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基因遞送系統(tǒng)｜第1期. 慢病毒基因遞送系統(tǒng)你了解嗎？

2023.07.22 北京

一．慢病毒系統(tǒng)介紹

慢病毒（Lentivirus）載體是一種單鏈RNA病毒，是以人類免疫缺陷型病毒1（HIV-1）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。HIV病毒基因組由兩條正義鏈的RNA組成，約9kb的序列編碼了9個(gè)蛋白，分別是gag、pol、vif、vpr、vpu、env、tat、rev、nef。其中三個(gè)最大的閱讀框編碼了三個(gè)最主要的結(jié)構(gòu)蛋白：gag、pol和env。

慢病毒載體能高效的將目的基因，RNAi或Cas9-gRNA導(dǎo)入人和動(dòng)物的原代細(xì)胞或細(xì)胞系。慢病毒載體基因組是正鏈RNA，其基因組進(jìn)入細(xì)胞后，在細(xì)胞漿中被其自身攜帶的反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄為DNA，形成DNA整合前復(fù)合體，進(jìn)入細(xì)胞核后，DNA整合到細(xì)胞基因組中。整合后的DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA，回到細(xì)胞漿中，表達(dá)目的蛋白，產(chǎn)生RNAi干擾或基因敲除。慢病毒對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力，可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。

二．慢病毒系統(tǒng)構(gòu)成

我們通常用的慢病毒系統(tǒng)是重組假型慢病毒，包含慢病毒表達(dá)載體和慢病毒包裝質(zhì)粒。慢病毒表達(dá)載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質(zhì)?？商峁┧械霓D(zhuǎn)錄并包裝RNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時(shí)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后，可以直接用于宿主細(xì)胞的感染，目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞之后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達(dá)效應(yīng)分子。

三．慢病毒系統(tǒng)的發(fā)展

由于慢病毒載體來自HIV-1病原體，有可能通過宿主細(xì)胞中的內(nèi)源性病毒元件和外源基因之間的重組，產(chǎn)生具有復(fù)制能力的慢病毒(RCLs)。為了創(chuàng)造安全的慢病毒使用系統(tǒng)，慢病毒系統(tǒng)經(jīng)過了三次迭代。

1.第一代慢病毒系統(tǒng)

第一代病毒系統(tǒng)將病毒基因組分成三個(gè)獨(dú)立的質(zhì)粒：①包裝質(zhì)粒；② 編碼病毒糖蛋白的包膜質(zhì)粒；③ 包含目的基因的載體質(zhì)粒。包裝質(zhì)粒包含病毒包裝所必需的HIV Gag、Pol和CMV啟動(dòng)子控制下的調(diào)控/輔助蛋白。包膜質(zhì)粒表達(dá)病毒糖蛋白如VSV-G，為載體提供受體結(jié)合蛋白。為了降低載體制備過程中產(chǎn)生具有復(fù)制能力的慢病毒的可能性，LTRs，包裝信號(hào)ψ，以及RRE都包含在載體質(zhì)粒中。將負(fù)責(zé)包裝病毒DNA的基因組成分與激活病毒DNA的基因組成分分離開來。因此，包裝序列不含病毒基因組，病毒在感染宿主細(xì)胞后也不會(huì)復(fù)制。

2.第二代慢病毒系統(tǒng)

由于第一代重組慢病毒載體還是存在一定生物安全風(fēng)險(xiǎn)，目前已不再廣泛使用，第二代慢病毒系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生。在該系統(tǒng)中，調(diào)控HIV在宿主細(xì)胞內(nèi)繁殖的基因組成分(Vif、Vpu、Vpr或Nef)被去除。因此，第二代重組系統(tǒng)只包含9個(gè)HIV基因中的4個(gè)基因：gag、pol、tat和rev。第二代慢病毒的載體質(zhì)粒必須與第二代包裝質(zhì)粒一起使用，因?yàn)長TR的轉(zhuǎn)基因表達(dá)是Tat依賴性的。

3.第三代重組慢病毒載體

第三代重組慢病毒載體系統(tǒng)有四個(gè)質(zhì)粒構(gòu)成: ① 包裝質(zhì)粒：只含有g(shù)ag和pol基因的; ② 包膜質(zhì)粒(即VSV-G); ③ 調(diào)控質(zhì)粒表達(dá)Rev; ④ 由異源強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的載體質(zhì)粒。

傳統(tǒng)的慢病毒載體通過兩側(cè)LTR，將LTR之間的轉(zhuǎn)基因序列(包括LTR)整合到宿主基因組中。然而，完整的LTRs也帶來了潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)。如果偶然產(chǎn)生了具有復(fù)制能力的重組慢病毒，它們可以像野生型病毒一樣進(jìn)行復(fù)制；其次，載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞可能被野生型慢病毒感染，野生型慢病毒可以作為一種輔助病毒，將整合的載體挽救成新的病毒顆粒進(jìn)行復(fù)制；另外，LTRs有一個(gè)增強(qiáng)子和啟動(dòng)子區(qū)域，將LTRs整合到基因組中可以激活鄰近的基因（如原癌基因），基于此，人們開發(fā)了第三代自我失活(SIN)的慢病毒載體系統(tǒng)。在第三代重組慢病毒系統(tǒng)中，將3'-LTR中作為增強(qiáng)子/啟動(dòng)子的U3區(qū)域刪除，這樣，在慢病毒逆轉(zhuǎn)錄過程中，U3缺失會(huì)被復(fù)制并整合到基因組的5'-LTR啟動(dòng)子/增強(qiáng)子區(qū)域，即使被轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中存在潛在的可包裝病毒基因組，也無法激活轉(zhuǎn)錄。Tat和Rev對于HIV-1的復(fù)制是必需的，它們調(diào)節(jié)病毒轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄本向細(xì)胞核外的輸出。因此，為了提高安全性，Tat從第三代慢病毒系統(tǒng)的包裝質(zhì)粒中刪除，同時(shí)，通過將載體質(zhì)粒5'-LTR的U3啟動(dòng)子區(qū)，替換為其他病毒(如CMV或RSV)的強(qiáng)啟動(dòng)子，來實(shí)現(xiàn)Tat的功能。而Rev是由另一個(gè)單獨(dú)的調(diào)控質(zhì)粒提供，以增加安全性。

由于慢病毒載體系統(tǒng)被拆分成四個(gè)質(zhì)粒，至少需要三個(gè)重組事件才能產(chǎn)生具有復(fù)制能力的類HIV-1病毒。而且即使發(fā)生病毒重組，產(chǎn)生的病毒只有Gag，Pol，Rev和VSV-G蛋白，沒有功能性LTR，Tat或輔助蛋白，這樣可以顯著增加載體的安全性。然而，與傳統(tǒng)三質(zhì)粒系統(tǒng)（即第二代）相比，第三代載體的病毒產(chǎn)量相對較低。