細(xì)胞增殖基礎(chǔ)知識(shí)可閱讀文章：
醫(yī)學(xué)科研實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)知識(shí)筆記（一）：細(xì)胞增殖
1.原理
活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在570nm波長處測(cè)定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測(cè)得的吸光度值（即OD值），來判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)（如果是測(cè)藥物毒性，則表示藥物毒性越?。?。
2.試劑及耗材
CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、生物安全柜、倒置顯微鏡 、低速離心機(jī)、酶標(biāo)儀、8道排槍、培養(yǎng)基 、胎牛血清 、MTT、 DMSO、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、胰酶、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板等。
3.注意事項(xiàng)
（01）選擇適當(dāng)的細(xì)胞接種濃度和培養(yǎng)時(shí)間。
（02）設(shè)置調(diào)零孔（只加培養(yǎng)基100ul、MTT10ul、二甲基亞砜100ul）。
（03）設(shè)置空白孔（細(xì)胞、藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液共100ul、10ulMTT 、100ul二甲基亞砜）。
（04）MTT實(shí)驗(yàn)吸光度最后要在0-0.7之間，超出這個(gè)范圍就不是直線關(guān)系。
（05）96孔板邊緣32孔用無菌PBS填充，因?yàn)檫吘壍?2孔中水分蒸發(fā)很快，藥物易被濃縮，對(duì)實(shí)驗(yàn)影響大。同時(shí)加入PBS液填充后，可以一定程度上保持中間孔的水分。
（06）防止藥物與MTT反應(yīng)。如果96孔板中加入了具有氧化還原性的藥物，比如谷胱甘肽、Vit E、VitC，那建議用PBS將細(xì)胞洗洗，否則這些藥物會(huì)將MTT還原成棕褐色沉淀，這種效果可能是不需要的。
（07）吸收值分析。在理想的MTT實(shí)驗(yàn)中，如果是細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)，不加藥物處理的空白組的吸收值應(yīng)該在0.8-1.2左右，太小檢測(cè)誤差占的比例較多，太大吸收值可能已經(jīng)超出線性范圍。這個(gè)原理在朗伯-比爾定律中有解釋。
（08）培養(yǎng)過程中換液。100ul的培養(yǎng)液對(duì)于10的4～5次方的增殖期細(xì)胞來說，很難維持50h以上，如果營養(yǎng)不夠的話，細(xì)胞會(huì)由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結(jié)果。如果培養(yǎng)時(shí)間長，在48h應(yīng)該換液一次。
（09）避免血清干擾。高的血清物質(zhì)會(huì)影響試驗(yàn)孔的光吸收值。由于試驗(yàn)本底增加，會(huì)試驗(yàn)敏感性。因此，一般選小于10％胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。
（10）判斷污染。如加入MTT后都有個(gè)別孔立即變?yōu)樗{(lán)黑色，則污染的可能性極大。在加MTT前可以先在鏡下觀察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是臨近的。
（11）加DMSO前要把液體小心吸掉。但培養(yǎng)液里的紫色結(jié)晶可能會(huì)吸去，可在這之前先用平板離心機(jī)離心96孔板，2000r，5分鐘，然后吸掉上清(如果是懸浮細(xì)胞，則推薦此法，懸浮細(xì)胞要離心2500rpm×10min.且其做MTT最好用圓底型96孔板，清除上清時(shí)注意不要把下面的結(jié)晶顆粒吸掉。對(duì)于貼壁細(xì)胞，可以試著將96孔板傾斜30度角，然后用槍尖慢慢吸。
（12）MTT法只能用來檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力，但不能測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。在用酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果的時(shí)候，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的線性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范圍內(nèi)。MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，0.22μm過濾后4℃避光保存兩周內(nèi)，或配制成5mg/ml保存在-20℃長期保存，避免反復(fù)凍融，小劑量分裝，用避光袋或錫箔紙包住避光以免分解，當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)不能再用。一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時(shí)候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配那么多，尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)就絕對(duì)不能再用了。MTT有致癌性，用的時(shí)候小心，有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對(duì)菌很敏感；往96孔板加時(shí)不避光也沒有關(guān)系，畢竟時(shí)間較短，或者不放心的時(shí)候可以把操作臺(tái)上的照明燈關(guān)掉。
4.實(shí)驗(yàn)步驟：
4.1 細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
（1） 0.5%的胰酶消化對(duì)數(shù)期細(xì)胞，待細(xì)胞即將脫離皿底時(shí)，加少量血清終止反應(yīng)，1000r/min，離心5min，吸去上清，將細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)基吹打混勻，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整其濃度至5-10×10^4/ml。
（2）取4塊96孔板，分別標(biāo)記為0h、24h、48h、72h，，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，每板分別鋪8組細(xì)胞，分別為3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000個(gè)/孔，邊緣孔用無菌PBS填充以消除邊緣效應(yīng)。
（3）5%CO2，37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h取出一塊96孔板檢測(cè)：
a) 每孔加入10 μL MTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-6h；
b) 小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液（用移液器吸取孔內(nèi)培養(yǎng)液，吸取的時(shí)候要注意移液頭要緊貼孔內(nèi)側(cè)壁吸取，不要觸碰底部的紫色結(jié)晶。或者將96孔板倒扣于濾紙上來吸取孔內(nèi)的培養(yǎng)液）；
c) 每孔加入150μL DMSO，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解（加入 DMSO 溶解后，將加入DMSO的96孔板放入37℃ 孵箱內(nèi)孵育 10～20 min，這樣有助于 DMSO對(duì)紫色結(jié)晶物的溶解（尤其在冬天））；
d) 加DMSO后10min內(nèi)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔波長490nm的吸光值；
（4） 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖標(biāo)準(zhǔn)曲線。選擇合適的細(xì)胞濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
4.2 MTT藥物毒性實(shí)驗(yàn)步驟
（1）0.5%的胰酶消化對(duì)數(shù)期細(xì)胞，加少量血清終止反應(yīng)，1000r/min，離心5min，吸去上清，將細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)基吹打混勻，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整其濃度至5-10×104/ml，藥物毒性實(shí)驗(yàn)一般每孔細(xì)胞數(shù)量5000—10000個(gè)（具體數(shù)目根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)判斷）。此外，還應(yīng)根據(jù)細(xì)胞本身特性，如生長快慢，來決定細(xì)胞數(shù)量。比如：生長較快的細(xì)胞密度可略小。下面是幾種常見的細(xì)胞接種數(shù)量(來源于網(wǎng)絡(luò)，僅供參考）。
（2）將細(xì)胞懸液制備好后，輕輕混勻，每孔加入90μl細(xì)胞懸液, 這樣待測(cè)細(xì)胞的密度為5000—10000/孔（邊緣孔用無菌PBS填充）。
注意：因細(xì)胞在混勻后仍要繼續(xù)沉降，因此接種的過程中要反復(fù)多次混勻，如每加5個(gè)孔就混勻一次，以確保接種的細(xì)胞密度在各孔之間完全相同，這對(duì)于MTT的結(jié)果至關(guān)重要。
（3）5%CO2，37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物。（原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩h，或半天時(shí)間，但我們實(shí)驗(yàn)室常在前一天下午鋪板，次日上午加藥。加藥時(shí)按照所需的濃度在EP管中先稀釋好，每孔加入10μl已經(jīng)稀釋好藥物，使每孔最終體積為100μl，為了避免產(chǎn)生誤差，稀釋好的藥物體積應(yīng)略大于所需藥物的體積。需要注意的是，以DMSO 作為溶劑溶解的藥物至少需要進(jìn)行100倍以上稀釋才能使用，因?yàn)樽饔糜诩?xì)胞DMSO的含量高于1%時(shí)，DMSO會(huì)殺死細(xì)胞從而影響判斷。）
（4）按照藥物作用時(shí)間點(diǎn)，每24 h取出一塊96孔板檢測(cè)：
a) 每孔加入10 μL MTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-6h；
b) 小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液（用移液器吸取孔內(nèi)培養(yǎng)液，吸取的時(shí)候要注意移液頭要緊貼孔內(nèi)側(cè)壁吸取，不要觸碰底部的紫色結(jié)晶?；蛘邔?6孔板倒扣于濾紙上來吸取孔內(nèi)的培養(yǎng)液）；
c) 每孔加入150μL DMSO，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解（加入 DMSO 溶解后，將加入DMSO的96孔板放入37℃ 孵箱內(nèi)孵育 10～20 min，這樣有助于 DMSO對(duì)紫色結(jié)晶物的溶解（尤其在冬天））；
d) 加DMSO后10min內(nèi)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔波長490nm的吸光值；
（5）同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。
（6）MTT結(jié)果分析
關(guān)于如何計(jì)算IC50，使用改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
Xm:lg 最大劑量
I:lg(最大劑量/相臨劑量)
P:陽性反應(yīng)率之和
Pm:最大陽性反應(yīng)率
Pn:最小陽性反應(yīng)率
舉個(gè)例子：各藥物濃度作用于某腫瘤細(xì)胞后所得MTT值如下：
公式中的最大最小陽性反應(yīng)率就是最大最小抑制率
抑制率=1-加藥組OD值/對(duì)照組OD值，如對(duì)于100ug/ml的藥物，其抑制率=1-0.080/0.614=0.869，各組抑制率如下：
代入計(jì)算公式：
該藥物的IC50值為45.186ug/ml，IC50值也可以通過Graphpad prism7進(jìn)行計(jì)算，具體可參考文章：
https://jingyan.baidu.com/article/fd8044fa19f4065030137a60.html；
https://www.graphpad.com/guides/prism/7/curve-fitting/index.htm?reg_dr_inhibit_variable.htm
4.3 MTT增殖實(shí)驗(yàn)
（1）分別收集各組對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度；
（2）取4塊96孔板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，鋪板使待測(cè)細(xì)胞為5×10^3 cell/孔（邊緣孔用無菌PBS填充以消除邊緣效應(yīng)），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；
（3）5%CO2，37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h取出一塊96孔板檢測(cè)：
a) 每孔加入20 μL MTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h；
b) 小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液（用移液器吸取孔內(nèi)培養(yǎng)液，吸取的時(shí)候要注意移液頭要緊貼孔內(nèi)側(cè)壁吸取，不要觸碰底部的紫色結(jié)晶?；蛘邔?6孔板倒扣于濾紙上來吸取孔內(nèi)的培養(yǎng)液）；
c) 每孔加入150μL DMSO，使結(jié)晶物充分溶解（加入 DMSO 溶解后，將加入DMSO的96孔板放入37℃ 孵箱內(nèi)孵育 10～20 min，這樣有助于 DMSO對(duì)紫色結(jié)晶物的溶解（尤其在冬天））；
d) 加DMSO后10min內(nèi)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔波長490nm的吸光值。
（4）數(shù)據(jù)處理及MTT增殖曲線繪制。
Ending
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