2023年6月16日美國(guó)斯克里普斯研究所神經(jīng)科學(xué)系Kara L. Marshall研究團(tuán)隊(duì)在Neuron雜志上發(fā)表文章“Labeling PIEZO2 activity in the peripheral nervous system”，揭示了使用FM 1-43標(biāo)記周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的PIEZO2活動(dòng)，進(jìn)而表征體內(nèi)機(jī)械感覺過程。
感覺神經(jīng)元檢測(cè)來自環(huán)境和內(nèi)部器官的機(jī)械力以調(diào)節(jié)生理機(jī)能。PIEZO2是一種機(jī)械感覺離子通道，對(duì)于觸覺、本體感覺和膀胱牽拉感至關(guān)重要，但其在感覺神經(jīng)元中的廣泛表達(dá)表明它具有尚未發(fā)現(xiàn)的生理作用。為了充分理解機(jī)械感覺生理學(xué)，必須知道表達(dá)PIEZO2的神經(jīng)元何時(shí)檢測(cè)到。熒光苯乙烯基染料 FM 1-43被證明可以標(biāo)記感覺神經(jīng)元。作者發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)絕大多數(shù)FM 1-43體感神經(jīng)元標(biāo)記依賴于周圍神經(jīng)末梢內(nèi)的PIEZO2活性。通過使用FM 1-43識(shí)別與排尿相關(guān)的新型表達(dá)PIEZO2的尿道神經(jīng)元來說明FM 1-43的潛力。這些數(shù)據(jù)表明，FM 1-43是通過體內(nèi)PIEZO2激活進(jìn)行機(jī)械敏感性的功能性探針，并將促進(jìn)多器官系統(tǒng)中已知和新型機(jī)械感覺過程的表征。
圖一 FM 1-43感覺神經(jīng)元的大部分?jǐn)z取取決于Piezo2的表達(dá)
在 HoxB8Cre鼠的尾部DRG中幾乎沒有廣泛標(biāo)記的DRG細(xì)胞體；DRG標(biāo)記顯示HoxB8Cre鼠中熒光的梯度下降；FM 1-43在脈管系統(tǒng)中經(jīng)?？梢?/span>，然而，這種血管標(biāo)記會(huì)在24小時(shí)后減少，并且可能反映了內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)吞活性和/或內(nèi)皮腔外葉的標(biāo)記。作者還從動(dòng)物從結(jié)狀神經(jīng)節(jié)中去除功能性Piezo2，結(jié)狀神經(jīng)節(jié)通過迷走神經(jīng)向身體的主要器官提供感覺神經(jīng)支配。KO動(dòng)物中幾乎不存在結(jié)狀神經(jīng)元細(xì)胞體標(biāo)記，Phox2bCre靶向的相鄰頸靜脈神經(jīng)節(jié)中的標(biāo)記仍然存在?？傊@些數(shù)據(jù)表明大多數(shù)FM 1-43感覺神經(jīng)元標(biāo)記依賴于PIEZO2表達(dá)。機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)位點(diǎn)位于外周感覺神經(jīng)元末梢，遠(yuǎn)離背根神經(jīng)節(jié)和結(jié)狀神經(jīng)節(jié)的細(xì)胞體。除了感覺神經(jīng)元細(xì)胞體之外，體內(nèi)注射FM 1-43還可標(biāo)記外周感覺末梢。為了研究結(jié)狀神經(jīng)節(jié)提供的感覺末梢，作者探究了環(huán)繞主動(dòng)脈中央弓的壓力感受器末梢以檢測(cè)血壓。有研究表明，PIEZO2陽性傳入神經(jīng)元只是支配主動(dòng)脈弓的神經(jīng)元的一個(gè)子集。作者發(fā)現(xiàn)FM 1-43標(biāo)記主動(dòng)脈弓神經(jīng)元的一個(gè)子集，FM 1-43標(biāo)記的還發(fā)生在毛狀皮膚的皮膚終末器官結(jié)構(gòu)中，該結(jié)構(gòu)圍繞毛囊來檢測(cè)各種刺激方式并最終傳達(dá)觸覺。
圖二 FM 1-43的DRG細(xì)胞類型的特征
使用有髓Ab和Ad低閾值機(jī)械感受器(LTMR)的標(biāo)記，作者發(fā)現(xiàn)50.6% ± 9.7% 的NFH陽性DRG占用FM 1-43的68.3% ± 5.2%。表達(dá)鈣結(jié)合蛋白的神經(jīng)元積累FM 1-43。高達(dá) 95% ± 3%的酪氨酸羥化酶群體（無髓鞘c-LTMR的標(biāo)記）與FM 1-43共標(biāo)記。這表明FM 1-43標(biāo)記了大部分無害的機(jī)械感受器，這些感受器依賴于PIEZO2來傳達(dá)觸覺。PIEZO2 轉(zhuǎn)錄本也在一些傷害感受器中被發(fā)現(xiàn)，這可能有助于FM 1-43的積累。為了標(biāo)記肽能和非肽能傷害感受群體，對(duì)原肌球蛋白受體激酶A (TRKA)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)和異凝集素進(jìn)行了染色。在FM 1-43標(biāo)記的神經(jīng)元中，觀察到與肽能傷害感受器的低重疊。PIEZO2在健康組織中的主要作用是傳遞無害的機(jī)械感覺而不是疼痛。這些結(jié)果表明PIEZO2依賴性FM 1-43標(biāo)記與參與PIEZO2活動(dòng)而非簡(jiǎn)單表達(dá)模式的神經(jīng)元類型重疊。
圖三 FM 1-43在皮膚終末器官結(jié)構(gòu)中的攝取
作者觀察到用NFH29標(biāo)記的有髓末端經(jīng)常重疊；45%FM染料信號(hào)與NFH重疊，在總NFH信號(hào)中，51%與FM 1-43重疊。作者對(duì)Ab RA-LTMR、錐形和保護(hù)毛囊周圍的縱向披針形末端進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)25%的總鈣結(jié)合蛋白信號(hào)與FM 1-43重疊。除了 LTMR，毛囊還接受來自環(huán)周高閾值機(jī)械感受(HTMR)末梢的神經(jīng)支配，這些末梢對(duì)疼痛刺激做出反應(yīng)。還發(fā)現(xiàn)FM 1-43標(biāo)記的邊緣部分與CGRP共定位（約2.5%），并且不到1%的CGRP信號(hào)對(duì)FM 1-43呈陽性。FM 1-43標(biāo)記有時(shí)是斑點(diǎn)或間歇性的，可能導(dǎo)致低估與更連續(xù)的標(biāo)記（如NFH或鈣結(jié)合蛋白）的實(shí)際重疊。這些結(jié)果表明FM 1-43在多毛皮膚中標(biāo)記了LTMR。TSC在其基部緊緊包裹著披針形和圓周末端。為了確定除了神經(jīng)元之外，FM 1-43是否還標(biāo)記這些細(xì)胞，作者對(duì)TSC標(biāo)記物S100b進(jìn)行了染色。盡管TSC細(xì)胞突起和神經(jīng)元末梢的交叉使得標(biāo)記難以區(qū)分，但發(fā)現(xiàn)沒有明確標(biāo)記的TSC細(xì)胞體。
圖四 FM染料以活性依賴性方式標(biāo)記皮膚終末器官結(jié)構(gòu)，并且在辣椒素刺激后不標(biāo)記表達(dá)TRPV1的神經(jīng)元
作者認(rèn)為去除腿部皮膚上的外部毛干會(huì)減少這些傳入神經(jīng)的機(jī)械激活，從而減少該區(qū)域的FM 1-43負(fù)荷。24小時(shí)后，剃光和脫毛后腿皮膚的披針形末端標(biāo)記顯著減少，而對(duì)側(cè)對(duì)照的毛區(qū)域顯示出明亮的標(biāo)記。檢查脫毛部位的邊界，發(fā)現(xiàn)毛茸茸的皮膚上有披針形標(biāo)記，緊鄰未標(biāo)記的脫毛皮膚。對(duì)背部皮膚的終末器官標(biāo)記進(jìn)行區(qū)域分析，擴(kuò)展了對(duì)多毛皮膚標(biāo)記模式的表征，它們作為通常存在于小鼠的觸覺刺激的外部來源籠子。在這兩種情況下，都觀察到披針形末端的標(biāo)記；作者使用CGRPCre+;GFP小鼠來識(shí)別大部分表達(dá)TRPV1的神經(jīng)元。首先給小鼠注射FM 4-64，兩小時(shí)后在后肢皮下注射辣椒素和逆行神經(jīng)元示蹤劑，以識(shí)別支配注射部位DRG神經(jīng)元。后肢傷害感受器的標(biāo)記很少見，發(fā)現(xiàn)用辣椒素未能產(chǎn)生可觀察到的染料攝取變化。進(jìn)一步證明了該工具在體內(nèi)特異性標(biāo)記PIEZO2依賴性神經(jīng)元活動(dòng)方面的實(shí)用性。
圖五 在細(xì)胞培養(yǎng)中，F(xiàn)M 1-43標(biāo)記隨著PIEZO2通道活動(dòng)而增加
使用流式細(xì)胞儀對(duì)群體熒光進(jìn)行定量顯示，FM 1-43對(duì)過表達(dá)PIEZO2的細(xì)胞進(jìn)行了標(biāo)記，但對(duì)轉(zhuǎn)染了對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)胞沒有標(biāo)記。作者對(duì)細(xì)胞進(jìn)行軌道搖動(dòng)作為簡(jiǎn)單的機(jī)械刺激，觀察到標(biāo)記增加了49% ± 8%，表明刺激依賴性攝取。對(duì)照細(xì)胞中的熒光在軌道搖動(dòng)時(shí)沒有變化，排除了單獨(dú)刺激增加背景標(biāo)記的可能性。與未受刺激的條件相比，機(jī)械刺激的PIEZO2R2686H表現(xiàn)出35% ± 10%的熒光增加。在有或沒有機(jī)械刺激的情況下觀察到熒光濃度依賴性減少，IC50值分別為115 ± 27和135 ± 31 mM。作者在FM染料存在的情況下對(duì)PIEZO1和 PIEZO2進(jìn)行了一組電生理記錄。表達(dá)PIEZO1的細(xì)胞的單通道電生理學(xué)表明PIEZO1和PIEZO2存在電壓-依賴方式。
圖六 FM 1-43揭示了雄性小鼠盆腔尿道中新穎的側(cè)化感覺末梢
參與檢測(cè)膀胱牽拉的神經(jīng)末梢難以可視化，但與尿道相關(guān)的機(jī)械感覺神經(jīng)元也有助于尿液反射。作者使用FM 1-43對(duì)LUT的調(diào)查揭示了一個(gè)新的群體男性盆腔尿道的神經(jīng)元。這些具有樹狀形態(tài)的致密神經(jīng)元末梢橫跨整個(gè)外側(cè)尿道區(qū)域。這些神經(jīng)元末梢未能在HoxB8Cre+;Piezo2f/f小鼠中標(biāo)記，表明它們的標(biāo)記取決于PIEZO2。在男性和女性的遠(yuǎn)端尿道中也觀察到形態(tài)上不同的神經(jīng)元末梢，外形類似于簡(jiǎn)單的游離神經(jīng)末梢。
圖七 樹狀尿道神經(jīng)元末梢的特征
在闡明這些樹狀尿道神經(jīng)元分子特征中，作者使用整體免疫染色和基因報(bào)告小鼠將FM染料標(biāo)記與神經(jīng)元標(biāo)記共定位。盡管泌尿道有致密的肽能神經(jīng)支配，但這些神經(jīng)元末梢不是CGRP陽性。作者還發(fā)現(xiàn)樹狀尿道神經(jīng)元幾乎全部為NFH陽性，表明這些是可能源自DRG的中等到大直徑的神經(jīng)元。免疫標(biāo)記并未延伸到神經(jīng)末梢。因此，復(fù)雜的末端形態(tài)完全由染料解析，展示了使用FM 1-43進(jìn)行神經(jīng)元定位的優(yōu)勢(shì)。此外，作者使用相同的免疫染色策略證實(shí)這些結(jié)構(gòu)仍然存在于HoxB8Cre+;Piezo2f/f KO動(dòng)物中，表明FM染料標(biāo)記的缺乏是由于PIEZO2的缺失，而不是這些神經(jīng)末梢的發(fā)育損失。尿道神經(jīng)元標(biāo)記在填充1小時(shí)后很明顯，而在未填充的情況下幾乎不存在。這表明排尿是參與尿道神經(jīng)元中PIEZO2依賴性神經(jīng)元活動(dòng)的相關(guān)刺激。
綜上所述，作者使用FM 1-43來精確定位尿道中獨(dú)特的樹狀神經(jīng)末梢形態(tài)，該形態(tài)似乎在排尿期間參與。需要進(jìn)一步研究來充分表征這些神經(jīng)元的起源并定義它們?cè)诿谀虻郎韺W(xué)中的功能，但這一發(fā)現(xiàn)代表了通過體內(nèi)FM 1-43標(biāo)記實(shí)現(xiàn)的新方向。
https://www.cell.com/neuron/fulltext/S0896-6273(23)00388-4
特別鳴謝
聯(lián)系客服
