話說青霉素一：被埋沒的偶然發(fā)現(xiàn)
1928年9月的一天早晨，在英國倫敦圣瑪麗醫(yī)學院擔任細菌學講師的弗萊明(A.Fleming)像往常一樣來到了實驗室。在實驗室里一排架子上，整齊地排列著很多玻璃培養(yǎng)皿，里面分別培養(yǎng)著各種有毒的細菌。弗萊明正在尋找一種能夠制服它們，或把它們變成無毒菌的方法。其中有一種在顯微鏡下看起來像葡萄狀，存在很廣泛，能夠使傷口感染化膿的葡萄球菌。弗萊明試驗了各種藥劑，力圖找到一種能殺它的理想藥品，但是一直沒有成功。
弗萊明來到架子前，逐個檢查著培養(yǎng)皿中細菌的變化。當他拿起靠近窗戶的一只培養(yǎng)皿的時候，他皺起了眉頭，自言自語道：“唉，怎么搞的，竟然變成了這個樣子！”。原來，這只貼有葡萄球菌標簽的培養(yǎng)皿里的培養(yǎng)基發(fā)了霉，長出一團青色的霉斑。
他的助手趕緊過來說：“這是被雜菌污染了，別再用它了，讓我倒掉它吧。”弗萊明沒有馬上把這培養(yǎng)皿交給助手，而是仔細觀察了一會兒。他驚奇發(fā)現(xiàn)，在青色霉菌斑的周圍，有一小圈空白的區(qū)域，原來生長的葡萄球菌消失了。難道是這種青霉菌的分泌物把葡萄球菌殺滅了嗎？想到這里，弗萊明興奮地把它放到了顯微鏡下進行觀察。結果發(fā)現(xiàn)，青霉菌附近的葡萄球菌已經(jīng)全部死去，只留下一點痕跡。
他立即決定，把青霉菌進行培養(yǎng)。幾天后，青霉菌明顯繁殖起來。于是，弗萊明用一根濕線蘸上葡萄球菌，放到青霉菌的培養(yǎng)皿中，幾小時后，葡萄球菌全部死亡。接著，他分別把帶有白喉菌、肺炎菌、鏈球菌、炭疽菌的線放進去，這些細菌也很快死亡。但是放入帶有傷寒菌和大腸桿菌的線時，這兩種細菌照樣繁殖。
為了試驗青霉菌對葡萄球菌的殺滅能力有多大，弗萊明把青霉菌培養(yǎng)液加水稀釋，先是一倍、兩倍……最后以八百倍水稀釋，結果它對葡萄球菌和肺炎菌的殺滅能力仍然存在。這是當時人類發(fā)現(xiàn)的最強有力的一種殺菌物質(zhì)了。
可是，這種青霉菌液對動物是否有害呢？弗萊明小心地把它注射進了兔子的血管，然后緊張地觀察他們的反應，結果發(fā)現(xiàn)兔子安然無恙，沒有任何異常反應。這證明這種青霉菌液體沒有毒性。
通常，在培養(yǎng)微生物時發(fā)生這種情況并不奇怪，這叫污染了雜菌。因為在我們周圍的空氣中漂浮著各種各樣的微生物，如細菌、真菌、酵母，甚至于病毒等，即使經(jīng)過過濾、消毒、滅菌，仍然不會全部去除，有時在接種時還會有的落在培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后長成菌落。按照常規(guī)做法，如果不影響實驗結果，可以忽略；如果有影響，要重新進行實驗。
弗來明沒有按常規(guī)進行處理，他仔細觀察、驗證，才有了青霉素的發(fā)現(xiàn)。弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素雖然代有偶然性，但如果不具備嚴禁的科學態(tài)度和追求探索精神也不會有發(fā)現(xiàn)，同樣前人的經(jīng)驗、知識的積累也給他以莫大的啟示。因此任何重大發(fā)現(xiàn)都是必然的偶然，這種偶然只留給那些有心人。
1929年６月，弗萊明把他的發(fā)現(xiàn)寫成論文發(fā)表。他把這種青霉菌分泌的殺菌物質(zhì)稱為青霉素。
人們向他祝賀。英國一位顯貴建議他申請制造青霉素的專利權，那樣將來就會發(fā)大財。弗萊明經(jīng)過考慮，寫信婉言拒絕了那位顯貴的建議。他說：“為了我自己和我一家的尊榮富貴，而無形中危害無數(shù)人的生命，我不忍心。”
由于青霉素具有抑制細菌的能力，對動物無害，他建議用這種青霉菌培養(yǎng)液作局部外敷來治療潰瘍一類的皮膚感染。但是因為青霉素在培養(yǎng)物中的含量太少，沒有辦法大量制備供給使用。還由于當時人們正熱衷于磺胺藥物研究，把希望寄托在正在風靡的磺胺藥物上。更重要的是1932年克魯?shù)虏伎?Clutterbuck)和1935年瑞德(Reid)根據(jù)弗萊明的發(fā)現(xiàn)，對青霉菌的培養(yǎng)物也進行了研究，并提取了青霉素，他們發(fā)現(xiàn)在水溶液里青霉素性質(zhì)不穩(wěn)定，在室溫下放置時間長了就會破壞，失去殺菌作用。因此，認為不適合用作抗感染性疾病的藥物，也不值得進行深入地化學與生物學的研究。因此，人們就這樣把青霉素放棄了。
話說青霉素二：重新燃起的希望
人類二十世紀的上半葉多災多難，戰(zhàn)爭頻發(fā)，疾病流行，因為無藥救治造成大量死亡。1939年第二次世界大戰(zhàn)爆發(fā)，造成大量傷員，在戰(zhàn)場上沒有死，但因為感染無法控制，許多傷病員在痛苦的煎熬中死去，為拯救傷員性命，急需大量的抗感染藥物進行救治。
于是人們又想到既然青霉素可以殺死葡萄球菌，就有可能殺死能使人致病的細菌。在牛津大學主持病理研究工作的澳大利亞病理學家佛羅理(H.W.Flory)和德國的生物化學家錢恩(E.B.Chian)，仔細閱讀了弗萊明關于青霉素的論文，對這種能殺滅多種病菌的物質(zhì)產(chǎn)生了濃厚的興趣。但是他們知道，要提取出這種物質(zhì)，需要各方面科學家的共同努力。他邀請了一些生物學家、生物化學家和病理學家，組成了一個聯(lián)合實驗組。這之中，德國生物化學家錢恩是他最主要的得力助手。
霍華德. 瓦爾特. 佛羅理（Howard.Walter.Florey）（1898-1968）
恩斯特-保羅斯-錢恩（Ernst. Boris. Chain）（1906-1979）
在佛羅理的領導下，聯(lián)合實驗組開展了緊張地研制工作。微生物學家們每天要配制幾十噸培養(yǎng)液，把它們灌入一個個培養(yǎng)瓶中，在里面接種青霉菌菌種，等它充分繁殖后，再裝進大罐里，送到錢恩那里進行提煉。
提煉工作繁重而艱難，一大罐培養(yǎng)液只能提煉出針尖大小的一點點青霉素。經(jīng)過幾個月的辛勤工作，錢恩提取出了一小匙青霉素。把它溶解在水中，用來殺滅葡萄球菌，效果很好。即使把它稀釋二百萬倍，仍然具有殺滅能力。
聯(lián)合實驗組選擇了50只小白鼠來進行試驗；把每只都注射了同樣數(shù)量，足以致死的鏈球菌，然后給其中25只再注射青霉素，另外25只不注射。實驗結果是不注射青霉素的小白鼠全部死亡，而注射的只有一只死去。
之后，他們開始了更努力的提取工作，終于獲得了能救活一個病人所需的青霉素。醫(yī)生第一次用青霉素救治了一位患敗血癥的危重病人，使當時無法治療的敗血癥病人恢復了健康，這引起巨大的震動。于是青霉素一時成了家喻戶曉的比黃金還要貴重的救命藥物。
社會需求是推動科學技術前進的動力。只要是有益于人類的發(fā)現(xiàn)都不會被埋沒。
話說青霉素三：希望變?yōu)楝F(xiàn)實
這時佛羅理清醒地意識到，為使青霉素能廣泛地用于臨床治療，滿足戰(zhàn)爭的需要，必須改進方法和設備，進行大規(guī)模生產(chǎn)。但這對聯(lián)合實驗組來說非常困難。當時倫敦正遭受德國飛機的頻繁轟炸，要進行大規(guī)模生產(chǎn)也很不安全。1941年6月，佛羅理不顧錢恩的反對，帶著青霉素樣品來到不受戰(zhàn)火影響的美國。他馬上與美國的科學家們開始合作。經(jīng)過共同努力，終于研究成以玉米汁為培養(yǎng)基，在24℃的溫度下進行發(fā)酵的方法和設備，提煉出的青霉素，純度和產(chǎn)量有了大幅度提高。在1943年實現(xiàn)了青霉素的工業(yè)化生產(chǎn)。從而很快開始了在臨床上的應用。
霍華德. 瓦爾特. 佛羅理（Howard.Walter.Florey）（1898-1968）
青霉素制備最早還采用過固體表面培養(yǎng)法，就是使用麩皮、豆餅粉、玉米粉等固體物與水混合制成的固體培養(yǎng)基經(jīng)過加熱滅菌，冷卻后與青霉菌菌種液體混合，放到淺盤里，再將盛有發(fā)酵物的淺盤擺放在室內(nèi)的架子上，保持室內(nèi)溫度和濕度，并經(jīng)常的翻動，進行發(fā)酵。發(fā)酵結束后，用水將產(chǎn)生的青霉素由固體培養(yǎng)基中浸提出來，制成干粉。這個生產(chǎn)過程與過去農(nóng)村使用原始的制曲發(fā)酵生產(chǎn)醬油醋類似。使用這樣的非常原始的生產(chǎn)方法雖然可以生產(chǎn)出青霉素產(chǎn)品，但存在許多問題。
為了獲得足夠量的青霉素，需要大量的培養(yǎng)基和培養(yǎng)室，占用的廠房非常大，這也使得溫度和濕度很難控制；工人在又熱又潮的培養(yǎng)室里，勞動強度非常大，十分辛苦。更重要的是在發(fā)酵過程中，為了通氣，培養(yǎng)基是暴露在空氣中，空氣中的各種微生物會造成大量污染，無法做到純種發(fā)酵，使得每一次的發(fā)酵結果都不相同，很難控制發(fā)酵過程，生產(chǎn)的產(chǎn)品的質(zhì)量也無法保障。象這樣的問題還有很多，因此，當時利用表面培養(yǎng)法生產(chǎn)青霉素的水平很低，發(fā)酵酵價只有40多單位/毫升，提取收率只有20%，產(chǎn)品純度為20%，而且成本很高。按現(xiàn)在對醫(yī)藥產(chǎn)品質(zhì)量要求，這樣的產(chǎn)品很難作為藥物使用。
因此，迫使人們探索新的生產(chǎn)方法。1942年液體深層發(fā)酵法研究成功。所謂液體深層發(fā)酵是指與固體表面培養(yǎng)相反，使用液體培養(yǎng)基在固定的容器內(nèi)發(fā)酵。液體培養(yǎng)基是相對于固體培養(yǎng)基而言，液體培養(yǎng)基中水的含量達到80-90%，而固體培養(yǎng)基的固體物占60-70%，水占30-40%。液體培養(yǎng)基中可能是完全溶解的營養(yǎng)物質(zhì)，也可以含有一定數(shù)量的固體物營養(yǎng)物。
早期大規(guī)模青霉菌的液體培養(yǎng)
因為青霉菌生長和產(chǎn)生青霉素需要氧氣，發(fā)酵過程必需通入大量的空氣滿足它們的需要。而通入普通的空氣是不行的，因為空氣中存在大量的微生物，進入發(fā)酵液中會大量繁殖，造成污染，甚至喧賓奪主，使發(fā)酵遭到破壞。因此，必須徹底地清除通入的空氣中的所有微生物。一般是通過加壓升溫，冷卻除水，多次無菌過濾等方法來實現(xiàn)。這就需要一套制備無菌空氣的設備和工藝。
另外，空氣中的氧氣在水中的溶解速度和量十分有限，為了滿足青霉菌生長和產(chǎn)生青霉素的需要，要加快氧的溶解速度和提高發(fā)酵液中的氧濃度。為解決這個問題，除了加大通氣量外，更重要的是將通入的空氣氣泡打碎、變小。對于同一體積的空氣來說，只有氣泡越小，空氣與液體的接觸面積越大，氧氣在發(fā)酵液中的溶解速度越快，才可滿足菌體的需要。為了實現(xiàn)這一目的，首先要將進入發(fā)酵罐的空氣盡可能的分散成較小的氣泡，然后再通過攪拌打成更小的氣泡，這就需要精益求精的不斷完善設計，改造設備。
攪拌在發(fā)酵過程中還有改善物質(zhì)和熱量傳遞的作用，使發(fā)酵物料混合均勻，防止局部溫度過高，提高加熱和冷卻效率等。但是，攪拌不當，也有負面作用，比如打斷菌絲，傷及細胞，影響細胞的正常代謝和青霉素的合成。因此，為了提高攪拌效率，降低負面影響，對攪拌器的形狀、大小、位置、個數(shù)，以及產(chǎn)生的混合方式都有嚴格要求。影響混合效率的還有發(fā)酵罐的形狀、徑高比，擋板的形狀、數(shù)量、設置位置、形態(tài)等等。這就涉及發(fā)酵罐和輔助設備的設計和加工等一系列的工程設備問題。
對于任何一種微生物來說，它們生長和合成產(chǎn)物時都需要一個適宜的溫度范圍，就象我們?nèi)艘粯訙囟雀吡?、低了都不行。我們可以通過增減衣服，開空調(diào)、暖氣來解決。對于微生物我們沒有辦法給它們穿衣服，但可以采用類似開空調(diào)、暖氣的方法解決。就是在發(fā)酵罐上加上用于冷卻和加熱的夾套和螺旋管，通過通入冷水或熱水進行冷卻或加熱，維持發(fā)酵溫度。
另外，為了保證純種發(fā)酵，也就是只保證能夠產(chǎn)生青霉素的一種青霉菌生長，而不允許其他微生物生長、污染，在接種產(chǎn)生青霉素的青霉菌之前，要對使用的發(fā)酵罐及附帶的設備和培養(yǎng)基進行滅菌、把其中存在的所有微生物全部殺死，防止將雜菌帶入發(fā)酵系統(tǒng)。通常對培養(yǎng)基和發(fā)酵設備進行消毒滅菌都是使用高溫滅菌法，即通入高溫高壓蒸汽進行消毒。滅菌之后還需要進行冷卻，使溫度降到適合微生物生長。微生物在生長、代謝旺盛時會產(chǎn)生大量發(fā)酵熱，使溫度升高，這時需要對發(fā)酵系統(tǒng)進行冷卻，保持適宜的發(fā)酵溫度；發(fā)酵后期，微生物生長緩慢，發(fā)酵熱產(chǎn)生減少，甚至停止，進行產(chǎn)物合成時又需要維持適當溫度，這時又需要進行適當加熱保溫。為了在不同發(fā)酵階段保持適宜的溫度。所以必須有加熱和冷卻裝置和控制系統(tǒng)。
發(fā)酵結束，產(chǎn)生的青霉素還在發(fā)酵液中，必須進行分離。首先要進行過濾，將發(fā)酵液中的固體物質(zhì)，比如菌體和沒有消耗掉的固體營養(yǎng)物組分除去，將濾液用酸調(diào)成酸性，使青霉素成為青霉素酸，然后用有機溶劑乙酸丁酯進行萃取，將青霉素萃取到有機溶劑中，達到分離的目的，經(jīng)脫色，再用堿性水從何含有青霉素的有機溶劑反萃取出來，使青霉素變成鹽，重新溶到水中，經(jīng)過濃縮，進行結晶，經(jīng)過干燥，就可以得到青霉素產(chǎn)品。
早期青霉素生產(chǎn)的過濾設備
早期的萃取設備
為了滿足青霉素發(fā)酵和提取的這些條件，就必須解決與之有關的技術，設備和工藝問題。為此人們根據(jù)對青霉素發(fā)酵過程認識的不斷深入，不斷地研究和發(fā)展了可通入無菌空氣、利用夾套和套管通入冷、熱水控制溫度的密封攪拌式發(fā)酵罐，以及配套的其他設備，如空氣壓縮、過濾、滅菌設備，以及相應的生產(chǎn)工藝和技術。使青霉素的生產(chǎn)從上個世紀四十年代初的發(fā)酵效價每毫升200單位，提取收率75%，產(chǎn)品純度為60%的水平的基礎上不斷提高。也使發(fā)酵所需的廠房占地面積、勞強度、能源消耗、原材料、成本等大大降低，為青霉素在臨床上的大量使用奠定了基礎。
話說青霉素四：精益求精
雖然青霉素可以工業(yè)生產(chǎn)了，但這種生產(chǎn)水平與現(xiàn)在的生產(chǎn)水平無法相比?，F(xiàn)在青霉素工業(yè)生產(chǎn)使用的發(fā)酵罐最大的可達300立方米，生產(chǎn)過程全部由計算機控制，青霉素的發(fā)酵水平達到每毫升發(fā)酵液7-8萬單位，實驗性的發(fā)酵水平達到每毫升發(fā)酵液10萬單位，從發(fā)酵液中提取出青霉素，制成產(chǎn)品的收率為90-95%，產(chǎn)品純度99.9%以上。僅就青霉素的發(fā)酵水平的變化圖就可以看到，幾乎是每十年青霉素的發(fā)酵酵價增加一倍。
青霉素產(chǎn)業(yè)化到現(xiàn)在也就是半個多世紀，而這半個多世紀里，科學技術的發(fā)展突飛猛進，極大地推/帶動了青霉素工業(yè)的發(fā)展。前三十年的生產(chǎn)水平的提高主要依賴于微生物學、遺傳學、生物化學和發(fā)酵工程學的發(fā)展。首先是生產(chǎn)菌種發(fā)生了巨大變化，人們在自然界廣泛收集產(chǎn)生青霉素的微生物菌種，不斷地進行對比、選擇，篩選到生產(chǎn)水平更高的產(chǎn)青霉素菌種。然后，根據(jù)經(jīng)典遺傳學的方法，采用各種物理、化學誘變和無性雜交手段，對菌種進行改造，使菌種的產(chǎn)青霉素水平不斷提高；另外，根據(jù)菌種的生理特性和青霉素合成代謝的特點不斷改善培養(yǎng)基成分，投其所好，使青霉素的發(fā)酵水平逐步上升。
隨著人們對青霉菌的生理、生化特性研究的不斷深入，對青霉素在細胞內(nèi)的合成過程也了解的越來越多，人們根據(jù)這些特點采取了各種有針對性的措施，限制其對產(chǎn)生青霉素不利的因素，充分發(fā)揮、調(diào)動有利因素，不斷優(yōu)化發(fā)酵和提取的條件，在發(fā)酵設備、工藝、技術上采取相應措施，是上個世紀七、八十年代以前青霉素發(fā)酵和生產(chǎn)水平不斷地大幅度提高的主要原因。
比如發(fā)現(xiàn)葡萄糖雖然是菌種生長和合成青霉素必須的碳源，但是過多的葡萄糖會產(chǎn)生抑制作用，特別是對青霉素的產(chǎn)生不利。因此在發(fā)酵過程中隨著葡萄糖不斷的被菌體利用消耗而采取了不斷的流加補充葡萄糖的方法，保持葡萄糖濃度處于低水平，既能夠滿足青霉菌生長和青霉素合成的需要，又不會產(chǎn)生不利影響，從而使菌體生長和青霉素的合成水平大幅度提高。
對青霉素的化學結構的研究發(fā)現(xiàn)，青霉素是由兩部分，即青霉素母核和側鏈組成。由不同的菌種產(chǎn)生的青霉素雖然有差別，但母核是相同的，差別只在側鏈上，比如青霉素G的側鏈是苯乙酸，而青霉素V的側鏈是苯氧乙酸。對青霉素在細胞內(nèi)合成過程的研究發(fā)現(xiàn)，構成青霉素G和V不可缺少的側鏈前體在菌體細胞內(nèi)合成速度比較緩慢，成為合成青霉素的瓶頸，因此人們想到，在發(fā)酵時添加必須的側鏈苯乙酸或苯氧乙酸是否可以提高青霉素的合成速度和產(chǎn)量呢？實際的研究結果證明，確實如此。于是人們又研究什麼時候加，加多少，怎樣加等等問題，隨著側鏈添加工藝的不斷改進和完善，青霉素的發(fā)酵水平不斷的上升。
對在青霉素合成途徑研究時發(fā)現(xiàn)，與賴氨酸的合成過程有關系，賴氨酸生物合成的一個中間體α-氨基己二酸參與青霉素合成。而賴氨酸合成過程中，如果賴氨酸合成多了時，賴氨酸會回過頭來對其本身的合成過程的第一個酶高檸檬酸合成酶的產(chǎn)生反饋抑制作用，這就限制了α-氨基己二酸的生成，從而間接地抑制青霉素的合成。如果在青霉素發(fā)酵過程中加入α-氨基己二酸，可減少賴氨酸的抑制作用，也就提高青霉素的產(chǎn)量。這一發(fā)現(xiàn)又為提高青霉素的發(fā)酵水平開辟了一個新的途徑。
詳細研究青霉素發(fā)酵過程中，溫度對菌體生長、發(fā)酵水平的影響時發(fā)現(xiàn)，總體上菌體生長的最適溫度為30℃，青霉素合成的最適溫度為20℃。根據(jù)計算機模擬對發(fā)酵最適溫度的計算得出結論，青霉素發(fā)酵的最適溫度是在最初的5小時維持30℃，在較高的溫度下可加快細胞成長，縮短發(fā)酵開始時細胞適應新環(huán)境的時間；隨后發(fā)酵溫度降低到25℃，發(fā)酵35小時，控制菌絲生長和代謝水平；再降低發(fā)酵溫度到20℃，發(fā)酵85小時，可以促進青霉素的合成；最后發(fā)酵溫度回升到25℃繼續(xù)發(fā)酵40小時，然后結束發(fā)酵，放罐。最后提高發(fā)酵溫度的目的在于促進發(fā)酵產(chǎn)物青霉素從細胞內(nèi)釋放到發(fā)酵液中。采用這種變溫發(fā)酵，使發(fā)酵過程的細胞生長和產(chǎn)物合成階段均處于最適溫度條件下，其青霉素的產(chǎn)量要比以前的25℃恒溫發(fā)酵的產(chǎn)量高14.7％。
人們就是通過這樣的一點一滴的詳細研究的積累，不斷加深對菌種和青霉素合成過程的的認識，不斷改進、完善發(fā)酵和提取的工藝、技術和設備，到上個世紀八十年代青霉素的發(fā)酵達到了每毫升發(fā)酵液六、七萬單位的水平。
話說青霉素五：好風憑借力，送你上青天
近十多年來，基因工程和代謝工程的發(fā)展，為改造菌種，提高青霉素產(chǎn)量提供了強有力的手段。因為現(xiàn)在青霉素在細胞內(nèi)的合成途徑和關鍵點，以及青霉素合成途徑與其他代謝途徑的關系已經(jīng)研究的十分清楚，因此，人們可以采用基因缺失的辦法將能夠消耗合成青霉素原料和干擾青霉素合成的代謝旁路的關鍵基因“關掉”，或?qū)⑦@個“控制閥門”關小，提高合成青霉素原料的利用率，減少了副產(chǎn)物的形成，進一步提高了青霉素的產(chǎn)量?；蛘呤怯没蚬こ谭椒▽⒖刂魄嗝顾睾铣赏緩降幕?，和合成青霉素途徑中的關鍵基因再轉移到青霉素生產(chǎn)菌中，使其數(shù)量增加，這相當于將控制基因閥門開大，使合成青霉素的途徑更順暢，也可以大大的提高青霉素的產(chǎn)量。這就是利用基因工程的方法有目的的改造青霉素的代謝合成途徑，因此稱為代謝工程。
前面我們提到菌體生長和青霉素合成都需要大量的氧，因此在發(fā)酵過程中提供充足的氧是青霉素發(fā)酵的關鍵。但是在大生產(chǎn)中，因為設備條件的限制，利用提高攪拌速度，加大通氣量和提高發(fā)酵罐的壓力的方法提高氧的溶解速度和濃度都是有限的。為了突破這種限制，人們想到了血紅蛋白，因為它是動物體內(nèi)攜帶氧的分子，一個血紅蛋白分子可以攜帶四個氧原子，具有富集氧的作用。因此利用基因工程方法，將血紅蛋白基因?qū)肷a(chǎn)青霉素的菌種中，在它的細胞內(nèi)合成一定數(shù)量的血紅蛋白，可以起到富集氧的作用，達到提高青霉素的產(chǎn)量的目的。通過這樣的一些列改造，獲得的工程菌的生產(chǎn)能力大幅度提高，再配合發(fā)酵工藝的改進，青霉素發(fā)酵酵價可以達到每毫升近10萬單位，產(chǎn)生的青霉素可以直接從發(fā)酵液中結晶出來。
青霉素發(fā)酵車間
在這半個多世紀里，青霉素的生產(chǎn)水平的不斷地提高，達到現(xiàn)在這種水平，完全是在相關科學和技術的進步的帶領和推動下實現(xiàn)的，特別是近十多年來，生物技術的進步和發(fā)展為青霉素生產(chǎn)水平的提高起到巨大的推動作用。另外，青霉素產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和提高離不開工程、技術、工藝和設備的不斷發(fā)展和完善，它們相輔相成，缺一不可。這也是千千萬萬的科學技術工作者辛勤努力的結晶。
話說青霉素六：繼往開來
青霉素在治療疾病上的巨大成功，極大的震撼和鼓舞了微生物學家和藥物學家，使人們認識到微生物可能是一個巨大的新藥寶庫，為尋找新的藥物開辟了新的思路和途徑。人們懷著如同淘金和尋寶一樣的心情開始在微生物中尋找新的類似于青霉素的物質(zhì)。1944年瓦克斯曼(Waksman)從灰色鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)了能夠治療結核病的鏈霉素。結核病一直困饒著人類，是使人極度恐慌的傳染病，鏈霉素的發(fā)現(xiàn)為人類征服結核病帶來了希望，同時也開辟了利用放線菌生產(chǎn)抗生素的途徑。
隨后在微生物中發(fā)現(xiàn)了許多具有殺滅和抑制其他微生物發(fā)育和代謝，有的還可抑制腫瘤細胞的發(fā)育和代謝的生物活性物質(zhì)，現(xiàn)在人們將之統(tǒng)稱為抗生素，具有抗微生物作用的抗生素又稱為抗菌素。上個世紀的60-80年代是抗生素研究發(fā)展的高峰年代，到目前為止從微生物中發(fā)現(xiàn)的抗生素有近8000多種，在工業(yè)上生產(chǎn)并在臨床上應用的抗生素有近100種。因此形成了一個龐大的抗生素工業(yè)產(chǎn)業(yè)體系。
青霉素的產(chǎn)業(yè)化，是由傳統(tǒng)發(fā)酵進入現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)的轉折點，標志一個新的產(chǎn)業(yè)部門，現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)的誕生。為了青霉素的工業(yè)化生產(chǎn)，不斷提高生產(chǎn)水平，人們進行了大量的微生物生理、生化、代謝研究，找到了提高青霉素發(fā)酵水平的方法和條件，為保證這些方法和條件在工業(yè)上實現(xiàn)，人們又研究開發(fā)了大量新的工程、設備、技術和工藝并應用于青霉素生產(chǎn)，進一步促進了青霉素工業(yè)的發(fā)展。在青霉素工業(yè)發(fā)展的同時，帶動了其他發(fā)酵產(chǎn)品的研究開發(fā)，并將青霉素生產(chǎn)的經(jīng)驗，設備、技術、工藝擴展到其他發(fā)酵產(chǎn)品上，促進了其他發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，逐漸形成了抗生素、氨基酸、有機酸、酶制劑、有機溶劑、維生素、食品，以及近年發(fā)展的多糖和核酸等工業(yè)系統(tǒng)，形成了完整發(fā)酵工業(yè)體系。它的生產(chǎn)總值，在我國達到整個國民經(jīng)濟生產(chǎn)總值的4-6%，而在發(fā)達國家達到10%。
伴隨著青霉素產(chǎn)業(yè)的誕生和發(fā)展，解決青霉素和現(xiàn)代發(fā)酵產(chǎn)業(yè)技術、工藝、工程和設備的研究和發(fā)展遇到的基礎理論和應用基礎理論問題，一個新的學科，發(fā)酵工程學也隨之誕生了，它現(xiàn)在已經(jīng)成為生物技術中的發(fā)酵工程和生物化學工程的主要部分，為生物技術產(chǎn)業(yè)的發(fā)展做出了巨大貢獻。
話說青霉素七：青霉素不靈了？
青霉素之所以能夠殺細菌，達到治病的目的，那是因為青霉素能夠抑制或破壞細菌細胞壁的形成。這正如把一只小兔子的皮剝掉，小兔子就不能活一樣。細菌細胞壁被破壞，細菌就不能夠繁殖，從而達到殺菌治病的效果。
在上個世紀的五十年代，也就是青霉素開始大量在臨床上使用時，一個病人每一次注射青霉素只需要20萬單位，而到了九十年代，一個病人每一次注射的青霉素需要80-100萬單位，青霉素用量幾乎增加了近5倍。為什麼在不到半個世紀里，病人需要注射的青霉素用量增加了近5倍，是不是如人們所說的現(xiàn)在的青霉素質(zhì)量不如從前了呢！不是的?，F(xiàn)在生產(chǎn)的青霉素質(zhì)量不僅不比從前生產(chǎn)的青霉素質(zhì)量差，反而還有大幅度的提高。其主要原因是由于人們長期、大量使用青霉素，特別是不科學的大量濫用青霉素，如低劑量長期使用，使許多致病菌對青霉素產(chǎn)生了耐藥性，不得不增加青霉素的用量，以保證治療效果。
還有些致病菌不僅能夠耐藥，而且還產(chǎn)生了破壞青霉素的能力，能夠?qū)⑶嗝顾氐哪负似茐?，使其喪失殺菌活性。這樣青霉素就不能把它殺死。
為了解決出現(xiàn)的這個問題，人們又開始了新的征程。
話說青霉素八：魔高一尺，道高一丈
在研究青霉素的化學結構與藥效關系中，發(fā)現(xiàn)青霉素母核是由一個四元環(huán)與一個五元環(huán)并在一起所組成的分子活性部分，它是青霉素抗菌活性的關鍵部分，如果四元環(huán)被破壞而打開，青霉素就失去了抗菌活性；另一部分是與之連接的側鏈。研究發(fā)現(xiàn)改變側鏈的結構，可以增加母核的穩(wěn)定性，增加耐受致病菌破壞的能力。同時還可以擴大抗菌譜，增加耐酸性，使之可以口服，在一定程度上也可以降低過敏性。因此，通過對青霉素的側鏈結構改造，可以達到提高青霉素藥效和治療作用的目的，具有巨大的臨床應用價值。
在以前人們是利用化學方法將用發(fā)酵產(chǎn)生的青霉素的側鏈‘切下’來，獲得母核，然后再經(jīng)化學方法給母核接上一個新的側鏈，得到的是經(jīng)過改造的‘半合成青霉素’。致病菌對經(jīng)過改裝的青霉素的破壞和耐受能力降低，容易被殺死。過去病人打一針普通青霉素要80-100萬單位，而現(xiàn)在打半合成青霉素，如氨芐青霉素，羥氨芐青霉素，只需要20-40萬單位，就可以達到同樣的治療效果，甚至更好。
但是，用化學方法生產(chǎn)青霉素母核很困難，需要很繁雜的低溫化學反應，一不小心，可能就會失敗，拿不到產(chǎn)品，而且使用的試劑昂貴，生產(chǎn)的青霉素母核成本很高，阻礙了半合成青霉素的發(fā)展。
上個世紀的五十年代末期，人們在微生物中發(fā)現(xiàn)了一種能夠?qū)⑶嗝顾氐膫孺湣鹣聛怼玫角嗝顾啬负说囊环N酶，就給它起名叫做青霉素?；?，但當時并沒有引起人們的注意。直到上個世紀的七十年代，半合成青霉素的發(fā)展需要大量的青霉素母核，而使用化學方法生產(chǎn)又遇到許多困難時，才想到青霉素酰化酶，開始進行大量研究。
最早發(fā)現(xiàn)的青霉素?；甘怯纱竽c桿菌細胞產(chǎn)生，酶是存在于細胞內(nèi)，因此稱為胞內(nèi)酶?？梢灾苯邮褂煤嗝顾仵；傅拇竽c桿菌細胞作為酶源，用于催化青霉素的水解反應，將側鏈切掉，獲得母核。后來發(fā)現(xiàn)其它一些細菌，比如巨大芽孢桿菌，產(chǎn)生的青霉素?；甘窃诩毎獾陌l(fā)酵液里，人們稱之為胞外酶，因為產(chǎn)量高，比較容易分離得到而受到人們的重視。
但是，不論是胞內(nèi)還是胞外的青霉素?；冈诠I(yè)上使用都有許多缺點。比如使用細胞作為酶源時，在使用過程中細胞會破裂，由細胞釋放出來的許許多多細胞內(nèi)的東西會跑到反應液中產(chǎn)生污染，增加產(chǎn)物分離的負擔，影響產(chǎn)品質(zhì)量；即使細胞不破裂，因為大腸桿菌細胞很小，從反應液中除去細胞也比較麻煩；使用酶時，因酶是溶解在水里的，它催化反應完了也需除去，但分離有一定困難，容易污染產(chǎn)物；另外，細胞和酶催化反應結束后，并未完全喪失催化能力，往往還可以再使用，但在溶液中的細胞和酶很難分離出來再使用。費了很大力氣生產(chǎn)的細胞或酶只使用了一次，就丟掉了，十分可惜，也是浪費。
為了解決上述這些問題，自上個世紀七十年代發(fā)展了固定化技術，將產(chǎn)胞內(nèi)青霉素酰化酶的細胞用適當?shù)牟牧习裥纬尚≈?，制成固定化細胞，或?qū)⑶嗝顾仵；附Y合在特殊的高分子材料上，制備成固定化酶。因為它們顆粒大，解決了難以回收的問題，而且固定化后酶的穩(wěn)定性大幅度提高，可以長期反復使用。這樣可以減少細胞和酶的生產(chǎn)成本，不必每一次都要生產(chǎn)酶或細胞，生產(chǎn)足夠量的酶或細胞，進行固定化后就可以長期使用。
將固定化酶或固定化細胞裝在底部有細的濾網(wǎng)的攪拌罐式反應器中，加入10%的青霉素溶液，保持溫度35-40℃左右，在緩慢的攪動下，通過pH自動控制儀流加堿液，保持反應液的pH在8.0-8.5，進行反應，幾個小時后，反應結束，打開反應罐底的閥門，將反應液放出，而固定化酶或細胞保留在反應罐內(nèi)，再加入青霉素溶液，重復上述過程，就可以進行下一批反應。這樣可以連續(xù)的使用固定化酶或細胞。將反應液加入酸，將pH調(diào)到弱酸性，用有機溶劑將反應產(chǎn)生的側鏈提取出去，留下的反應液經(jīng)適當濃縮后，產(chǎn)生的青霉素母核即可結晶出來。
也可以將固定化酶或固定化細胞裝在柱式反應器中，將青霉素溶液從柱反應器的一端以較高的流速進入，從另一端流出到儲罐中，通過pH自動控制儀流加堿液，保持反應液的pH在8.0-8.5，反應液通過循環(huán)泵反復通過柱式反應器，就可以將青霉素裂解，結束后利用上述方法獲得青霉素母核。
利用這樣的設備可以進行大規(guī)模的批式或連續(xù)生產(chǎn)，容易實現(xiàn)自動化和連續(xù)化，反應結束后，因為酶是固體的，很容易與反應液分開，酶和細胞不會污染產(chǎn)物；酶也可以反復再用，這使得青霉素母核的生產(chǎn)變得比較輕松，可以大幅度的降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品質(zhì)量。為青霉素母核的生產(chǎn)開辟了一種全新的生產(chǎn)方法，克服了化學方法的缺點，解決了因此帶來的環(huán)境污染等問題。
過去，青霉素酰化酶都是由從自然界篩選到得到的大腸桿菌或巨大芽孢桿菌生產(chǎn)的，產(chǎn)酶量比較低，雖然通過誘變和選育得到的菌種生產(chǎn)能力有所提高，但依然生產(chǎn)能力有限，現(xiàn)在人們利用轉基因的方法，將青霉素?；富蜣D入原來的生產(chǎn)菌，或其它的菌種，使青霉素酰化酶的基因數(shù)量增加，可以大幅度的提高青霉素?；傅漠a(chǎn)量，再經(jīng)固定化，能夠更好的滿足大規(guī)模的生產(chǎn)要求。
有了青霉素母核，再接上一個新的側鏈，就成為半合成青霉素。在上個世紀九十年代以前，都是使用化學法合成。但早在七十年代就發(fā)現(xiàn)青霉素?；覆粌H可以催化青霉素水解產(chǎn)生母核，也可以催化母核與新的側鏈反應合成半合成青霉素。其與生產(chǎn)青霉素母核的反應條件不同，生產(chǎn)母核的反應是在弱堿性條件，而合成反應是在弱酸性和有新的側鏈的衍生物存在下進行?，F(xiàn)在利用青霉素?；复呋铣砂逼S青霉素已經(jīng)獲得成功，但還不能象化學合成方法那樣可以用于合成各種半合成青霉素。
半合成青霉素，從上個世紀六、七十年代的第一代產(chǎn)品已發(fā)展到現(xiàn)在的第四代，我國醫(yī)院大量使用的氨芐青霉素，羥氨芐青霉素是第三代產(chǎn)品，是現(xiàn)在臨床上的主力藥物。在國外，如果發(fā)燒病人到醫(yī)院看病，大夫先前給病人注射一針氨芐青霉素，然后去檢查。因為這種藥抗菌譜廣，過敏反應低，療效高，是醫(yī)生信得過的藥物。
與原來的青霉素相比，因為側鏈改變了，原來對青霉素有抗性的致病菌對它有些“面生”不怎麼認得，于是被稀里糊涂地殺死了。如果使用老的青霉素，需要打80-100萬單位，而打氨芐青霉素，只需要20萬單位。那麼如果以前生產(chǎn)1000噸老青霉素（比如青霉素G鉀鹽）能夠滿足市場需要，現(xiàn)在只要生產(chǎn)200噸氨芐青霉素就可以了。其經(jīng)濟效益和社會效益就可想而知了。
話說青霉素九：青霉素的孿生兄弟
很早以前就發(fā)現(xiàn)，在青霉菌發(fā)酵生產(chǎn)青霉素時，發(fā)酵液中多多少少的還同時有與青霉素類似的另一種抗生素，頭孢霉素。它們在結構上有許多相似之處，均由類似的母核與側鏈組成。不同之處不僅側鏈結構有差別，母核也有差別。青霉素母核上的五元環(huán)在頭孢霉素母核上為六元環(huán)。猛看上去它們很相象，是一對孿生兄弟。
在青霉菌發(fā)酵時，在合成的開始階段青霉素和頭孢霉素有共同的前體，不久出現(xiàn)分支，在分支點上，有一個重要的“調(diào)節(jié)閥門”，叫做擴環(huán)酶，將青霉素母核的五元環(huán)擴大成六元環(huán)，再走下去合成的是頭孢霉素；如果不擴環(huán)，直接走下去進入了青霉素合成。一般情況下，擴環(huán)酶量很少，因此，在青霉素發(fā)酵液中頭孢霉素的量也很少。
現(xiàn)在人們想到，能不能對青霉素和頭孢霉素合成途徑中的分路閥門進行調(diào)節(jié)，讓它合成青霉素就全都是青霉素，而不產(chǎn)生頭孢霉素；讓它合成頭孢霉素，就全部合成頭孢霉素，不就可以進一步提高它們的產(chǎn)量嗎。
現(xiàn)在利用基因工程方法就可以做到。將擴環(huán)酶基因克隆到青霉素生產(chǎn)菌里，加大擴環(huán)酶基因數(shù)量，使它產(chǎn)生更多的擴環(huán)酶，相當于將“調(diào)節(jié)閥門”打開。同時利用基因工程方法，將臨近擴環(huán)酶下游的，流向青霉素合成的基因消除或“關閉”，使代謝合成青霉素的流向，全部流向頭孢霉素的合成，就將原來生產(chǎn)青霉素的菌種改造成為生產(chǎn)頭孢霉素的菌種。同樣，如果將青霉素生產(chǎn)菌的擴環(huán)酶基因消除，相當于將合成頭孢霉素的合成流關閉，菌種在發(fā)酵過程中就不會再有頭孢霉素的產(chǎn)生，既可進一步提高青霉素的產(chǎn)量。這也就是現(xiàn)在所說的，利用基因工程方法改變代謝途徑的代謝工程。
利用發(fā)酵法生產(chǎn)的頭孢霉素C在臨床上使用的很少，因為它的療效不是很令人滿意。現(xiàn)在發(fā)酵法生產(chǎn)的頭孢霉素主要是作為原料，將側鏈切掉，獲得頭孢霉素母核(7-ACA)，然后再接上一個新的側鏈，生產(chǎn)半合成頭孢霉素。頭孢霉素母核的生產(chǎn)可以使用化學方法，也可以使用酶工程方法。因為與青霉素的側鏈結構不同，頭孢霉素C的側鏈是氨基己酸，使用青霉素酰化酶不能夠?qū)⑵淝邢?，必須使用另外兩種酶：D-氨基氧化酶和GL-?；嘎?lián)合作用將側鏈切下來，才能得到頭孢霉素母核，這種方法已經(jīng)在我國研究成功。
依據(jù)這個思路，人們將D- 氨基酸氧化酶和GL-酰化酶兩個基因同時克隆到能夠生產(chǎn)頭孢霉素C的菌種中，使用這個工程菌進行發(fā)酵，可以在發(fā)酵液中積累頭孢霉素C的母核7-ACA。但是，因為在D-氨基酸氧化酶催化氧化側鏈時會產(chǎn)生過氧化氫，它是個強氧化劑，會使細胞和酶受到破壞，因此，產(chǎn)量不高?，F(xiàn)在人們又在考慮將能夠破壞過氧化氫的過氧化氫酶基因也克隆到上述工程菌中，有可能解決這個問題。
另外，不久前從微生物中找到了頭孢霉素C?；福梢灾苯訉㈩^孢霉素C的側鏈切下，獲得頭孢霉素母核。然后使用化學或酶法合成半合成頭孢霉素。
現(xiàn)在，為了生產(chǎn)半合成頭孢霉素，人們利用化學法進行擴環(huán)，將青霉素G變成頭孢霉素，因為側鏈與青霉素G相同，使用青霉素?；笇孺溓邢聛恚a(chǎn)一種稱為7-ADCA的頭孢霉素母核，然后用于合成半合成頭孢霉素。這種方法已經(jīng)用在工業(yè)上大量生產(chǎn)氨芐頭孢霉素和羥氨芐頭孢霉素，并在醫(yī)院里大量使用。由于它們比半合成青霉素更能夠耐受胃酸，因此可以口服，使用更方便。它的過敏反應低，抗菌譜廣，病菌的耐藥性小，在臨床上得到廣泛應用。
話說青霉素十：功德無量
人們?yōu)榱藨?zhàn)勝疾病，圍繞著青霉素開展了長達半個多世紀的堅持不懈的努力，隨著科學、技術的進步，特別是生物技術的廣泛應用，使青霉素的生產(chǎn)達到前所未有的水平。
青霉素的發(fā)現(xiàn)開創(chuàng)了抗生素時代，青霉素及其類似物在臨床上的廣泛應用，挽救了成千上萬人的生命，使人類與疾病的斗爭進入了一個全新的世紀，使人類平均壽命從45歲增加到60歲，為增進人類的健康做出了巨大貢獻，
青霉素的產(chǎn)業(yè)化帶動了現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)的誕生，形成了一個全新的產(chǎn)業(yè)，為人類帶來了豐富多彩的產(chǎn)品，提高了人類的生活質(zhì)量。
這一切，與青霉素的發(fā)現(xiàn)者弗萊明及為使青霉素工業(yè)化生產(chǎn)和利用奠定基礎的佛羅理和錢恩有著密切關系。為了表彰題目為人類做出的巨大貢獻，這三位科學家共同獲得了1945年的諾貝爾生理和醫(yī)學獎。他們?yōu)槿祟愇拿骱蜕鐣M步做出不可磨滅的貢獻，我們后人將永遠紀念他們。
亞歷山大. 弗萊明（Alexander. Fleming）（1881-1955）
恩斯特-保羅斯-錢恩（Ernst. Boris. Chain）（1906-1979）
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