慢病毒載體的進(jìn)化
慢病毒屬（lentivirus）在分類上屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，包括8種能夠感染人和脊椎動(dòng)物的病毒，原發(fā)感染的細(xì)胞以淋巴和巨噬細(xì)胞為主，導(dǎo)致感染個(gè)體發(fā)病。慢病毒感染的主要臨床特點(diǎn)是在出現(xiàn)典型的臨床癥狀以前，經(jīng)歷較長(zhǎng)的潛伏期，之后緩慢發(fā)病，因此被稱為慢病毒。慢病毒載體是以慢病毒的基因組為基礎(chǔ)，然后去除了多個(gè)和病毒活性相關(guān)的序列結(jié)構(gòu)，使其具備生物學(xué)安全性，這個(gè)基因組架構(gòu)中含有表達(dá)結(jié)構(gòu)并可容納較大外源基因片段，并將之制備成載體。
慢病毒載體來源于多個(gè)物種, 如人類免疫缺陷病毒1 型(HIV-1)、2 型(HIV-2), 猴免疫缺陷病毒(S IV), 馬傳染性貧血病毒(EIAV), 豬免疫缺陷病毒(FIV), 公山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒(CEAV), 牛免疫缺陷病毒(BIV)等。其中以HIV-1為代表，對(duì)其研究最廣泛最深入。
圖1 野生型HIV-1的基因結(jié)構(gòu)
HIV-1為雙鏈RNA病毒，其基因組結(jié)構(gòu)（圖一）類似于其它的反轉(zhuǎn)錄病毒。根據(jù)編碼的蛋白重要性不同可將9個(gè)基因分為以下三類：
a. 編碼三種主要病毒結(jié)構(gòu)蛋白的基因：gag、pol和env。gag基因編碼病毒的核心蛋白如核衣殼蛋白（p7）、內(nèi)膜蛋白（p17）和衣殼蛋白（p24）；pol基因編碼病毒復(fù)制相關(guān)的酶；env基因編碼病毒包膜糖蛋白。
b. 編碼兩個(gè)調(diào)節(jié)蛋白的基因：tat、rev。rev主要參與蛋白調(diào)節(jié)的表達(dá)水平，tat參與蛋白轉(zhuǎn)錄的控制，與病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)序列（long terminalrepeats,LTRS）結(jié)合后促進(jìn)病毒的所有基因的轉(zhuǎn)錄。
c. 編碼四個(gè)輔助蛋白的基因：vif、vpr、vpu、nef，幫助病毒包裝完成。
除此以外，HIV-1的基因組結(jié)構(gòu)中還有病毒復(fù)制和包裝等所需要的信號(hào)序列結(jié)構(gòu)。
為了提高載體的生物安全性，HIV-1型慢病毒載體系統(tǒng)經(jīng)歷了以下四個(gè)階段：
第一階段是兩質(zhì)粒系統(tǒng)，以HIV-1為骨架構(gòu)建起來的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，去除了HIV基因組中的的反式作用蛋白基因序列，然后包裝上含有目標(biāo)基因的重組載體和能夠反式提供病毒顆粒所需蛋白的包裝質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞（如293T細(xì)胞）進(jìn)行包裝。但是這種復(fù)制缺陷型的載體系統(tǒng)產(chǎn)生病毒的滴度很低，而且只能感染CD4+細(xì)胞，并且在轉(zhuǎn)染的過程中載體DNA和包裝的蛋白DNA很可能會(huì)重組，導(dǎo)致產(chǎn)生活性HIV病毒的可能性，具有很大的風(fēng)險(xiǎn)。
第二階段是三質(zhì)粒系統(tǒng)，具體是將HIV-1基因組中負(fù)責(zé)包裝，逆轉(zhuǎn)錄和整合所需要的順式作用序列結(jié)構(gòu)和編碼反式作用蛋白的序列分別克隆到三個(gè)獨(dú)立的質(zhì)粒中，第一個(gè)是含有CMV啟動(dòng)子的包裝質(zhì)粒，控制除env的所有病毒結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)；第二個(gè)是含有表達(dá)水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）基因序列的包膜質(zhì)粒，這個(gè)基因用于代替原病毒中的env基因，這個(gè)基因的產(chǎn)物可以提高病毒的宿主范圍；第三個(gè)就是病毒載體質(zhì)粒，主要用于攜帶外源目的基因。但是這個(gè)三質(zhì)粒系統(tǒng)因?yàn)楸Ａ袅?/span>HIV-1的附屬基因，導(dǎo)致出現(xiàn)具有活性病毒的可能性較大，具有一定的風(fēng)險(xiǎn)。
第三階段是在三質(zhì)粒系統(tǒng)中去除了HIV病毒所有輔助基因序列，將HIV中原有的9個(gè)基因只保留了3個(gè)（gag、pol、rev）于慢病毒載體中，這樣很大程度的降低了重組的可能性，極大的提高了安全系數(shù)。
第四階段是四質(zhì)粒系統(tǒng)，目前被廣泛應(yīng)用的慢病毒載體系統(tǒng)，這個(gè)系統(tǒng)是在三質(zhì)粒系統(tǒng)的基礎(chǔ)上將env基因單獨(dú)放在一個(gè)表達(dá)質(zhì)粒上，而且還去除了tat基因，這樣就形成了四質(zhì)粒系統(tǒng)。該體系大大的提高了使用安全性，而且該系統(tǒng)中還含有可誘導(dǎo)性基因，使基因的條件性表達(dá)和基因敲除都成為可能，并且繼續(xù)保留了自身失活的優(yōu)勢(shì)，為探索基因的功能提供了有利的工具。
慢病毒載體的應(yīng)用
慢病毒載體由于其自身諸多優(yōu)勢(shì)，近些年來得到了越來越多的認(rèn)可及應(yīng)用。如聯(lián)合RNA干擾（RNA interference,RNAi）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究、基因治療以及細(xì)胞和動(dòng)物模型建立等領(lǐng)域。
在癌癥治療方面：Gerolami等人將帶有HSV-TK/GFP融合基因的慢病毒載體在體外轉(zhuǎn)染小鼠肝癌細(xì)胞與正常肝細(xì)胞，同時(shí)也轉(zhuǎn)染了大鼠體內(nèi)的肝癌細(xì)胞，結(jié)果表明慢病毒載體不僅在體內(nèi)外都能有效地轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，并且對(duì)正常的肝細(xì)胞不起作用，而且轉(zhuǎn)染癌細(xì)胞后有效抑制了癌細(xì)胞的生長(zhǎng)而不引發(fā)肝臟毒性效應(yīng)。類似的，Yu等人以前列腺癌細(xì)胞為研究對(duì)象，把受雄性激素調(diào)控并在前列腺特異表達(dá)的啟動(dòng)子和另一EGFP基因插入慢病毒載體中，然后分別轉(zhuǎn)染癌細(xì)胞和正常細(xì)胞。結(jié)果只在癌細(xì)胞中觀察到了EGFP的表達(dá)，雄性激素還能促進(jìn)EGFP的表達(dá)而不改變其表達(dá)特異性。
在抗HIV方面：Banerjen等人將抗Rev的siRNA基因轉(zhuǎn)入CD34+造血干細(xì)胞中，然后讓這些干細(xì)胞在體外分化為T細(xì)胞，在SCID-hu小鼠體內(nèi)分化為巨噬細(xì)胞。接著他們用HIV-1去感染這些T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩種細(xì)胞都明顯的抗HIV-1。除此之外，利用慢病毒載體將表達(dá)反義的核酸基因轉(zhuǎn)入T細(xì)胞和CD34+細(xì)胞也可以達(dá)到HIV-1的效果。Davis等人設(shè)計(jì)開發(fā)了一種HIV-1來源的載體VRX496，該載體能有效的轉(zhuǎn)染人CD34+細(xì)胞和CD4+淋巴細(xì)胞，同時(shí)還攜帶了一段反義序列能有效地抑制HIV外殼蛋白的表達(dá)，從而抑制HIV的復(fù)制。
結(jié)合RNAi進(jìn)行功能研究：慢病毒載體結(jié)合RNAi技術(shù)不僅可以用于基因治療，而且可以研究細(xì)胞中特定基因的功能。并且兩種技術(shù)的結(jié)合還可以克服由dsRNA引起的干擾素效應(yīng)。Katayama等人利用慢病毒載體介導(dǎo)的shRNA表達(dá)系統(tǒng)研究過氧化物酶體增殖體激活受體γ(PPARγ)的作用機(jī)制。PPARγ在脂肪細(xì)胞分化及其它多種細(xì)胞的生理過程中都起著重要作用，所以他們先找到可以抑制PPARγ表達(dá)的shRNA，然后用慢病毒載體將其導(dǎo)入3T3-L1細(xì)胞，PPARγ的表達(dá)被抑制后，前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化受到了明顯的抑制。這個(gè)結(jié)果為進(jìn)一步闡明PPARγ的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。除此之外，慢病毒載體還可以構(gòu)建RNAi文庫(kù)來實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的功能基因組的研究。
在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物方面的應(yīng)用：慢病毒載體對(duì)培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型有很好的作用，它將目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞后經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄、整合等，使優(yōu)勢(shì)基因能在宿主體內(nèi)得到良好的表達(dá)。這樣就能得到需要帶有目的基因的個(gè)體。由于其操作簡(jiǎn)單，對(duì)宿主細(xì)胞有良好的適應(yīng)性，使得慢病毒系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物方面有著良好的應(yīng)用前景。
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