茶黃素抗癌作用機理
作者：屠幼英 作者單位：浙江大學茶學系
關于化學致癌過程有許多假說，現(xiàn)在比較公認的是三階段致癌學說，即啟動、促進和進展。一般認為在啟動階段，致癌物在體內經代謝活化形成親電性的終致癌物，與細胞核DNA結合，引起DNA損傷而導致細胞突變；然后在促進階段，細胞分裂時DNA損傷傳給子代得以固定，這一階段是啟動細胞克隆后連續(xù)增殖的過程；隨后，進一步發(fā)展至癌前病變和癌變，即進展階段（圖1）。在這個傳導的過程中只要阻斷其中一個環(huán)節(jié)就可抑制腫瘤產生。國內外學者進行了大量研究，提出了許多可能阻斷腫瘤產生的機理，包括:通過捕獲自由基、阻斷過氧化及DNA損傷而發(fā)揮抗氧化作用；選擇性誘導I、II期代謝酶，促進致癌劑的解毒；抑制細胞過度增殖；誘導細胞凋亡；調節(jié)免疫功能；影響細胞信號傳導途徑等。
茶黃素是茶多酚物質氧化形成的一類能溶于乙酸乙酯、含有多個羥或酚羥基的苯駢卓酚酮化合物，是茶色素的主要成分，共有12種組分，其中茶黃素（TF）、茶黃素-3-沒食子酸酯（TF2A）、茶黃素-3，3’-雙沒食子酸酯（TFDG）和茶黃素-3’-沒食子酸酯（TF2B）是4種最主要的茶黃素。對于紅茶色素的重要品質成分茶黃素，其主要活性物質的抗癌作用和機理取得了許多重要結果，并且對其抑制腫瘤產生的作用機理進行了大量研究，認為其作用的途徑主要集中在癌前啟動和促進二階段。
一、茶黃素類可以在腫瘤起始階段抑制其發(fā)生
（一）茶黃素類對腫瘤細胞的轉錄和生長因子的抑制
Apostolides Z研究表明茶黃素類可能通過抑制細胞色素P450 酶的作用，而將腫瘤遏制在起始階段。TFs和兒茶素對2-氨基-1-甲基-6-苯丙咪唑[4,5-b吡啶] 誘導的突變進行抑制作用研究，結果表明，TFs及含有沒食子酸酯的兒茶素都能抑制PhIP誘導突變（此途徑經過細胞色素P450途徑）。其機制是TFs能清除自由基、超氧陰離子等，并能切斷脂質過氧化鏈式反應。
Nomura M和Chung J認為核轉錄因子激活蛋白-1 (activator protein 1，AP-1)是由基因c-jun(一種原癌基因)編碼的蛋白，是細胞凋亡過程中重要的調節(jié)蛋白分子．也是腫瘤發(fā)生的重要因子，控制與信號傳入有關的基因表達。
NF-kB是一種轉錄因子，存在于胞漿中，并被IKB結合抑制。IKB可以抑制NF-kB與其操縱基因結合。當IKB上Ser32、Ser36磷酸化后，IKB就與NF- kB脫離開，并經泛素途徑分解從而激活NF- kB。具有活性的NF- kB就會啟動iNOS基因轉錄并表達成iNOS合酶（誘導型NO合酶）。在乙酰輔酶Ⅱ等輔因子存在的條件下，這種酶能催化L-精氨酸生成NO。NO是引起炎癥的重要因子，同時在腫瘤的各個階段也發(fā)揮著重要作用，胞內高濃度的NO會導致基因毒性。Tasi等人研究發(fā)現(xiàn)，TFDG可抑制由脂多糖（LPS）激活的鼠巨噬細胞（RAW264.7細胞）中NO和iNOs的產生，TFDG比EGCG強，而其他多酚類沒有這種作用。通過蛋白質印跡法和RT-PCR (逆轉錄聚合酶鏈式反應)分析證實了TFDG可以降低130-kD蛋白的產生，同時抑制iNOs的表達也受到抑制。同樣EMSA分析也顯示TFDG阻止NF-kB活性的降低。其機制是TFDG抑制了IkB中Ser32的磷酸化，并且減少轉錄因子NF-kB亞結構P65和P50的積累從而阻斷腫瘤的發(fā)生。
茶黃素類可以通過抑制AP-l作用和促分裂原活化蛋白激酶的途徑起到抑制癌細胞生長的作用。Nomura M 等通過電泳法、蛋白質印跡法分別分析AP-1的活性和c-jun基因表達，結果表明，TF-3不僅強烈抑制TPA誘導的AP-1活性，同時也是c-jun基因表達的強烈抑制劑，其機制是抑制c-iun蛋白Ser73位點的磷酸化。這說明茶黃素類可以在起始階段抑制腫瘤的生長。
Liang等發(fā)現(xiàn)，TPA（誘變劑）能提高膜結構上PKC激酶的活性，而TFDG可強烈抑制PKC活性的升高，抑制率為94.5％，EGCG的抑制率只有9.4％。TFDG不僅強烈抑制TPA誘導的AP-1活性，同時也是c-jun基因表達的強烈抑制劑，其機制是抑制c-jun蛋白Ser73位點的磷酸化。
在TFs的抑制作用中，H2O2不能發(fā)揮重要作用。Chung等在體外利用小鼠表皮J86細胞層和一個突變形H-ras基因構建模擬的癌細胞，并研究TFs對這些細胞的作用。結果表明：TFs表現(xiàn)出對30.76ras紅細胞生長的抑制及對AP-1作用的抑制。C環(huán)上的沒食子?；梢源龠MTFs對細胞生長及AP-1作用的抑制。在已加入TFs的細胞中加入過氧化氫酶，不能阻止TFs對AP-1作用的抑制。
TFs還可以通過抑制生長因子受體阻斷腫瘤的啟動。Liang 與Yuchih等研究茶黃素和茶紅素對A431細胞和鼠NIH3T3纖維母細胞胞外信號和增殖的抑制，結果發(fā)現(xiàn)，在茶多酚預培養(yǎng)的細胞中，TFDG能抑制由EGF(表皮生長因子)和PDGF（血小板源性生長因子）誘導的EGF受體和PDGF受體自動磷酸化，并且強烈抑制EGF與其受體結合，從而阻斷與游絲分裂相關基因的信號傳導，其作用比EGCG更強。另外上述試驗物分別與EGF同時加入培養(yǎng)液中，結果發(fā)現(xiàn)僅TFDG起作用。
（二） 茶黃素類清除自由基抑制細胞的突變
1．茶黃素的抗氧化機制
（1）抑制自由基產生。生物體內自由基的生成具有多種途徑，其中主要有3種：①分子氧的單電子還原途徑，氧接受一個電子生成O2·¯或再接受一個電子生成H2O2，H2O2失去一個電子生成·OH或再失去一個電子生成H2O。這一過程主要產生O2·¯，正常情況下，生物體約有2％的總耗氧量經呼吸鏈旁路（單電子還原過程）生成氧自由基；②酶促催化產生自由基：機體細胞液中含有一些可溶性酶，如黃嘌呤氧化酶、醛氧化酶、脂氧合酶等，是常見的可產生自由基的酶；③某些生物物質的自動氧化：過氧化物及某些金屬離子的氧化還原均可使機體產生自由基，其中Fe2+催化H2O2產生·OH（Fenton反應）和過渡金屬離子催化LOOH均裂產生脂氧自由基最為常見。茶黃素可通過抑制氧化酶系與絡合誘導氧化的金屬離子途徑達到抑制自由基產生的作用。
（2）抑制氧化酶系。缺血與再灌注、吞噬細胞激活、花生四烯酸代謝異常及補體激活是產生活性氧的重要途徑。其來源主要由兩大細胞系統(tǒng)及多套酶系統(tǒng)?；ㄉ南┧岬娜龡l代謝途徑均伴有活性氧的產生，內皮細胞主要依靠黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)(XO)、中性粒細胞主要依靠髓過氧化酶系統(tǒng)(MPO)及還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化形成氧化型輔酶Ⅱ(NADP)產生活性氧，脂氧化酶和環(huán)氧化酶、NO合成酶等生物體內許多氧化酶與自由基生成相關。相關研究報道表明，茶黃素對上述大部分氧化酶均有抑制作用（表1）。
表 1茶黃素對氧化酶的抑制作用
氧化酶系自由基產生機制茶黃素的活性
黃嘌呤氧化酶
（XO）XO催化次黃嘌呤轉變?yōu)辄S嘌呤，進而催化黃嘌呤轉變?yōu)槟蛩?。反應過程中產生大量的O2·¯與H2O2 (其在金屬離子參與下形成羥自由基)。
在HL－60細胞中，抑制XO產生尿酸并清除過氧化物，且TF3抑制能力均強于TF1、TF2、EGCG。
對H2O2清除能力依次為TF2>TF3>TF1>EGCG。
細胞色素P450 1A1（CYP1A1）
主要參與代謝活化多環(huán)芳烴類（PHAs）化學致癌物的I 相酶，具有芳香烴羥化酶（AHH）活性
PHAs在體內活化過程主要由CYP1A1催化完成，在過程同時產生對身體有害的自由基在HepG2細胞中，抑制由奧美拉唑(OPZ)誘導的CYP1A1的活性。
還原型輔酶Ⅱ（NADPH）NADPH氧化形成氧化型輔酶Ⅱ（NADP）產生活性氧可抑制NADPH的兩個亞單位p22phox和p67phox, 同時上調過氧化氫酶的活性（p<0.05）, 從而減少活性氧的產生。
誘導型一氧化氮合成酶
（iNOS）當一氧化氮（NO）過量，影響細胞內部信號傳導，從而誘發(fā)基因突變、細胞凋亡或腫瘤的發(fā)生。還會使血管內皮細胞產生過氧化，促進 LDL 與泡沫巨噬細胞的作用，進而提高動脈硬化和梗塞的機率。在活化的鼠類的腹膜巨噬細胞中，茶黃素能夠抑制 NO 的產生。逆轉錄聚合酶鏈反應
（RT-PCR）顯示，茶黃素對iNOS有負調節(jié)作用。
脂肪氧合酶花生四烯酸因脂肪氧合酶的酶促氧化，可產生大量的活性氧及其代謝產物，對機體產生損傷與致癌作用。TF2與TF3可有效抑制脂肪氧合酶的活性， 且均強于兒茶素。
此外，茶黃素可通過抑制氧化酶的合成途徑達到抑制氧化酶的作用。Lin, Y. L.等研究表明，TF3對誘導型的一氧化氮合成酶(iNOS)的抑制作用是通過對抑制iNOS mRNA 的表達來實現(xiàn)的。由于核因子kappaB是誘導iNOS所必須的轉錄因子，TF3通過阻斷核因子kappaB的活化，來抑制iNOS的表達。此外，TF3還可以抑制核因子 kappaB的 p65 與p50 亞基的磷酸化，抑制IkappaB激酶(IKK)，從這兩個途徑來最終達到抑制iNOS合成的目的。
（3）茶黃素與誘導氧化的過渡金屬離子絡合
機體內過渡金屬離子是自由基的另一重要來源。過渡金屬離子絕大多數(shù)均含有未配對電子，都是自由基，它們可以催化自由基的形成。體外實驗證明，40μmol/L的茶黃素磷酸鹽與終濃度為40μmol/L銅、鐵離子的硫酸鹽絡合以后，形成的復合物在可見光區(qū)出現(xiàn)了新的吸收峰。當培養(yǎng)基中無金屬離子存在時,巨噬細胞中LDL氧化程度很小，當加入少量FeSO4后,可以有效提高LDL的氧化程度，這表明存在一定金屬離子時會促使LDL的氧化。茶黃素類物質與金屬離子絡合可以直接降低LDL的氧化程度，也可抑制機體內Fenton反應, 起到抑制活性氧自由基產生的作用。同時茶黃素類對機體內金屬離子釋放也具有抑制作用，在400μmol/L以下,TF3可以降低培養(yǎng)基中金屬離子的濃度, 但只有大于400μmol/L時, 效果才達到顯著水平。
（4）直接清除自由基。茶黃素通過抑制自由基的產生途徑而減少自由基，對于機體內固有的自由基，茶黃素則有直接清除作用。體外實驗表明茶黃素能有效清除2, 2'-連氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)(ABTS)自由基，且抗氧化能力的強弱次序為TF3>TF2A=TF2B>TF1。在 HL-60細胞模型中，用四豆蔻的佛波醇醋酸酯(TPA)誘導自由基的產生，在該模型中觀察到茶黃素能抑制約 60%的自由基的形成。
茶黃素除了作為預防性抗氧化劑清除自由基外，可作為鏈阻斷式抗氧化劑清除脂自由基。脂質在活性氧或輻射條件下產生自由基，引發(fā)脂質自由基鏈式反應。茶黃素可與脂質鏈式氧化中間產物－脂自由基或脂氧自由基反應，終止鏈反應而抑制脂質氧化。在鼠巨噬細胞或人內表皮細胞中，TF3能減少細胞低密度脂蛋白(LDL)的氧化,抑制能力強弱依次為TF3>TF1>EGCG>EGC>GA。TF1、TF3與茶紅素均能有效抑制叔丁基過氧化氫誘導鼠肝勻漿脂質過氧化，且能力均強于抗壞血酸、谷胱甘肽(GSH)、BHT和BHA]。在體外實驗中，通過檢測LDL氧化過程中形成的硫代巴比妥酸的反應底物和共軛雙烯，抑制LDL氧化的活性強弱依次為TF3>ECG>EGCG>TF2>TF1>EC> EGC。從LDL氧化過程中共軛雙烯的形成時間的快慢程度看，茶黃素以及兒茶素等能延緩共軛雙烯形成，這一作用的強弱順序為EGCG>茶黃素>α-維生素E。
（5）對抗氧化體系的激活作用。茶黃素除了直接清除自由基或抑制自由基產生外，還能通過激活機體自身的自由基清除機制而增強抗氧化效果。正常情況下，機體自由基維持在損傷閾值以下的平衡態(tài)，而這種平衡態(tài)的維持依賴于機體的抗氧化體系，包括非酶體系和酶體系。生物體抗氧化酶主要有超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱苷肽酶類(包括GSH-Px，GSSG-Tr)和過氧化氫酶(CAT)。抗氧化酶的重要生理功能在于其對自由基的清除作用。茶黃素能有效促進這些抗氧化酶的活性（見《茶葉世界》2007年第21期)。
（6）茶黃素的抗氧化構效關系。茶黃素的強抗氧化活性賦予其獨特的生理功能，使其應用前景廣闊。結構決定性質，茶黃素的卓越的功效源于其獨特的結構。茶黃素的結構中，除了保持了其前體兒茶素 A 環(huán)上的兩個酚羥基外，由兩個B環(huán)形成的苯駢卓酚酮環(huán)結構，也具有3個羥基。還有沒食子酸酯所帶的酚羥基，這些羥基保證了它具有很強的提供質子的能力。
茶黃素的前體物質－兒茶素的A環(huán)與B環(huán)一般情況下比較穩(wěn)定，不易發(fā)生裂環(huán)反應，而在活性氧的作用下，可發(fā)生劇烈的反應，產生雙黃烷醇類物質和羧酸類物質。以往的研究認為兒茶素清除自由基的作用僅與其結構B環(huán)相關，最近的研究報道證實 A環(huán)與B環(huán)均是兒茶素的抗氧化活性的主要位置，且沒食子?；⑽磪⑴c整個反應中。兒茶素在不同活性氧的作用下，會形成不同的反應產物，且反應的活性位置也不同。不同兒茶素在同一活性氧作用下，反應的活性位置也可能不同。這也表明了兒茶素的抗氧化活性位置不僅取決于活性氧的種類，也會受兒茶素本身的結構影響。在DPPH反應體系中，利用NMR技術研究兒茶素結構對其捕獲電子的能力影響結果表明，鄰苯三酚型(焦酚型)兒茶素強于鄰苯二酚型(兒茶酚型)兒茶素；含有共軛羰基的結構會降低兒茶素的抗氧化能力；含有共軛烯雙鍵結構會降低鄰苯三酚型兒茶素的抗氧化能力，卻能提高鄰苯二酚型兒茶素的能力。
二、茶黃素類抗腫瘤轉移
TFs可以促進各種細胞的凋亡，抑制癌細胞的增殖和擴散。Hibasami H等發(fā)現(xiàn)茶黃素類可以抑制胃癌細胞KATO的生長并誘導凋亡。通過形態(tài)學變化觀察可以看到細胞凋亡體。檢測凋亡DNA條帶的結果表明：細胞凋亡與茶黃素類的劑量、時間等成依存關系。Zhang G Y等人的研究結果表明：綠茶、烏龍茶及紅茶提取液可以抑制大鼠腹水肝癌AH109A細胞層的增殖和擴散，但對正常的大鼠M細胞（mesothelia cells, 內皮細胞）無影響。高濃度的紅茶、烏龍茶提取液還可以抑制L929癌細胞的增殖。在加入10％小牛血清時，AH109A細胞可以擴散到M-細胞單細胞層的底部。當利用口腔插管法飼喂茶提取液0.5、1、2、3、5h后，再加入小牛血清，則AH109A細胞的擴散和增殖均得到抑制。茶黃素是紅茶提取液中抑制癌細胞AH109A增殖和擴散最有效的成分，而其作用也與細胞本身的特異性和細胞對茶黃素類作用的高靈敏性有關。根據(jù)Marimaeda-Yamamoto等人的研究，TF可以抑制人體纖維肉瘤HT1080細胞的擴散，并與劑量呈依存關系。
MMPs(金屬巰蛋白)是以鋅為活性中心的蛋白質酶譜，在癌細胞的轉移中具有促進作用，其中MMP-2和MMP-9在癌細胞擴散和轉移中具有重要作用。茶黃素可以與鋅結合，從而抑制MMPs酶的活力，達到抑制癌細胞擴散的目的。根據(jù)Mari的研究TF可以抑制HT1080細胞分泌MMPs，但其濃度范圍與抑制HT1080細胞擴散的濃度范圍不同。Suzuka M等的研究也表明：TF、TF2A、TF2B和TFDG可以抑制鼠肺細胞的擴散。酶譜結果顯示：癌細胞分泌的MMPs中主要包括MMP-2和MMP-9。茶黃素類可以通過抑制MMP-2和MMP-9的分泌來抑制腫瘤細胞的擴散。
據(jù)Lu Jiebo報道，在比較4種主要TFs對正常細胞和癌細胞的生長、凋亡、基因表達的作用時發(fā)現(xiàn),TF(10～50μmo1)能抑制突變體細胞WI38VA(WI38突變體)和Caco-2結腸癌細胞的生長，能在mRNA和蛋白質水平上抑制血清誘導的Cox-2基因的表達，從而誘導細胞凋亡，但對相應的正常細胞沒有影響。Giovanna Cademi等在研究紅茶、綠茶提取物及紅葡萄酒對AOM誘導的小鼠(16周后)腸道腫瘤時發(fā)現(xiàn)，在喂食紅茶提取物和葡萄酒的試驗組中，患腺瘤的小鼠(雄F344鼠)數(shù)量明顯低于對照組(對照組、紅茶、綠茶提取物及紅葡萄酒試驗組中患腺瘤的小鼠分別為86％、59％、90％和50％)，而紅茶組在誘導腫瘤細胞凋亡上又明顯優(yōu)于其他組。形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)，細胞發(fā)生收縮，與相鄰細胞失去聯(lián)系且鉻氨鹽濃度升高，形成圓形或橢圓形的核碎片，從而誘導細胞凋亡。中國預防醫(yī)學科學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所在研究茶色素(包括茶黃素、茶紅素、茶褐素)抗腫瘤作用的實驗中發(fā)現(xiàn)，茶色素10～l00μg/mL對Hela細胞存活的抑制率為2.2％～34．1％ ，對S180在小鼠體內的增殖有明顯抑制作用，并有較明顯的量效關系，表明對腫瘤細胞的增殖階段有抑制作用。Yang發(fā)現(xiàn)TFs可抑制NNK誘導的A／J鼠的肺癌。Morse MA等研究TFs和EGCG對N-硝基化甲基苯甲胺(NMBA)誘導鼠食道癌的影響時發(fā)現(xiàn)，TFs和EGCG濃度在360～1200mg/L可明顯減少其食道癌的形成。
屠幼英等研究了EGCG、TFDG、茶黃素TF、葡萄籽提取物、松樹皮提取物、咖啡堿、槲寄生和茶氨酸的體外抗癌活性，通過人肺癌細胞（A549）進行體外試驗，結果表明除咖啡堿、槲寄生、茶氨酸的作用較小以外，其他幾種均有很強的誘導人肺癌細胞（A549）凋亡的作用。
屠幼英等用TFDG、TF2B及一種未知化合物。采用MTT法和磺酰羅丹明B法研究3種單體和TFS對人胃癌細胞（MKN-28）、人肝癌細胞（BEL-7402）和人急性早幼粒白血病細胞(HL-60)的生長抑制，結果表明，TF2B和未知物的濃度與相應的MKN-28、BEL-7402抑制效果相關性達到極顯著水平，前者對三株癌細胞均顯示了一定的抑制活性；3種單體對前兩種癌細胞的抑制效果均高于TFS。
因此，茶黃素是一種具有特出抑制癌細胞生長的天然生物活性物質。并且根據(jù)楊子銀和屠幼英等分析，茶黃素也是非常有前途的替代合成抗生素的植物類抗生素物質。
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