大家好，今天和大家分享的題為Droplet barco ding for single-cell transc ripto mics applied to embr yonic stem cells（應(yīng)用于胚胎干細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)液滴條形碼）該方案在2013年被Nature評為年度技術(shù)，但其測試通量較低，因此2015年兩篇基于液滴的單細(xì)胞測序技術(shù)Drop-Seq發(fā)布在Cell上，其大大提高了單細(xì)胞測序的通量，并成為了最成功的商業(yè)化單細(xì)胞測序公司10Xgenomics的技術(shù)基礎(chǔ)。
01
研究背景
繪制基因圖譜一直是生物學(xué)家的夢想單細(xì)胞水平的表達(dá)。有了這樣的數(shù)據(jù)可以追蹤異質(zhì)細(xì)胞亞群，并推斷基因和路徑。最近，RNA測序已經(jīng)實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞分辨率。限制是有效的常規(guī)隔離和處理大量數(shù)據(jù)的方法用于定量深入測序的單個(gè)細(xì)胞。我們開發(fā)了一種高通量用于條形碼的液滴微流體方法來自數(shù)千個(gè)單個(gè)細(xì)胞的RNA，用于下一代測序的后續(xù)分析。
這個(gè)該方法顯示出令人驚訝的低噪聲輪廓，并且很容易適應(yīng)其他基于測序的方法。我們分析了小鼠胚胎干細(xì)胞，詳細(xì)揭示人口結(jié)構(gòu)和白血病后分化的異質(zhì)性發(fā)作抑制因子（LIF）戒斷。再現(xiàn)性允許的這些高通量單小區(qū)數(shù)據(jù)我們解構(gòu)細(xì)胞群并推斷基因表達(dá)關(guān)系。
見圖一
數(shù)千個(gè)細(xì)胞的DNA條形碼平臺(tái)。
圖一
用裂解緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄混合物和攜帶條形碼引物的水凝膠微球?qū)⒓?xì)胞封裝在液滴中。封裝后引物被釋放。在逆轉(zhuǎn)錄過程中，用條形碼標(biāo)記每個(gè)液滴中的cDNA。然后液滴破碎，所有細(xì)胞中的物質(zhì)呈線性測序前擴(kuò)增。UMI=唯一分子標(biāo)識符。
見圖二
條形碼水凝膠微球合成。
圖二
（A） 含有常見DNA的水凝膠微球的微流體制備。比例尺100 mm。
（B） 常見的DNA引物：丙烯酸磷酸酰胺部分（藍(lán)色）、可光裂解間隔區(qū)（綠色）、T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子序列（紅色）和測序引物（藍(lán)色）
（C和D）微球的組合條形碼的方法。*=反向補(bǔ)碼序列。
（E） 完整組裝的引物：T7啟動(dòng)子（紅色）、測序引物（藍(lán)色）、條形碼（綠色）、合成接頭（深棕色）、UMI（黃色）和poly-T引物（紫色）。
見圖三
Droplet條形碼設(shè)備。
圖三
（A） 微流體裝置設(shè)計(jì)，另見圖S2。
（B和C）封裝模塊（左）和采集模塊（右）的快照，另請參閱影片S1和S2。箭頭表示細(xì)胞（紅色）、水凝膠（藍(lán)色）和流動(dòng)方向（黑色）。比例尺100 mm。
（D） 隨時(shí)間變化的水滴占用率。
（E） 細(xì)胞和水凝膠共包封統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示高1:1的細(xì)胞：水凝膠對應(yīng)關(guān)系。
（F） BioAnalyzer追蹤顯示文庫豐度對引物光釋放的依賴性。
（G） 單元格/控件的數(shù)量作為采集量的函數(shù)。
見圖四
Droplet條形碼中的技術(shù)噪聲。
圖四
（A） 液滴完整性控制：小鼠和人類細(xì)胞被共同封裝，以明確識別多個(gè)細(xì)胞共享的條形碼；4%條形碼共享鼠標(biāo)/人的混合讀取。
（B） inDrops技術(shù)控制示意圖和每個(gè)液滴的UMI濾波映射（UMIFM）讀數(shù)的直方圖。
（C） 作為每液滴UMIFM讀數(shù)的函數(shù)檢測到的獨(dú)特基因符號。
（D） 刺突分子的平均UMIFM讀數(shù)與其輸入濃度線性相關(guān)，捕獲效率b=7.1%。
（E） 方法靈敏度S作為輸入RNA豐度的函數(shù)；紅色曲線是二項(xiàng)抽樣的靈敏度極限（S=1 e bx)。
（F） 標(biāo)準(zhǔn)化后純RNA的CV平均圖。數(shù)據(jù)點(diǎn)對應(yīng)于單個(gè)基因符號；實(shí)線是二項(xiàng)式采樣噪聲極限。對于豐富的轉(zhuǎn)錄物，方法效率b中的液滴到液滴的可變性設(shè)置了基線CV（虛線曲線：CVb=5%），另見圖S3。
（G） 基因CV的觀察值和生物學(xué)值之間的關(guān)系，F(xiàn)ano因子和相關(guān)性，顯示低效如何抑制Fano因子（方程2），并削弱相關(guān)性（方程3）。
見圖五
inDrop測序揭示ES細(xì)胞群體結(jié)構(gòu)。
圖五
（A） ES細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的CV平均圖。純RNA對照（藍(lán)色）；基因的變異性明顯高于對照組（黑色）。實(shí)線和虛線曲線如下如圖4F所示（細(xì)胞大小的可變性=20%，參見補(bǔ)充信息中的理論方程S4）。插圖：兩個(gè)技術(shù)復(fù)制細(xì)胞群體的基因CV（總計(jì)n=5956個(gè)細(xì)胞），另見圖S4。
（B） 顯示低（Ttn）、中等（Trim28、Ly6a、Dppa5a）和高（Sparc、S100a6）表達(dá)變異性的說明性轉(zhuǎn)錄物計(jì)數(shù)；曲線擬合為泊松（紅色）和負(fù)二項(xiàng)式（藍(lán)色）分布。
（C） 高于泊松（a.p.）噪聲，（CV2-1/平均值）。誤差條=SEM。
（D） 共表達(dá)圖概括了已知和新的基因表達(dá)關(guān)系（見正文）。
見圖六
基因相關(guān)性中保留的調(diào)控信息。
圖六
（A） 一種從弱和/或高度相關(guān)的基因相關(guān)性的細(xì)胞間變異推斷穩(wěn)健基因關(guān)聯(lián)的策略，另見圖S6。
（B–D）Nanog、Sox2和細(xì)胞周期蛋白B的基因鄰域。灰色方框標(biāo)記經(jīng)驗(yàn)證的多能性因子；藍(lán)色方框標(biāo)記以前與多能狀態(tài)。
（E和F）體細(xì)胞系（K562）和小鼠ES細(xì)胞中44個(gè)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄物的相關(guān)性顯示細(xì)胞周期依賴性轉(zhuǎn)錄的缺失在ES細(xì)胞中（基因名稱見圖S6）?；蚴前磳哟尉垲惻帕械摹Ｉ珮?biāo)適用于（E和F）。
見圖七
ES細(xì)胞分化的異質(zhì)性。
圖七
（A） 通過對高度可變基因的細(xì)胞-細(xì)胞相關(guān)性進(jìn)行分層聚類，觀察LIF退出后全球群體結(jié)構(gòu)的變化。
（B和C）LIF退出后基因表達(dá)的平均值（B）和分布（C）；（C）中的小提琴圖表示表達(dá)給定數(shù)量
計(jì)數(shù)；點(diǎn)顯示前5%的單元格。誤差條=SEM。
（D和E）3034個(gè)細(xì)胞的前兩個(gè)PC顯示分化不同步。
（F） 作為時(shí)間函數(shù)的表觀細(xì)胞和PrEn細(xì)胞部分。誤差條=SEM。
（G） 分化ES細(xì)胞和基因的tSNE圖譜（右）揭示了推定的群體標(biāo)記（另見圖S7和表S4）。
（H） ES細(xì)胞和LIF退出后基因表達(dá)變異的內(nèi)在維度，在分化過程中顯示出較小的波動(dòng)子空間。純RNA對照缺乏相關(guān)性，并顯示出最大的波動(dòng)子空間。
02
研究結(jié)論
我們在這里報(bào)道了一個(gè)單細(xì)胞捕獲、條形碼和轉(zhuǎn)錄組分析，對可處理的細(xì)胞數(shù)量沒有物理限制。該方法可捕獲樣本中的大部分細(xì)胞，采集時(shí)間快，且成本低技術(shù)噪音。
這種方法適用于小型臨床樣本，包括腫瘤和組織微生物組，并打開增加了常規(guī)鑒定細(xì)胞類型（即使是罕見的）的可能性，基于基因表達(dá)。
這種類型的數(shù)據(jù)也很有價(jià)值通過在單個(gè)細(xì)胞之間進(jìn)行自然變異來鑒定基因之間假定的調(diào)節(jié)聯(lián)系。我們舉了幾個(gè)這樣推斷的例子，但這類數(shù)據(jù)本身就很有用到更正式的逆向工程。
好了，今天的文獻(xiàn)解讀就到這兒來，我們下期再見！如果你正在開展臨床研究.需要方案設(shè)計(jì).數(shù)據(jù)管理. 數(shù)據(jù)分析等支持.也隨時(shí)可以聯(lián)系我們。
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