疼痛是人和動物生命體最基本的神經(jīng)生理功能之一，可以分為急性疼痛和慢性疼痛。急性疼痛是機體躲避進一步傷害的保護性生理機能，當機體遭遇由外界環(huán)境因素或內(nèi)在病理反應(yīng)引起的傷害性事件時，遍布全身的感覺神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)末梢會立即把這些有害的信息轉(zhuǎn)化成疼痛信號，并第一時間觸發(fā)神經(jīng)肌肉反射（reflection）。例如手碰到熱的物體會下意識縮手，隨后大腦才意識到火燒的疼痛，這種疼痛就是急性疼痛。
慢性疼痛是一種緩慢而長期存在的病理性疼痛，在全球范圍內(nèi)，慢性疼痛已經(jīng)成為一項重大公共衛(wèi)生難題。例如，根據(jù)美國疾病控制與預防中心(CDC) 2018年的數(shù)據(jù)，僅美國就有超過5000萬人具有不同程度的慢性疼痛，這個數(shù)字比罹患心臟病、癌癥及糖尿病的患者總和還要多。目前臨床上并沒有有效治療慢性疼痛的藥物。
慢性疼痛似乎與睡眠不足有著千絲萬縷的聯(lián)系。不知道大家是否有過這種體驗：如果身體上持續(xù)疼痛，睡眠質(zhì)量就會下降，而如果長時間失眠，也會有渾身疼痛的癥狀，這些直觀的感受都提醒我們，睡眠不足和慢性疼痛之間存在關(guān)聯(lián)，如果這種關(guān)聯(lián)性存在的話，那么我們是不是就可以通過睡眠相關(guān)療法對慢性疼痛進行干預和治療呢？
2023年1月23日，美國哥倫比亞大學醫(yī)學中心的周航博士（第一作者）和楊光博士（通訊作者）及其同事們在Nature Neuroscience雜志上發(fā)表了文章A sleep-active basalocortical pathway crucial for development and maintenance of chronic pain，首次明確揭示了睡眠參與慢性疼痛的形成與維持的大腦神經(jīng)線路基礎(chǔ)。該線路從外周感覺神經(jīng)纖維的損傷端起始，途經(jīng)中腦臂旁核、基底前腦核團，抵達初級感覺皮層，形成了一條整合疼痛信號、睡眠調(diào)控核團和皮層神經(jīng)調(diào)制的通路。這項研究是近半個世紀以來，首次為理解睡眠質(zhì)量和慢性疼痛之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)提供了明確的神經(jīng)生物學證據(jù)，可能對治療慢性疼痛、開發(fā)相關(guān)療法和靶向藥物具有潛在的重要提示意義。
首先為了研究睡眠在疼痛相關(guān)環(huán)路中的作用，作者首先檢測了SNI模型中S1椎體神經(jīng)元在睡眠–覺醒狀態(tài)下的活動，SNI模型是一種坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷的神經(jīng)病理性慢性疼痛模型，S1是初級軀體感覺皮層。用雙光子顯微鏡對小鼠錐體神經(jīng)元（PNs）進行縱向成像，同時記錄了腦電圖（EEG）和肌電圖（EMG）信號將神經(jīng)元活動與動物的大腦狀態(tài)直接聯(lián)系起來。
與術(shù)前相比，作者發(fā)現(xiàn)，在清醒和非快速眼動（NREM）睡眠中，SNI后第2/3層（L2/3）PNs中，3-21d的Ca2+活性逐漸增加，但在快速眼動（REM）睡眠中沒有增加（圖1c）。值得注意的是，SI PNs的過度激活在非快速眼動睡眠中比在安靜清醒時更明顯。在SNI后3天（神經(jīng)性疼痛的急性期），15%和6%的PNs分別在NREM和覺醒狀態(tài)下表現(xiàn)出自發(fā)活動增加，而在SNI后14天(在NREM狀態(tài)和清醒狀態(tài)下，Ns分別有66%和27%表現(xiàn)出自發(fā)活動增加（圖1d）。
綜上所述，這些結(jié)果表明，在神經(jīng)性疼痛的形成過程中，SI PNs在NREM睡眠中被強烈激活。
Fig. 1: Pyramidal neurons and VIP interneurons are hyperactive during NREM sleep in S1 of mice with neuropathic pain
VIP INs已被證明可以抑制SST和PV INs ，從而去抑制PNs活性。為了檢測NREM睡眠中VIP INs的激活是否有助于小鼠S1中PN的過度激活以及從急性疼痛到慢性疼痛的轉(zhuǎn)變，作者使用化學遺傳和光遺傳方法降低了體內(nèi)VIP的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，uPSEM817處理足以防止SNI誘導的PNs過度活躍。相比之下，在ZT14時注射uPSEM817對SNI小鼠中PNs活性的降低只有輕微的影響（圖2c）。
當測量動物的疼痛行為時，作者發(fā)現(xiàn)在休息階段期間VIP INs的持續(xù)抑制可以阻止機械性和熱性異位痛的發(fā)展，而在活動階段的VIP抑制對動物的疼痛感覺沒有影響（圖2d）
接下來研究了僅在睡眠期間使用光激活的氯離子通道來沉默VIP INs的影響。作者發(fā)現(xiàn)與NREM配對的光，而不是快速眼動或清醒，顯著增加了動物的傷害性感受閾值（圖2f）。在沒有eNpHR表達EYFP的對照組小鼠中，非快速眼動期間的光傳遞對疼痛感覺沒有影響。
這些發(fā)現(xiàn)表明，非快速眼動睡眠中VIP INs的激活對于SNI后從急性疼痛到慢性疼痛的轉(zhuǎn)變至關(guān)重要。在相同數(shù)量的NREM睡眠（4-5小時），但在一天的不同時間（即ZT10-ZT2）抑制VIP INs對疼痛緩解的效果相似（圖2f），表明晝夜節(jié)律時間沒有參與這一過程。
Fig. 2: Silencing VIP INs during NREM sleep prevents S1 hyperactivation and nociceptive allodynia.
接下來，作者研究了非快速眼動睡眠中VIP神經(jīng)元活動增加的機制。皮質(zhì)VIP INs表達膽堿能受體，并可被乙酰膽堿（ACh）通過激活含有β2或α7亞基的煙堿乙酰膽堿受體（nAChR）強烈激活。從基底前腦的前核（aNB）到S1有強烈的膽堿能投射，因此，作者檢測了S1 VIP INs是否直接由aNB膽堿能細胞支配。結(jié)果顯示，16%的VIP INs是mCherry+；在S1接受aNB→S1遠程投影的L2/3中，它們占總數(shù)的24%。95%的aNB→S1投射細胞為ChAT+細胞（圖3d）。
總之，這些結(jié)果表明，S1中16%的VIP INs接收來自aNB的單突觸膽堿能輸入。
Fig. 3: Monosynaptic connectivity from basal forebrain to VIP INs in S1.
以上研究結(jié)果表明，aNB膽堿能輸入可能在非快速眼動睡眠中激活VIP INs中起重要作用。
為了驗證這一點，作者首先檢測了非快速眼動睡眠期間aNB→S1膽堿能終末的活性。與SNI前相比，aNB→S1ChAT+軸突在SNI后1-7天的NREM睡眠中表現(xiàn)出Ca2+活性水平的增加（圖4a），表明S1中ACh的釋放升高。值得注意的是，每天在皮質(zhì)休息階段給予DHβE，β2*nAChRs 的拮抗劑，消除SNI小鼠的持續(xù)性異位痛，而在活性階段拮抗 β2*nAChRs 沒有持久的行為影響（圖4c)
這些數(shù)據(jù)表明，神經(jīng)性疼痛的發(fā)展涉及到aNB的膽堿能輸入升高，aNB主要通過ACh和β2*nAChRs與S1 VIP INs 通信。
Fig. 4: Enhanced aNB→S1 cholinergic inputs during NREM sleep in neuropathic pain.
為了更好地理解aNB→VIP INs在神經(jīng)性疼痛發(fā)展中的作用，作者研究了在睡眠中沉默aNB→S1投射的影響。
通過光、化學遺傳方法，特異性抑制aNB-S1投射，并且觀測S1 VIP IN 和PN的鈣成像，結(jié)果表明，在休息階段抑制aNB-S1投射可以降低S1 VIP IN 和PN鈣活性，且可以緩解SNI小鼠慢性疼痛。之后作者又在不同睡眠階段抑制這一投射來觀測疼痛行為。在NREM 光抑制aNB-S1膽堿能投射可以緩解異位痛和持續(xù)性疼痛，表明SNI后在NREM 中抑制aNB-S1 CHAT可以防止慢性疼痛的形成。由于神經(jīng)性疼痛的發(fā)展伴隨著S1 PNs中突觸后樹突棘的結(jié)構(gòu)重構(gòu)，作者又研究了抑制aNB-S1 CHAT是否可以阻止S1樹突棘重構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGFP對照組一周后樹突棘形成和消除顯著增加，在zt2時使用uPSEM817處理的小鼠在SNI一周后樹突棘形成和消除沒有影響，且樹突棘重構(gòu)率與小鼠機械性疼痛閾值之間有很強相關(guān)性。
綜上，SNI后NREM 抑制aNB-S1投射可以抑制PN過度活躍，突觸重構(gòu)和慢性疼痛的發(fā)展。
Fig. 5: Silencing aNB→S1 projections during NREM sleep prevents S1 plasticity and pain chronicity.
那么aNB激活又是什么引起的呢？
PB是大腦傳遞周圍傷害性信號的主要區(qū)域，且PB-aNB投射與睡眠調(diào)節(jié)有關(guān)，因此作者檢測了NREM PB-aNB投射神經(jīng)元的活性。結(jié)果顯示，與SNI前相比，在SNI后1-7d的NREM中，PB-aNB投射鈣活動水平顯著升高，表明PB可能在神經(jīng)性疼痛的NREM 中發(fā)揮了激活aNB-S1回路的作用。為了驗證這一點，作者在aNB-S1投射末端進行鈣成像，通過光遺傳抑制PB-aNB，結(jié)果顯示，NREM 光抑制PB-aNB可以大幅度減少S1末端鈣活動，而wake期間抑制無顯著差異。在行為上，NREM 抑制PB-aNB可以減輕異位痛。
總之，NREM 期間 抑制PB-aNB-S1回路有助于防止慢性疼痛的形成。
最后作者又評估了 PB的激活是否是由于受傷周圍神經(jīng)的傷害性輸入增加導致。通過對背根神經(jīng)節(jié)鈣成像發(fā)現(xiàn)，與SNI前相比，DRG在NREM 期間鈣活性顯著升高。
Fig. 6: Activation of PB→aNB→S1 circuits during NREM sleep drives the development of chronic pain.
最后作者又探究了這種睡眠特異性神經(jīng)回路能否逆轉(zhuǎn)已經(jīng)形成的慢性疼痛癥狀。在慢性神經(jīng)痛小鼠中通過化學遺傳抑制S1 VIP IN，發(fā)現(xiàn)在zt2注射uPSEM817可以緩解SNI小鼠異位痛，在zt14時注射對已建立的疼痛行為沒有影響。有趣的是，當zt14小鼠隨后在zt2再給予uPSEM817 5d時，異位痛得以緩解，表明睡眠時抑制VIP INs在治療慢性神經(jīng)性疼痛的中的必要性。且睡眠階段對VIP IN抑制消除了SNI誘導的PN過度激活。
Fig. 7: The sleep phase-targeted VIP inhibition reverses the established chronic neuropathic pain.
總的來說，這項研究表明，在NREM期間，外周神經(jīng)損傷可引發(fā)aNB-S1 CHAT 增強，ACH釋放異常增加，這會讓VIP神經(jīng)元活動進一步增強，使興奮性神經(jīng)元更加活躍，誘發(fā)突觸可塑性的變化，促進慢性疼痛在大腦皮層中的編碼，最終導致慢性疼痛的形成。
這項研究的意義在于，這一神經(jīng)通路的發(fā)現(xiàn)，是近半個世紀以來首次翔實地揭示了睡眠參與慢性疼痛形成與維持的一種神經(jīng)機理，該機理包括神經(jīng)線路解剖學、細胞類型特異性及神經(jīng)調(diào)制分子機制在內(nèi)的多個方面，為徹底解決“睡眠與慢性疼痛”這個謎題，提供了新的線索。同時，該研究也為臨床和制藥領(lǐng)域開發(fā)治療慢性疼痛的新型療法和新型藥物提供了一種值得探索的思路。也就是說，在睡眠階段抑制PB-aNB-S1這一途徑，可以逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元過度激活并減輕疼痛。
https://doi.org/10.1038/s41593-022-01250-y
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