生物信息學

核酸和蛋白質(zhì)的分析方法

生物信息學的概念

生物信息學——是一門新興的交叉學科，是采用計算機技術(shù)和信息論方法研究蛋白質(zhì)及核酸序列等各種生物信息的采集、存儲、傳遞、檢索、分析和解讀的科學，是現(xiàn)代生命科學與計算機科學、數(shù)學、統(tǒng)計學、物理學和化學等學科相互滲透而形成的交叉學科。具體的說，生物信息學是把基因組DNA序列信息分析作為源頭，破譯隱藏在DNA序列中的遺傳語言，特別是非編碼區(qū)的實質(zhì)；同時在發(fā)現(xiàn)了新基因信息之后進行蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)模擬和預測。

生物信息學的研究內(nèi)容

   生物信息的采集、存儲、管理和提供；

   基因組序列信息的提取和分析；

   功能基因組相關信息分析；

   生物大分子結(jié)構(gòu)模擬和藥物設計；

   生物信息分析的技術(shù)與方法研究；

生物信息學的研究內(nèi)容

4     基因與基因組的信息學

–   大規(guī)模基因組測序中的信息分析

–   新基因和新SNP的發(fā)現(xiàn)與鑒定

–   非編碼區(qū)信息結(jié)構(gòu)分析

–   遺傳密碼起源和生物進化的研究

–   完整基因組的比較研究

.  基因表達的信息學---大規(guī)?；蚬δ鼙磉_譜的分析。DNA芯片技術(shù)、蛋白質(zhì)譜技術(shù)和蛋白質(zhì)組研究。

4     生物大分子的三維結(jié)構(gòu)信息---蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬與分子設計。蛋白質(zhì)功能的分析基礎。方法：同源模建、序列結(jié)構(gòu)聯(lián)配、分子動力學模擬。

4     代謝和疾病發(fā)生途徑的信息---細胞發(fā)育、分化的途徑以及疾病發(fā)生與發(fā)展的途徑

   基因組序列裝配

   基因識別

   基因功能預報

   基因多態(tài)性分析

   基因進化

   mRNA結(jié)構(gòu)預測

   基因芯片設計

   基因芯片數(shù)據(jù)分析

   疾病相關基因分析

基本研究方法

實驗數(shù)據(jù)          公用數(shù)據(jù)

公共數(shù)據(jù)庫

核酸分析       蛋白質(zhì)分析

生物信息學數(shù)據(jù)庫

數(shù)據(jù)庫種類

4     基因組數(shù)據(jù)庫

–   人類基因組數(shù)據(jù)庫

–   各種模式生物基因組數(shù)據(jù)庫

4     核酸和蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)序列數(shù)據(jù)庫

4     生物大分子三維空間數(shù)據(jù)庫

4     由以上三類數(shù)據(jù)庫和文獻資料為基礎的二次數(shù)據(jù)庫

生物信息學數(shù)據(jù)庫

全球生物學數(shù)據(jù)庫

4       Major Sequence Repositories

4       Comparative Genomics

4       Gene Expression

4       Gene Identification and Structure

4       Genetic and Physical Maps

4       Genomic Databases

4       Intermolecular Interactions

4       Metabolic Pathways and Cellular Regulation

4       Mutation Databases

4       Pathology

4       Protein Databases

4       Protein Sequence Motifs

4       Proteome Resources

4       RNA Sequences

4       Retrieval Systems and Database Structure

4       Structure

4       Transgenics

4       Varied Biomedical Content

基因組數(shù)據(jù)庫

4     基因組數(shù)據(jù)庫是分子生物信息數(shù)據(jù)庫的重要組成部分，主要包括人以及鼠、河豚魚、擬南芥、水稻、線蟲、果蠅、酵母、大腸桿菌等各種模式生物。

4     GDB----人類基因組數(shù)據(jù)庫

4     AceDB----線蟲基因組數(shù)據(jù)庫

序列數(shù)據(jù)庫

4     核酸序列數(shù)據(jù)庫----EMBL、GENBANK、DDBJ

4     蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫----PIR、SWISS-PORT

結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫

4     蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫---PDB

4     蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類數(shù)據(jù)庫
SCOP---將蛋白質(zhì)按傳統(tǒng)分類方法分成a型、b型 、a/b型、 a+b型、多結(jié)構(gòu)域蛋白、膜蛋白和細胞表面蛋白、小蛋白等七大類。
CATH---將蛋白質(zhì)分為a主類、 b主類、 a-b類、低二級結(jié)構(gòu)類（二級結(jié)構(gòu)成分含量很低的蛋白質(zhì)分子）

二次數(shù)據(jù)庫

4     基因組二次數(shù)據(jù)庫

4     蛋白質(zhì)序列二次數(shù)據(jù)庫

4     蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)二次數(shù)據(jù)庫

4     二次數(shù)據(jù)庫種類繁多，以核酸數(shù)據(jù)庫為基礎構(gòu)建的二次數(shù)據(jù)庫有基因調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫TransFac，真核生物啟動子數(shù)據(jù)庫EPD，克隆載體數(shù)據(jù)庫Vector，密碼子使用表數(shù)據(jù)庫CUTG等。

4     以蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫為基礎構(gòu)建的二次數(shù)據(jù)庫有蛋白質(zhì)功能位點數(shù)據(jù)庫Prosite，蛋白質(zhì)功能位點序列片段數(shù)據(jù)庫Prints，同源蛋白家族數(shù)據(jù)庫Pfam，同源蛋白結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫Blocks。

4      以具有特殊功能的蛋白為基礎構(gòu)建的有免疫球蛋白數(shù)據(jù)庫Kabat，蛋白激酶數(shù)據(jù)庫PKinase等。

4      以三維結(jié)構(gòu)原子坐標為基礎構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫為結(jié)構(gòu)分子生物學研究提供了有效的工具，如蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象參數(shù)數(shù)據(jù)庫DSSP，已知空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫FSSP，已知空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)及其同源蛋白數(shù)據(jù)庫HSSP等。

4      蛋白質(zhì)回環(huán)分類數(shù)據(jù)庫則是用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能和分子設計研究的專門數(shù)據(jù)庫。

4      此外，酶、限制性內(nèi)切酶、輻射雜交、氨基酸特性表、序列分析文獻等，也屬于二次數(shù)據(jù)庫或?qū)ｉT數(shù)據(jù)庫。

數(shù)據(jù)庫查詢(daebase query) 和數(shù)據(jù)庫搜索(datebase search)

4     數(shù)據(jù)庫查詢（也稱為數(shù)據(jù)庫檢索）是指對序列、結(jié)構(gòu)以及各種二次數(shù)據(jù)庫中的注釋信息進行關鍵詞匹配查找。常用的數(shù)據(jù)庫查詢系統(tǒng)有Entrez, SRS等。

4     數(shù)據(jù)庫搜索是指通過特定的序列相似性比對算法，找出核酸或蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫中與檢測序列具有一定程度相似性的序列。常用的數(shù)據(jù)庫搜索系統(tǒng)有BLAST 、FASTA和BLITZ 。

序列的比較

4     兩兩對齊分析：常用程序有ALIGN、Align、B12Seq等。

4     多重序列對齊分析：常用程序有Clustal W/X、Match-Box、CINEMA等。

4     序列對數(shù)據(jù)庫的對齊分析：常用程序有BLAST 、FASTA和BLITZ 。

應    用

核酸序列分析

蛋白質(zhì)分析

核酸序列分析

4      核酸序列的檢索---對已知核酸序列的檢索

4      核酸序列的基本分析

–    分子質(zhì)量、堿基組成、堿基分布

–    序列變換：反向序列、互補序列、互補反向序列

–    限制性酶切分析：限制酶的所有信息，包括甲基化酶、相應的微生物來源、識別序列位點、裂解位點、甲基化特異性、酶的商業(yè)來源以及參考文獻。

–    克隆測序的分析：測序峰圖的查看、核酸序列中載體的識別和去除、其他人工序列的分析和去除

4      核酸序列的電子延伸---GenBank的UniGene數(shù)據(jù)庫、意大利Tigem的EST Machine、EMBL的EST Cluster Project等 

4      基因的電子表達譜分析---將待分析序列與EST數(shù)據(jù)庫進行序列對庫的檢索，用與待分析核酸序列具有高同源性的EST序列所對應的組織來源進行推斷，進而得到該基因的組織表達譜。SAGE數(shù)據(jù)庫、UniGene、Tigem等。

4      核酸序列的電子基因定位分析---染色體定位。

–    通過序列標簽STS數(shù)據(jù)庫定位

–    利用UniGene/RH放射性雜交定位

–    直接利用基因組序列定位

4      cDNA對應的基因組序列分析---EST和cDNA的基因組序列查詢了解該基因的基因組結(jié)構(gòu)：外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)。

4      基于核酸序列對齊分析的功能預測

–    利用數(shù)據(jù)庫的核酸序列的同源性分析

–    兩條核酸序列之間的同源性分析

–    核酸序列之間的多重比對分析及進化分析

4      可讀框架分析

–    cDNA序列的可讀框架分析

–    基因組序列中的編碼區(qū)/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析

–    cDNA序列與基因組序列的對齊及顯示，Sim4程序。

4      基因啟動子及其他調(diào)控位點分析---啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、內(nèi)含子與外顯子。

4      重復序列分析

4      引物設計

蛋白質(zhì)序列分析

4     蛋白質(zhì)序列檢索

4     蛋白質(zhì)基本性質(zhì)分析

–   氨基酸組分、分子質(zhì)量、等電點

–   疏水性分析

–   跨膜區(qū)分析

–   前導肽和蛋白質(zhì)定位

–   卷曲螺旋分析

蛋白質(zhì)序列分析

4     蛋白質(zhì)功能預測

–   基于序列同源性分析的蛋白質(zhì)功能預測。 Blast、Blast2、FASTA。

–   基于模體、結(jié)構(gòu)位點、結(jié)構(gòu)功能域的蛋白質(zhì)功能預測

4     蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測

–   蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測

–   蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預測——與已知結(jié)構(gòu)的序列比較、同源模建、threading算法和折疊識別

4     蛋白質(zhì)分子進化分析

生物信息學與基因芯片

4     生物信息學在基因芯片研究與應用中其著重要的作用，從確定基因芯片檢測對象到基因芯片設計，從基因芯片檢測結(jié)果分析到實驗數(shù)據(jù)管理和信息挖掘，都需要生物信息學的支持。而基因芯片技術(shù)又能夠同時、快速、準確地分析大量基因組信息。

生物信息學與藥物設計

   選擇藥物作用靶標的標準

   侯選藥物靶標的發(fā)現(xiàn)

   靶標有效性的驗證

   藥物作用機制的研究

   計算機輔助藥物設計

研究實例

“熒光差異顯示PCR克隆參與胃腺癌轉(zhuǎn)移的基因wcl1”（王建華等）

4     使用來源于同一個胃腺癌病人的原發(fā)灶RF-1和轉(zhuǎn)移灶RF-48作為研究腫瘤轉(zhuǎn)移的模型。通過PCR技術(shù)，克隆45個涉及胃腺癌轉(zhuǎn)移相關基因。和原發(fā)灶RF-1相比較，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶RF-48細胞中有38個基因被顯著上調(diào)，7個基因被顯著下調(diào)，包括未發(fā)現(xiàn)的基因3個，利用生物信息學技術(shù)對其中一個在RF-48中高度上調(diào)的wcl1進行克隆和鑒定。

具體步驟

   原發(fā)灶RF-1和轉(zhuǎn)移灶RF-48的細胞培養(yǎng)

   DD-PCR獲取差異條帶

   同源性的EST分析

   EST的拼接和組裝

   OFR識別

   編碼氨基酸的相似性分析

   RT-PCR和Northern印跡驗證

   Wcl1染色體定位

   Wcl1基因的組織分布

   Wcl1編碼的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)

結(jié)果                       

   克隆45個差異表達基因，包括未發(fā)現(xiàn)新基因3個。

   其中一個RF-48中高度上調(diào)的基因命名為wcl1，并進行克隆和鑒定，NCBI編號AF364863。

   確定wcl1基因結(jié)構(gòu)---用EST拼接軟件組裝成664bp的序列，對其cDNA序列進行ORF識別，發(fā)現(xiàn)含有240bp的完整閱讀框，編碼79個氨基酸。

   拼接后RT-PCR 、Northern驗證了其正確性。

   SAGE顯示wcl1的組織分布----在低分化胃腺癌表達高于相應正常胃組織；在胃血管內(nèi)皮表達高于乳腺管癌、腦纖維狀星形細胞瘤。

   同源性分析----wcl1編碼的蛋白質(zhì)未與已知蛋白質(zhì)具有高度同源性，可能為一種新的蛋白質(zhì)。

   染色體定位----wcl1664bp重疊群與人11號染色體AP00730克隆存在高度同源性，但AP000730克隆為未完成的草圖序列，沒有完整的基因圖，不能精確定位，只能初步定位于11q14。

   Wcl1編碼蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)----空間二級結(jié)構(gòu)、空間三級結(jié)構(gòu)。Wcl1氨基酸順序預測的蛋白質(zhì)的空間三級結(jié)構(gòu)與谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶的空間三級結(jié)構(gòu)有45%的相似性。

王征旭等研究的“肝癌高表達新基因的克隆和編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析”

4      目的   研究和克隆新的肝癌相關基因，探索肝癌發(fā)生的分子機制。 

4      方法   采用mRNA差異顯示技術(shù)和篩選胎盤cDNA文庫，獲得新基因全長cDNA。制備新基因的GST融合蛋白和多克隆抗體，進行western雜交和免疫組織化學染色；利用計算機軟件分析新基因的二級結(jié)構(gòu)和功能預測。

4      結(jié)果   克降了一個新的肝癌相關基因全長cDNA、western雜交證實該基因全長能在293細胞中表達、免疫組織化學染色證實該基因編碼蛋白定位于細胞漿，二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)含2個SH3結(jié)臺結(jié)構(gòu)域和數(shù)個不同的蛋白激酶磷酸化位點。 

4      結(jié)論   獲得一個新的肝癌相關基因全長cDNA。

其他研究路線

4     大規(guī)模EST克隆新基因

–   新基因克隆

   組織文庫---消減雜交---克隆全長cDNA---電子拼接、RACE----基因全長----染色體定位 

–   功能預測

   cDNA 全長---蛋白編碼序列---同源性比較---功能域、功能基序分析（發(fā)現(xiàn)功能位點）---推斷新基因的功能     

4     用一條EST釣取多個候選同源基因

   差異顯示法---獲得表達差異的一條EST---dbEST數(shù)據(jù)庫電子雜交---90%以上同源性的多條EST---分別進行序列組裝---整合成更長的EST序列---RACE---基因全長---判斷是否為相同基因---不同序列視為候選同源基因

常用生物信息學軟件

4      DNA分析---DNAClub, DNAssist, DNATool

4      RNA分析---RNAdraw, RNAstructure

4      蛋白質(zhì)分析---aminoXpress

4      引物分析---primer, Oligo

4      序列綜合分析---Bioedit, Clustal, LaserGene

4      進化樹分析---Treeview, Genetree, phylip

4      質(zhì)粒繪圖