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百合地黃湯是治療抑郁癥的中醫(yī)經典名方，但百合地黃湯含藥血清（LBRDDS）的抗抑郁機制尚未在體外抑郁模型中闡明。
基于此，山東中醫(yī)藥大學山東省經典名方協(xié)同創(chuàng)新中心馬柯研究團隊在Phytomedicine雜志發(fā)表“Synergistic neuroprotective effects of two natural medicinal plants against CORT-induced nerve cell injury by correcting neurotransmitter deficits and inflammation imbalance”揭示了兩種天然藥用植物通過糾正神經遞質缺陷和炎癥失衡，對皮質酮誘導的神經細胞損傷的協(xié)同神經保護作用。
百合地黃湯（LBRD）的制備：稱取鮮百合400 g（去除雜質），清水浸泡 10 h，去浮沫，加 400 ml泉水煎煮，文火加熱濃縮至 200 ml。稱取鮮地黃400 g（去除雜質），榨汁后過濾，得到鮮地黃汁約200 ml。將鮮百合水煎液、鮮地黃汁混合后文火煎煮得到300 ml。本文采用UHPLC-Q-TOF/MS方法鑒定LBRDDS的活性成分，并通過生物信息學分析鑒定其潛在的效應物質。考慮到皮質酮可以誘導神經遞質缺失和炎癥激活從而誘發(fā)抑郁癥，因此采用皮質酮損傷神經細胞來構建一種適用于研究中藥含藥血清體外抗抑郁藥理學機制的細胞模型，該模型可以模擬抑郁癥的興奮性/抑制性神經遞質失衡和炎癥損傷病理機制。采用皮質酮誘導的神經細胞細胞毒性法研究LBRDDS的神經保護作用，并通過分子對接、免疫熒光、功能增益或功能喪失實驗等多種實驗方法探索其潛在的藥理機制。從腸道吸收的LBRDDS生物活性化合物包括棕櫚酸、腎上腺酸、亞油酸、花生四烯酸和二十二生五烯酸等可以被腸道微生物群轉化或代謝。網絡藥理學分析和分子對接結果顯示脂肪酸代謝、神經遞質合成和神經炎癥可能是LBRDDS的潛在治療靶點。LBRDDS可以提高模型細胞的活性，降低乳酸脫氫酶的細胞毒性，恢復神經遞質失衡，減輕炎癥損傷，下調miRNA-144-3p的表達，增加Gad-67和VGAT的mRNA和蛋白表達水平，促進GABA的合成和轉運。
圖一 LBRD、空白血清和LBRDDS樣品中天然產物的鑒定
作者首先采用質譜分析最終測定了LBRDDS中的33種成分，包括棕櫚酸、腎上腺酸、亞油酸、花生四烯酸、12-環(huán)氧二十二酸等脂肪酸內源性代謝物，以及各種氨基酸成分如色氨酸、苯丁酸、l-苯丙氨酸、蛋氨酸和組氨酸，還有其他激素成分如雄酮、氟羥可的松、孕酮和丙酸睪酮。通過分析LBRD成分被血液吸收前后的變化，推測原型化合物成分的分子量較大，不能直接被血液或通過腦血屏障吸收，可能在腸道中進一步分解吸收。
圖二 LBRDDS中的生物活性化合物被腸道微生物群轉化或代謝
為了研究LBRD對腸道微生物群的影響，作者對SD大鼠盲腸內容物進行了16S rRNA測序分析。與對照組相比，LBRD組腸道微生物群結構和多樣性發(fā)生了變化，組間差異主要集中在科、屬、種，其中厚壁菌門豐度降低，放線菌門、變形菌門、擬桿菌門、軟壁菌門豐度增加。Beta多樣性顯示，LBRD組擬桿菌門、軟膜門、毛菌門、擬桿菌門、微球菌門、擬桿菌門、微球菌科、白菌科、羅氏科和魏氏菌的豐度與空白對照組有顯著差異。隨后，對腸道微生物群富集的代謝途徑進行了預測分析結果涉及核苷和核苷酸生物合成、氨基酸生物合成、脂肪酸和脂質生物合成、碳水化合物降解生物合成、次生代謝物生物合成等。gutMGene數(shù)據(jù)庫檢索結果明確表明棕櫚酸、脫氧膽酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、l-苯丙氨酸、l-組氨酸、色氨酸等活性成分可以調節(jié)腸道微生物群的代謝。以上結果表明LBRD可能通過調節(jié)擬桿菌的菌群豐度，改善腸道微生物群的代謝和轉化功能，促進多種脂肪酸和氨基酸的內源性代謝并增加神經遞質分泌，發(fā)揮神經系統(tǒng)保護功能。
圖三 LBRDDS對皮質酮誘導的原代皮層神經元細胞損傷模型活力的影響
與對照組細胞相比，空白血清對細胞活力無顯著影響。20 %的空白血清組細胞存活率顯著降低至72 %，20 %含藥血清組細胞存活率顯著降低。隨著含藥血清濃度的升高，細胞存活率逐漸降低，且呈濃度依賴性。因此，在后續(xù)的實驗中作者選擇了20 %以內的血清濃度進行藥效學篩選。CORT 100 μM、200 μM、400 μM、600 μM和800 μM處理24小時后，原代皮層神經元、PC12和Neuro-2a細胞的存活率出現(xiàn)不同程度下降，選擇細胞活力顯著下降至50 %左右的CORT濃度作為細胞模型干預濃度用于后續(xù)細胞實驗。然后，檢測不同濃度的LBRDDS增加細胞模型的細胞活力，抑制LDH細胞毒性的保護作用。LDH水平是細胞膜完整性的重要指標，通過檢測質膜破裂細胞在培養(yǎng)中釋放的LDH水平，可以實現(xiàn)細胞毒性的定量分析。與對照組相比，模型組的細胞存活率明顯降低；與模型組相比，5% LBRDDS可顯著提高原代皮層神經元的存活率，10 % LBRDDS可顯著提高PC12細胞和Neuro-2a細胞的存活率。同時，與對照組相比，模型組的LDH細胞毒性顯著增加；與模型組相比，LBRDDS組的LDH細胞毒性明顯降低。這些結果表明，CORT 400、600 μM干預后神經細胞存活率顯著降低，LDH細胞毒性增加，而5%或10 %的LBRDDS可提高神經細胞存活率，保護細胞完整性，降低LDH細胞毒性，減少神經細胞死亡，減輕細胞損傷。
圖四 LBRDDS對神經遞質和炎性細胞因子的影響
與對照組相比，原代皮層神經元細胞、PC12細胞、Neuro-2a細胞模型組中5-HT、GABA和IL-10的表達水平顯著降低，而Glu和IL-1β的表達水平顯著升高。相反，與模型組相比，5 % LBRDDS、10 %的LBRDDS、10 %的LBRDDS均能夠顯著提高5-HT、GABA和IL-10的表達水平，顯著降低Glu和IL-1β的表達水平。這些結果表明，皮質酮干預可誘導神經元抑郁樣表型，導致E/I失衡和炎癥水平升高，而LBRDDS可逆轉神經遞質和炎癥細胞因子水平，保護神經元細胞免受皮質酮損傷，表現(xiàn)出良好的神經保護作用。此外，作者還選擇了最佳濃度的米非司酮作為陽性對照藥物，以檢測其對Neuro-2a細胞模型的藥理作用。與模型組相比，5-HT、Glu、IL-10水平明顯改善，而GABA和IL-1β水平改善無統(tǒng)計學意義，LBRDDS的藥理作用與RU486一致，證明LBRDDS具有良好的神經保護作用。
圖五 LBRDDS調控miRNA-144-3p的表達，介導GABA合成和轉運
為了探討LBRDDS對神經細胞損傷模型中GABA水平影響的分子機制，作者采用qRT-PCR和蛋白印跡法分析了與GABA合成和釋放相關的基因和蛋白的表達水平。CORT 600 μM干預Neuro-2a細胞導致miRNA-144-3p的表達增加，Gad67和VGAT基因的表達水平降低，而10 % LBRDDS顯著逆轉了這些變化。蛋白表達與qRT-PCR結果一致，10 % LBRDDS顯著增加了細胞模型中Gad-67和VGAT蛋白的表達水平。qRT-PCR結果顯示，與CORT 600 μM組相比，miRNA-144-3p抑制劑+ CORT 600 μM組和CORT 600 μM + 10 % LBRDDS組miRNA-144-3p表達降低，而Gad67和VGAT表達增加。與CORT 600 μM + 10 % LBRDDS組相比，miRNA-144-3p OE + CORT 600 μM + 10 % LBRDDS組中miRNA-144-3p的表達水平顯著升高，而Gad67和VGAT的表達水平顯著降低。GABA的表達水平與qRT-PCR檢測結果一致，與CORT 600 μM + 10 % LBRDDS組相比，miRNA- 144-3p OE + CORT 600 μM +10 %LBRDDS組中GABA的表達水平顯著降低。這些結果表明，miRNA- 144-3p可以靶向負調控Gad67和VGAT基因的表達，通過調節(jié)miRNA-144-3p介導的GABA合成和轉運功能，10%的LBRDDS可以增加GABA濃度，從而緩解皮質酮誘導的神經細胞損傷，發(fā)揮抗抑郁作用。
綜上所述，本研究證明LBRDDS通過改善模型細胞活性，調節(jié)miRNA-144-3p介導的GABA合成和釋放，改善皮質酮誘導的神經細胞損傷模型中的神經遞質缺陷和炎癥失衡，發(fā)揮神經保護作用。這些發(fā)現(xiàn)可能為天然藥用植物的發(fā)展性突破以及抑郁癥的發(fā)病機制提供分子基礎。
文章來源：https://doi.org/10.1016/j.phymed.2023.155102
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