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數(shù)據(jù)公布在GEO，還提供了表達矩陣：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE78809

可以直接下載表達矩陣去走下游分析，也可以從 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra?term=SRP071039 測序原始數(shù)據(jù)開始。

背景介紹

大腦中的細胞大致分為兩類：神經(jīng)元（neurons）和神 經(jīng)膠質(zhì)細胞（glial cells）。出生后，神經(jīng)元逐漸延長形成軸突和樹突，彼此交聯(lián)形成復(fù)雜的信息交換網(wǎng)絡(luò)。大腦中50%以上的細胞都是神經(jīng)膠質(zhì)細胞，數(shù)量上是神經(jīng)元的3倍。

神經(jīng)膠質(zhì)細胞包括在腦和脊髓中的大膠質(zhì)細胞(星形膠質(zhì)細胞Astrocyte和少突膠質(zhì)細胞Oligodentrocyte)、小膠質(zhì)細胞（microglia）和室管膜細胞（Ependymal cells），周圍神經(jīng)系的神經(jīng)節(jié)衛(wèi)星細胞（satellite cell）和雪旺細胞（schwann cells）。(是不是一臉懵逼，感覺很受傷，無所謂，不影響本文的WGCNA分析)

小神經(jīng)膠質(zhì)細胞（Microglia）作為腦部目前唯一發(fā)現(xiàn)的一類免疫細胞，在維護機體的正常狀態(tài)上起著重要的作用。小膠質(zhì)細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細胞，它的生活方式會受到周圍環(huán)境的影響，激活狀態(tài)與微環(huán)境相關(guān)，激活后的小膠質(zhì)細胞有M1和M2兩種狀態(tài)，不同狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞發(fā)揮不同的作用。

這里作者區(qū)別了 neonatal(新生的) 和 EAE的Microglia，還有CD11C陽性和陰性。

值得一提的是，在單細胞水平研究小神經(jīng)膠質(zhì)細胞（Microglia）動態(tài)發(fā)育和異質(zhì)性已經(jīng)有了不少研究。

• 波士頓兒童醫(yī)院的研究者們分析了超過76,000個來自于發(fā)育、衰老和腦部感染后的小鼠腦部的小膠質(zhì)細胞，結(jié)果表明至少有9種轉(zhuǎn)錄特異的小膠質(zhì)細胞形態(tài)，它們可以表達特定的基因集，且位于特定的腦區(qū)。發(fā)表于免疫學(xué)雜志Immunity， doi:10.1016/j.immuni.2018.11.004 (2019).

• 斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究者采用高深度scRNA測序揭示了小膠質(zhì)細胞和腦髓細胞的發(fā)育異質(zhì)性，發(fā)表于Neuron，這些細胞取自于胚胎期、出生后早期和成年的小鼠不同腦區(qū)。我們發(fā)現(xiàn)大部分的成年小膠質(zhì)細胞表達穩(wěn)定的基因（homeostatic genes），且不同腦區(qū)間沒有差異。相反，出生后早期的小膠質(zhì)細胞異質(zhì)性更高。doi:10.1016/j.neuron.2018.12.006 (2019).

• 德國弗萊堡大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)病理學(xué)研究所的研究者采用單細胞RNA測序揭示小鼠和人的小神經(jīng)膠質(zhì)細胞的空間和時間異質(zhì)性，成果最近以Letter的形式發(fā)表于Nature雜志。doi:10.1038/s41586-019-0924-x (2019).

數(shù)據(jù)規(guī)律

在GEO界面可以看到是17個樣本，分布如下：

• orange represents neonatal CD11c+ microglia (n = 4),

• green neonatal CD11c microglia (n = 4),

• blue EAE CD11c+ microglia (n = 3),

• purple EAE CD11c microglia (n = 3),

• black adult microglia (n = 3).

其實就是 neonatal(新生的) 和 EAE的Microglia，還有CD11C陽性和陰性，然后和成年小鼠的Microglia進行比較。

需要注意的是：Microglial markers (Aif1, Itgam, Cx3cr1, Csf1r)

來自于兩個參考文獻的  (Butovsky et al, 2014; Bennett et al, 2016)  signature genes ，主要是(Spi1, Irf8,Olfml3, Hexb, Fcrls, Tgfbr1, P2ry12, Siglech, Tmem119)

走WGCNA流程

Co-expression networks were generated for 12,691 genes of the transcriptome dataset.

首先基因分模塊：

然后基因形狀關(guān)聯(lián)分析：

然后看Module Eigengene (ME) 在不同樣本分組的表現(xiàn)：

最后看不同的module的GO/KEGG等數(shù)據(jù)庫的功能注釋結(jié)果。

走分組比較差異分析流程

這里定義統(tǒng)計學(xué)顯著upregulated genes (logFC ≥ 1.5; FDR ≤ 0.01) ，多次分組比較后就有多個上下調(diào)基因集。

差異分析結(jié)束后就可以簡單韋恩圖展現(xiàn)：

基因集的GO/KEGG等數(shù)據(jù)庫的功能注釋結(jié)果也可以比較后繪圖；

安排學(xué)徒做數(shù)據(jù)分析圖表重現(xiàn)