總結(jié)
該研究中，作者構(gòu)建了Fos依賴的RAM（F-RAM）和Npas4依賴的RAM（N-RAM）報(bào)告系統(tǒng)，利用強(qiáng)力霉素Dox依賴的Tet-off系統(tǒng)對(duì)其表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，標(biāo)記條件性恐懼記憶過程中小鼠海馬齒狀回DG區(qū)Fos 的印記神經(jīng)元和Npas4 的印記神經(jīng)元。進(jìn)而利用光遺傳和化學(xué)遺傳特異操縱印記神經(jīng)元的活性，結(jié)合行為學(xué)及電生理檢測等建立這些細(xì)胞活性與相應(yīng)神經(jīng)元功能、動(dòng)物行為的因果聯(lián)系，證明這兩群神經(jīng)元在記憶泛化(generalization)與記憶辨別中（discrimination）存在差異，研究還鑒定出其中的突觸和環(huán)路機(jī)制，從而為“記憶印記形成中存在功能各異的神經(jīng)元集群”提供了關(guān)鍵因果證據(jù)。
參考文獻(xiàn)：
1.https://zhuanlan.zhihu.com/p/136406829
2.https://zhuanlan.zhihu.com/p/138649543
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