基于NK細(xì)胞受體的CAR-T細(xì)胞療法
自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞是一類具有殺傷腫瘤細(xì)胞能力的天然免疫細(xì)胞，可通過細(xì)胞毒性和釋放細(xì)胞因子等方式，抵抗病毒或腫瘤細(xì)胞的侵襲。作為人體重要的免疫細(xì)胞之一，NK細(xì)胞在監(jiān)視腫瘤的過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，并以一種與抗原無關(guān)的方式表現(xiàn)出對異常細(xì)胞的強(qiáng)大殺傷能力。正常情況下，NK細(xì)胞處于被抑制狀態(tài)，一旦激活性受體被激活，NK細(xì)胞從抑制狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，通過直接裂解、釋放穿孔素方式殺傷腫瘤細(xì)胞。NK細(xì)胞發(fā)生缺陷或受體缺陷將導(dǎo)致腫瘤發(fā)生概率增加。
01 NK細(xì)胞概述
細(xì)胞來源于造血干細(xì)胞，分布廣泛。NK細(xì)胞約占外周血淋巴細(xì)胞的10%~15%，由造血干細(xì)胞分化而來，具有獨立于T細(xì)胞和B細(xì)胞之外的發(fā)育途徑。NK細(xì)胞廣泛分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴結(jié)等。其中，以外周血和脾、淋巴結(jié)中NK細(xì)胞活性最高。
細(xì)胞可以分為兩個亞群。根據(jù)人類NK細(xì)胞表達(dá)CD56分子的表面密度，可以將NK細(xì)胞分為CD56bright和CD56dim兩個亞群。CD56dimNK細(xì)胞占外周血NK細(xì)胞的90%，為終末分化的NK細(xì)胞亞群，以殺傷功能為主，具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性。CD56brightNK細(xì)胞約占外周血NK細(xì)胞的10%，為中間期過渡分化的NK細(xì)胞亞群，以分泌細(xì)胞因子為主，細(xì)胞毒活性較低。
02 NK細(xì)胞的作用機(jī)制
NK細(xì)胞主要通過以下機(jī)制實現(xiàn)其殺傷功能：
分泌殺傷介質(zhì)：穿孔素（Perforin）、顆粒酶（Granzyme）、顆粒溶素（Granulysin）等具有細(xì)胞毒性的溶解性顆粒，誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。
釋放可溶性NK細(xì)胞毒因子（NKCF）：NKCF與靶細(xì)胞表面的NKCF受體結(jié)合后，可選擇性殺傷和裂解靶細(xì)胞。
通過表達(dá)膜TNF家族分子的殺傷效應(yīng)：NK細(xì)胞可以通過膜TNF家族分子（FASL，TRAIL、mTNF等）與靶細(xì)胞膜配體結(jié)合誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。
介導(dǎo)ADCC效應(yīng)：NK細(xì)胞表面表達(dá)FcγR受體，與靶細(xì)胞表面的IgG抗體結(jié)合，產(chǎn)生抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）。
分泌細(xì)胞因子，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能：合成多種小分子蛋白質(zhì)，比如淋巴因子等，與其他免疫細(xì)胞相互作用形成免疫應(yīng)答。
圖1 NK細(xì)胞的作用機(jī)制
03 CAR-NK細(xì)胞概述
NK細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中發(fā)揮細(xì)胞毒作用最重要的細(xì)胞之一，主要依賴于其細(xì)胞膜表面的激活性受體和抑制性受體參與天然免疫和適應(yīng)性免疫。NK細(xì)胞發(fā)生缺陷或受體缺陷將導(dǎo)致腫瘤發(fā)生概率增加。與抗原特異性的經(jīng)典CAR-T細(xì)胞不同，基于NK細(xì)胞受體的CAR-T細(xì)胞可以識別表達(dá)其配體的病毒感染或者突變惡性細(xì)胞，具有多靶點和廣譜性的特點，不僅可用于多種血液系統(tǒng)及實體性惡性腫瘤的治療，而且具有不易耐藥的特點，應(yīng)用前景良好。
CAR-NK又稱為加強(qiáng)版的NK細(xì)胞，是通過基因工程手段修飾使其表達(dá)CAR，將識別腫瘤細(xì)胞表面抗原的抗體（或受體）與激活免疫細(xì)胞所需的信號分子連接，可以突破抑制受體的限制而激活NK細(xì)胞，以增強(qiáng)NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷CAR-NK細(xì)胞療法流程是：首先抽取患者或健康供者外周血，分離、獲得外周血單個核細(xì)胞，然后在體外大量擴(kuò)增NK細(xì)胞；其次通過基因工程修飾，在NK細(xì)胞表面表達(dá)能夠和腫瘤特定抗原結(jié)合的CAR；最后回輸至患者體內(nèi)，能夠特異性識別帶有特定抗原的腫瘤細(xì)胞，引發(fā)免疫反應(yīng)，從而達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的目的。CAR-NK細(xì)胞療法目前還處于試驗研究階段，在臨床前和臨床試驗中已被證明可以殺死血液和實體腫瘤細(xì)胞，顯示了其作為一種具有廣泛臨床應(yīng)用前景的現(xiàn)成產(chǎn)品的潛力。
根據(jù)受體作用，可將NK細(xì)胞的受體分為抑制性受體和激活性受體。抑制性受體主要包括CD161、CLＲG1、PD-1、TIM3、LAG3、CD96、TIGIT、NKG2A等，激活性受體主要包括NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD16等。
NK細(xì)胞受體(激活性受體)能夠直接識別病毒感染細(xì)胞或者突變的惡性細(xì)胞表面的相應(yīng)配體，從而清除和殺傷這些異常的細(xì)胞?；谶@個原理，在制備CAR-T細(xì)胞時，將編碼CAR胞外段中scFv片段的基因變化成為NKG2D或者NKp30等NK激活性受體的基因，然后再轉(zhuǎn)染進(jìn)入T細(xì)胞中，就可以制備出基 于NK細(xì)胞受體的CAR-T細(xì)胞，用于腫瘤的細(xì)胞免 疫治療。與抗原特異性的經(jīng)典CAR-T細(xì)胞不同，這種基于NK細(xì)胞受體的CAR-T細(xì)胞可以識別表達(dá)其配體的病毒感染或者突變惡性細(xì)胞，具有多靶點和廣譜性的特點，不僅可以用于多種血液系統(tǒng)及實體性惡性腫瘤的治療，而且具有不易耐藥的特點，具有非常良好的應(yīng)用前景。
04 CAR-NK細(xì)胞療法臨床轉(zhuǎn)化中面臨的問題
CAR-NK細(xì)胞療法雖然具有巨大的潛力，但要擴(kuò)大其臨床應(yīng)用，仍有一些根本性的問題需要解決。首先，目前的CAR是為構(gòu)建CAR-T細(xì)胞而設(shè)計的，因此不是應(yīng)用于ＮＫ細(xì)胞的最佳選擇。CAR結(jié)合表位的位置及其與CAR-NK細(xì)胞表面的距離影響其結(jié)合抗原和激活CAR-NK細(xì)胞的能力。
其次，外周血NK細(xì)胞的使用受到限制，因為原代NK細(xì)胞通常很難進(jìn)行基因修飾；因此，即使使用病毒載體，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率也非常低，而且在過繼轉(zhuǎn)移設(shè)置下，同種異體NK細(xì)胞只能存活幾周，限制了它們的抗腫瘤效果。
再者，NK細(xì)胞對凍融過程敏感，解凍后NK 細(xì)胞的存活率和細(xì)胞毒性顯著降低。體內(nèi)注射后曾表現(xiàn)出較差的擴(kuò)增和持久性，成熟的人NK細(xì)胞壽命有限，半衰期估計為14天，這限制了它們的臨床效果。最后，異基因NK細(xì)胞可能被Ｔ細(xì)胞污染，導(dǎo)致移植物抗宿主?。ǎ纾颍幔妫簦觯澹颍螅酰螅瑁铮螅?ｄｉｓｅａｓｅ，GVHD）或淋巴增殖障礙。對于CAR-NK細(xì)胞療法在臨床轉(zhuǎn)化中存在的上述安全問題，還需要大量研究，進(jìn)一步建立質(zhì)量監(jiān)管規(guī)范。
05 國內(nèi)外布局CAR-NK細(xì)胞療法的企業(yè)
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藥聞窗
