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2-氨基葡萄糖熒光探針的制備及腫瘤靶向性的研究

單玲玲，曹玉瑤，吳蘭，崔廣同，許曉牧，曹穩(wěn)根

宿州學院生物與食品工程學院生物技術(shù)藥物研究所，宿州234000，安徽

【摘要】  目的：制備2-氨基葡萄糖-FITC熒光探針和2-氨基葡萄糖-ICG02近紅外熒光探針，從細胞水平和動物水平研究熒光探針的靶向性。方法：本實驗選用氨基葡萄糖配體作為“導向基團”，以谷氨酸為連接2-氨基葡萄糖和熒光染料FITC/近紅外染料ICG02的Linker，制備2-氨基葡萄糖．熒光染料FITC/近紅外染料ICG02探針，用TLC、UV-vis和LC-MS鑒定2-氨基葡萄糖熒光探針的化學結(jié)構(gòu)，通過細胞和動物實驗研究熒光探針的靶向性。結(jié)果：實驗結(jié)果證明已成功合成2-氨基葡萄糖-谷氨酸-熒光染料FITC/近紅外熒光探針，并可靶向腫瘤組織，延長其在腫瘤部位的滯留時間。結(jié)論：細胞和動物實驗表明在葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白受體-配體作用的介導下，2-氨基葡萄糖熒光探針可靶向葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白受體高表達的腫瘤細胞和組織。

【關(guān)鍵詞】 2-氨基葡萄糖；熒光探針；靶向性

腫瘤早期的診斷是腫瘤治療中亟待解決的問題，目前在臨床上常規(guī)診療方法有血液學檢查、醫(yī)學影像學檢查等^[1-2]，其中醫(yī)學影像學在現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學檢查中扮演著十分重要的角色。隨著醫(yī)學影像學檢測技術(shù)的革新和迅猛發(fā)展，如多排螺旋CT儀器，可精確到一個斷層1 mm對人體進行全方位的掃描，還可仿真內(nèi)鏡檢查，使早期發(fā)現(xiàn)小組織腫瘤成為現(xiàn)實^[3]。而以¹¹C、¹³N、¹⁵0、¹⁸F等正電子核素為示蹤劑的PET-CT檢測手段在一定意義上被稱為靶向性檢測，放射治療腫瘤可殺死腫瘤細胞，但大劑量的輻射也會造成組織器官的破壞、壞死。因此應(yīng)用核素檢測腫瘤會給人機體帶來一定的風險，有些腫瘤病人，在經(jīng)歷了漫長的放射治療后，或是做多次后續(xù)性輻射檢查，由于體內(nèi)的核素不能及時代謝出體外，當輻射劑量累積到一定程度時，很容易引起機體細胞組織再次癌變^[4-7]。

熒光光學成像是醫(yī)學影像技術(shù)中的重要技術(shù)之一，當今熒光成像越來越多地用于監(jiān)測體內(nèi)分子的行為，成像運用的范圍從細胞、組織水平發(fā)展到全身水平，并有可能用于臨床研究^[7]。近年來隨著分子影像學的不斷發(fā)展，熒光光學活體成像使人們直觀觀察到以體內(nèi)特異分子作為靶點的直接效應(yīng)，同時對分子作用途徑也有了更加深刻的認識^[5]。大多數(shù)熒光染料在體內(nèi)半衰期較短，且對腫瘤組織沒有特異性，因此可將熒光染料結(jié)合一些“導向性基團”制備成熒光探針，以增加生物相容性，延長熒光染料在體內(nèi)的半衰期，并具有一定的靶向性，如將具有靶向性熒光分子探針注入體內(nèi)，通過體內(nèi)的熒光信號強度診斷腫瘤的早期組織^[8-9]。惡性腫瘤細胞代謝旺盛，其獲得能量的重要方式是以葡萄糖為唯一的底物進行無氧酵解，為了獲得更多能量，惡性腫瘤細胞表面高表達葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白受體，因此可將葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白作為靶向靶點^[10-12]。

本課題以氨基葡萄糖作為“導向基團”，選用谷氨酸作為連接2-氨基葡萄糖和熒光染料FITC的Linker，制備2-氨基葡萄糖-熒光染料FITC/近紅外染料ICG02熒光探針，采用TLC示蹤、UV-vis和LC-MS對其化學結(jié)構(gòu)進行表征。在細胞水平利用2-氨基葡萄糖-熒光染料FITC所標記的熒光染料FITC研究探針的體外靶向性；從動物水平通過所標記近紅外染料ICG02染料（2-氨基葡萄糖-近紅外ICG02）證明2-氨基葡萄糖熒光探針的體內(nèi)靶向性。

1.材料與方法

1.1實驗細胞

　　

用于研究2-氨基葡萄糖-熒光染料FITC探針靶向性的細胞株包括人乳腺癌細胞株(MDA-MB-231，MDA-MB-435)和人上皮正常細胞(293T)，購買于上海中科院細胞庫。在培養(yǎng)細胞過程中，將細胞放置于5% CO₂、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其中MDA-MB-231和293T用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，MDA-MB-435用1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，兩種培養(yǎng)基中各含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素。

1.2 化學試劑

用于研究2-氨基葡萄糖-熒光染料FITC探針靶向性的細胞株包括人乳腺癌細胞株(MDA-MB-231，MDA-MB-435)和人上皮正常細胞(293T)，購買于上海中科院細胞庫。在培養(yǎng)細胞過程中，將細胞放置于5% CO₂、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其中MDA-MB-231和293T用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，MDA-MB-435用1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，兩種培養(yǎng)基中各含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素。

ZS-紫外分析攝影儀器180（中國遠明公司），紫外分光光度儀Lambda 35型（上海分析儀器廠），LC-MS（Triple Quad?3500質(zhì)譜系統(tǒng)，美國），S2000光纖光譜儀（美國Ocean Op-tics公司），倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司），流式細胞儀（美國BD公司），U-3310型紫外分光光度儀（上海天肯貿(mào)易有限公司）。

圖1，活化谷氨酸( Fmoc-Glu( OtBu) -OH)的羧基，加入EDC和NHS（摩爾比Glu:EDC: NHS=1：1.2：2），避光50℃攪拌6h，反應(yīng)結(jié)束，用乙醚萃取活化的谷氨酸。然后將活化后的谷氨酸( 42.5 mg，0.1mmol)溶于2 mL DMSO，并加入3 mL含21.5 mg氨基葡萄糖DA (0.1 mmol)的DMSO溶液，常溫攪拌12 h，將反應(yīng)液經(jīng)硅膠柱純化，去除沒有共價偶聯(lián)的谷氨酸和DA片段，得到純化的氨基葡萄糖-谷氨酸( DA-Glu)。將DA-Glu溶于3mL DM-SO，加入0.6 mL乙醇鹽酸溶液，室溫攪拌，TLC跟蹤。反應(yīng)6h完全后，將產(chǎn)物用適量乙醚萃取過夜，將乙醚旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，烘干產(chǎn)物，得到氨基葡萄糖-谷氨酸DA-Fmoc-Glu-COOH。

將DA-Fmoc-Glu-COOH溶于4 mL DMSO中，加EDC和NHS(摩爾比DA-Fmoc-Glu-COOH：EDC: NHS=1：1.2:2)，室溫攪拌4h，用乙醚萃取后加入1 mL0.1 mmol DA，室溫攪拌14 h，將反應(yīng)液經(jīng)硅膠柱純化，得到純化的2DA-Fmoc-Glu，其產(chǎn)率為85%。將溶有0.1 mmol 2DA-Fmoc-Glu 3mL DMSO中加入0.6 mL哌啶，并常溫攪拌6h后，用乙醚萃取得到2-氨基葡萄糖-谷氨酸(2DA-Glu-NH2)。

將0.1 mmol 2DA-Glu-NH₂谷于3 mL DMSO中，加入0.1 mmol FITC，常溫反應(yīng)過夜，反應(yīng)物經(jīng)葡聚糖LH-20柱子純化，氯仿／甲醇(1：1)洗脫分離獲得純2-氨基葡萄糖．谷氨酸．熒光染料(2DA-Glu-FITC)，其產(chǎn)率為80%。

將0.1 mmol ICG02溶于3 mL DMSO中，加入EDC和NHS(摩爾比EDC: NHS=1：1.2:2)，避光50℃攪拌6h，反應(yīng)結(jié)束加入0.1 mmol 2．氨基葡萄糖-谷氨酸( 2DA-Glu-NH2)，常溫反應(yīng)過夜，反應(yīng)物經(jīng)葡聚糖LH-20柱子純化，氯仿／甲醇(1：1)洗脫分離獲得純2DA-Glu-ICG02產(chǎn)率為84%。

用UV-vis、TLC和LC-MS進行化學結(jié)構(gòu)鑒定。

用熒光定量PCR法檢測MDA-MB-231、MDA-MB-435和293T三種細胞中氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運體GULT1mRNA的表達水平。用RNeasy Kit法提取細胞RNA，引物是由南京凱基生物技術(shù)有限公司合成，反轉(zhuǎn)錄cDNA及熒光定量PCR反應(yīng)，按照試劑盒步驟完成。GADPH引物(352 bp)，正義鏈：5'AAGGTCGGAGTCAACGGATTT3'和反義鏈：5'AGATGATGACCCTTTTGGCTC 3'。GLUT1引物(418 bp)，正義鏈：5'TGAGACAGAAGTA-AGTGGGGTT3'和反義鏈：5'TTCATTTTGTGTGT-GTGGGGAG 3'。

將2DA-Glu-FITC熒光探針孵育在三種不同細胞( MDA-MB-231，MDA-MB-435，293T)中37℃12 h后，通過倒置熒光顯微鏡定性分析三種不同腫瘤細胞對藥物的攝取，用流式細胞儀進一步定量分析其不同的攝取量。

取~2×10⁶ MDA-MB-231腫瘤細胞（高表達GLUT1受體）分別接種于裸鼠右側(cè)腋部皮下(n=5)構(gòu)建MDA-MB-231腫瘤模型。接種后，當腫瘤的直徑達到0.4~0.6 cm左右的時候，用于腫瘤鼠近紅外成像實驗。

分別將0.2 mL，5mg/kg Glu-ICG02和2DA-Glu-ICG02(n=5)探針分別通過尾靜脈注射入裸鼠體內(nèi)。在近紅外熒光成像系統(tǒng)下活體實時監(jiān)測Glu-ICG02和2DA-Glu-ICG02在體內(nèi)靶向的動態(tài)過程，并對體內(nèi)代謝情況進行分析。

2.結(jié)果

2.1 2-氨基葡萄糖-谷氨酸-近紅外染料(2DA-Glu-ICG02)及中間產(chǎn)物的表征

2-氨基葡萄糖-谷氨酸中間體( 2DA-Glu)結(jié)構(gòu)鑒定。當用展開劑：乙酸乙酯：石油醚=3:1，TLC點板跟蹤顯示，ICG02外出現(xiàn)了一個新的斑點即所合成產(chǎn)物。該點的遷移率大于ICG02，這是由于2DA-Glu上的氨基與近紅外染料ICG02上的羧基縮合生成酰胺鍵，極性變小，使二者遷移率不同，并在近紅外CCD下顯示ICG02熒光，圖2證明ICG02已與2DA-Glu共價偶聯(lián)生成2DA-Glu-ICG02。

純化后的2DA-Glu用LC-MS分析，其質(zhì)譜鑒定的結(jié)果與2DA-Glu的理論分子量578. 13完全一致，證明已成功合成2-氨基葡萄糖-谷氨酸-紫杉醇中間體。

2.2 2-氨基葡萄糖-谷氨酸-近紅外染料(2DA-Glu-ICG02)結(jié)構(gòu)鑒定

在反應(yīng)過程中用TLC點板，展開劑為：乙酸乙酯：石油醚=4:1，TLC板顯示，2DA-Glu-NH₂外出現(xiàn)了一個新的斑點即所合成產(chǎn)物，其遷移率大于2DA-Glu-NH₂，當2DA-Glu-NH₂的氨基與FITC異硫氰基縮合生成酰胺鍵，極性變小，使二者遷移率不同，并在熒光下顯示FITC的熒光。

用LC-MS鑒定其分子量，其質(zhì)譜鑒定的結(jié)果與2DA-Glu-FITC的理論分子量968. 51完全一致(圖3) ,2DA-Glu-FITC:  MS( ESI, m/z): 968. 51([M-H]+)，因此圖3證明2DA-Glu -NH₂已與FITC共價偶聯(lián)生成2DA-Glu -FITC產(chǎn)物。

2.3 2-氨基葡萄糖-谷氨酸-熒光染料/近紅外染料(2DA-Glu-FITC/ICG02)紫外吸收光譜

用紫外吸收光譜儀對所合成的2-氨基葡萄糖-谷氨酸-熒光染料／近紅外染料探針進行進一步的結(jié)構(gòu)表征。紫外吸收光譜顯示（圖4），2DA-Glu-FITC/ICG02探針有三個吸收峰為220、290、490和780nm，而DA的特征峰值為290 nm，Glu的特征峰值為220 nm，F(xiàn)ITC的特征峰值為488 nm，ICG02的特殊峰值為780 nm，實驗顯示幾個小分子共價偶聯(lián)對DA，F(xiàn)ITC和ICG-Der-02的紫外吸收峰都沒有影響。實驗結(jié)果表明已合成2DA-Glu-FITC/ICG02探針，且各組成成分并未改變原物質(zhì)的紫外吸收特性。

2.4 在細胞水平研究2DA-Glu-FITC探針的靶向性

圖5A顯示兩種腫瘤細胞和一種正常細胞GLUT1轉(zhuǎn)運受體mRNA表達量的順序為：MDA-MB-231>MDA-MB-435>293T。圖5B所示2-氨基葡萄糖-谷氨酸-FITC( 2DA-Glu-FITC)在二種腫瘤細胞和一種正常細胞中孵育12h后，在熒光顯微鏡下可以看到探針在GLUT1轉(zhuǎn)運蛋白的介導下進入腫瘤細胞，并顯示出較強的熒光強度，而在正常細胞293T中熒光強度較弱。用流式細胞儀定量分析前藥在MDA-MB-231、MDA-MB-435和293T細胞中的攝取率分別為85. 6%、80. 12%和5. 3%，且三種細胞對探針攝取的熒光強度有明顯的位移，2-氨基葡萄糖熒光探針在MDA-MB-231腫瘤細胞中攝取量大于MDA-MB435和293T，二種腫瘤細胞的攝取量遠遠超過正常細胞293T，且三種細胞對2-氨基葡萄糖熒光探針攝取量的順序為MDA-MB-231>MDA-MB-435>293T，這與三種細胞表面GLUT1轉(zhuǎn)運蛋白表達量的順序是一致的，證明2-氨基葡萄糖熒光探針可在腫瘤細胞表面高表達GLUT1轉(zhuǎn)運受體的介導下靶向腫瘤細胞。

圖6實驗結(jié)果顯示MDA-MB-231乳腺癌組織是高表達GLUT1轉(zhuǎn)運蛋白受體，將MDA-MB-231細胞株接種在腫瘤鼠的右側(cè)腋下，待腫瘤直徑達到0.4~0.6 cm左右的時候，用NIR成像系統(tǒng)進行實時監(jiān)測，研究2-氨基葡萄糖探針靶向性實驗(n=5)。

在圖6中，分別經(jīng)尾靜脈注射2DA-Glu-ICG02和Glu-ICG02熒光探針后，兩種探針在注射1h后分布到全身，最后逐漸轉(zhuǎn)移到肝-胃腸和肝-腎-膀胱兩條代謝途徑。注射2DA-Glu-ICG02探針2h后，其腫瘤部位開始有熒光信號，隨著探針在體內(nèi)的代謝，熒光探針在腫瘤部位越聚越多，其熒光強度在注射后的8h達到峰值直至12 h，在注射48 h后在腫瘤部位仍有較強的熒光強度。而注射Glu-ICG02熒光探針1h后其探針全身分布，在腫瘤部位也有較強的熒光強度，2h后隨著熒光探針在體內(nèi)的代謝，其腫瘤部位熒光強度逐漸減弱，8h后在腫瘤部位幾乎看不到探針的熒光強度。實驗結(jié)果證明2DA-Glu-ICG02在GLUT1轉(zhuǎn)運蛋白介導下，可靶向腫瘤組織，延長藥物在腫瘤組織中滯留時間。

3.討論

本實驗已成功制備2DA-Glu-FITC/ICG02靶向性熒光探針，并通過TLC、LC-MS和UV-vis對熒光探針進行結(jié)構(gòu)上鑒定，在細胞水平定性和定量分析熒光探針具有較好的靶向性，且熒光探針的靶向性與細胞膜上表達GLUT1轉(zhuǎn)運蛋白mR-NA的高低相關(guān)，用高表達GLUT1轉(zhuǎn)運蛋白mR-NA的MDA-MB-231建立腫瘤模型，用近紅外成像儀實時監(jiān)測熒光探針在腫瘤鼠體內(nèi)的靶向性及代謝途徑，實驗結(jié)果證明2DA-Glu-ICG02熒光探針在GLUT1轉(zhuǎn)運蛋白介導下，可靶向腫瘤組織，并延長其在腫瘤部位的滯留時間，同時可直觀地觀察到熒光探針在體內(nèi)的代謝途徑為：肝-胃腸和肝-腎途徑。此研究結(jié)果表明熒光探針不僅可在細胞水平檢測腫瘤細胞而且可在動物水平檢測腫瘤靶向性和體內(nèi)代謝途徑。

參考文獻 略