2021年7月，來(lái)自斯克里普斯研究所（The Scripps Research Institute）分子醫(yī)學(xué)系的Katja A. Lamia課題組在PNAS上發(fā)表了題為“CRY2 missense mutations suppress P53 and enhancecell growth”的文章，發(fā)現(xiàn)CRY2的錯(cuò)義突變會(huì)抑制P53并促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。
——背景——
晝夜節(jié)律的紊亂增加了癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，但其潛在的機(jī)制尚不清楚。哺乳動(dòng)物隱花色素蛋白（CRY1和CRY2）是與DNA修復(fù)酶相關(guān)的晝夜節(jié)律轉(zhuǎn)錄抑制因子。盡管它們不再具有DNA修復(fù)活性，但可以通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過(guò)程調(diào)控DNA損傷，CRY2可以促進(jìn)（SCF）FBXL3介導(dǎo)的c-MYC和其他靶點(diǎn)泛素化。在這篇文章中，作者選取在癌癥基因組圖譜中高頻率出現(xiàn)的CRY2突變體進(jìn)行研究，揭示CRY2與癌癥之間的分子生物學(xué)聯(lián)系。
——結(jié)果——
首先作者查找了人類腫瘤樣本中已報(bào)導(dǎo)的CRY2錯(cuò)義突變，根據(jù)它們?cè)谀[瘤樣本中出現(xiàn)的頻率以及位點(diǎn)在蛋白中所處的位置選擇5個(gè)突變進(jìn)行后續(xù)研究，它們位于CRY2:FBXL3界面以及c-MYC與CRY2相互作用的磷酸環(huán)上（圖1A），表明這些突變可能影響CRY2、FBXL3和c-MYC之間的相互作用。為了研究CRY2錯(cuò)義突變的影響，作者選取了CRY2?/? + MYC的原代小鼠成纖維細(xì)胞（MEF）檢測(cè)CRY2突變體對(duì)細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)小鼠CRY2的兩個(gè)同源突變（D325H和S510L）加速了表達(dá)高水平c-MYC的原代小鼠成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)（圖1B）。
圖1 CRY2錯(cuò)義突變影響了細(xì)胞生長(zhǎng)
為了確定CRY2突變體對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響是否通過(guò)改變與SCF復(fù)合物和/或與c-MYC的相互作用而引起，作者選用人源293T細(xì)胞研究了WT和CRY2突變與FBXL3、FBXL21和c-MYC的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生型CRY2相比，CRY2 S436R、R460C和S532L突變體都表現(xiàn)出與FBXL3和FBXL21的相互作用減弱（圖2 A和B），而D347H卻沒有什么變化。
圖2 CRY2 S436R,R460C 減弱了與SCF復(fù)合物的相互作用
在核心的生物鐘網(wǎng)絡(luò)中，CRYs在有無(wú)PERs的情況下都可以直接抑制CLOCK和BMAL1。一些研究表明，晝夜節(jié)律的破壞可能有助于腫瘤的發(fā)展。因此，作者選取293T細(xì)胞檢測(cè)了5個(gè)CRY2突變體是否改變了與核心時(shí)鐘成分的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在BMAL1存在的情況下，CRY2 D347H、S436R、R460C和S532L與CLOCK的相互作用減弱，其中CRY2 D347H與CLOCK的相互作用幾乎喪失（圖3A），并且在同源突變位點(diǎn)人源CRY1（D307H）和小鼠CRY2（D325H）中的類似突變同樣影響它們與CLOCK和BMAL1的相互作用（圖3 B和C）。
圖3 CRY2 D347H, S436R, R460C, and S532L 減弱了與CLOCK的相互作用
鑒于CRY2 D347H突變體與CLOCK的相互作用減少，轉(zhuǎn)錄抑制作用可能會(huì)降低，通過(guò)Per2-luciferase實(shí)驗(yàn)，作者發(fā)現(xiàn)WT CRY2劑量依賴性地降低了生物發(fā)光信號(hào)，四個(gè)CRY2錯(cuò)義突變體（S436R、R460C、D467N和S532L）在本試驗(yàn)中的表現(xiàn)與WT CRY2無(wú)明顯差異。而CRY2 D347H對(duì)CLOCK:BMAL1沒有抑制作用，與前面實(shí)驗(yàn)相符合（圖4B）。
圖4CRY2 D347H對(duì)CLOCK/BMAL1無(wú)抑制作用
前面發(fā)現(xiàn)CRY2的兩個(gè)同源突變（D325H和S510L）加速了表達(dá)高水平c-MYC的原代小鼠成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，但是它們對(duì)晝夜節(jié)律和CRY2與SCFFBXL3相互作用的能力有不同的影響。因此作者通過(guò)RNA-Seq檢測(cè)它們對(duì)這些細(xì)胞整體基因表達(dá)的影響。結(jié)果基因集富集分析（GSEA）顯示，與WT CRY2的細(xì)胞相比，CRY2 D325H和S510L的細(xì)胞中都出現(xiàn)了P53靶基因的下調(diào)表達(dá)（圖5 A-H）。P53是生長(zhǎng)抑制的關(guān)鍵影響因子，表達(dá)CRY2 D325H和S510L的細(xì)胞中P53靶基因的表達(dá)降低說(shuō)明這可能是CRY2突變體影響c-MYC高表達(dá)細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵效應(yīng)因子，這可能是它們影響細(xì)胞生長(zhǎng)的主要機(jī)制，至于具體機(jī)制還需后續(xù)進(jìn)一步研究。
圖5CRY2 D325H和CRY2 S510L抑制P53靶基因的轉(zhuǎn)錄
——小結(jié)——
綜上，作者發(fā)現(xiàn)癌癥基因組圖譜中的CRY2錯(cuò)義突變可以抑制P53靶基因的表達(dá)并促進(jìn)MYC高表達(dá)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，為CRYs和P53之間的臨床相關(guān)分子聯(lián)系提供了證據(jù)。此外，這些突變體將為研究潛在分子機(jī)制提供分子工具，有助于后續(xù)CRY1和CRY2的選擇性化學(xué)調(diào)節(jié)劑的發(fā)現(xiàn)和研究。
參考文獻(xiàn)：
Chan AB, Lamia KA, et al. "CRY2 missense mutations suppress P53 and enhance cell growth." Proc Natl Acad Sci U S A. 2021, 118(27):e2101416118. doi:10.1073/pnas.2101416118.
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