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1. 來自人類松果腺蛋白基因的功能富集分析

我們通過GO分析檢測了松果腺的蛋白質(zhì)組成。我們?cè)诟患治鲋胁捎昧藘煞N計(jì)算方法，首先，我們?cè)谫|(zhì)譜分析中包含了所有蛋白（非0；如，具有LFQ > 0的蛋白質(zhì)）并采用全轉(zhuǎn)錄組作為背景，采用此策略，我們檢測出51條高度富集的通路（q值 < 0.01）。根據(jù)其在松果腺中的功能相關(guān)的7條通路為：線粒體包膜、色素顆粒、氧化還原作用、細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合囊泡、物種間的相互作用、氧化還原酶CH-OH組的供體、蛋白泛素化正向調(diào)節(jié)通路，然后我們采用了一個(gè)更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)暮Y選標(biāo)準(zhǔn)，僅僅保留在人類松果體中具有最高豐度的蛋白質(zhì)（1SD；即，具有LFQ Z評(píng)分 > 1的蛋白，見材料與方法），采用第二種方法，我們鑒別出5種富集的GO基因簇（圖1）：碳水化合物催化過程（GPI，TPI1，MDH1，MDH2，PGAM1，ENO1，ENO3，HK1，LDHB，LDHA，PKM，PGK1，ALDOC，ALDOA，GAPDH，PFKM，PGD，ATP5O，GOT1，GOT2，HADHB，ACLY，GLUD1，HADHA），未經(jīng)折疊的蛋白質(zhì)（ERP29，CCT5，HSPA1A，PPIB，CRYAB，HSPA8，HSP90AA1，HSP90AB1，HSPA9，CCT3，CCT2，HSPD1，PDIA6，CCT6A，TCP1，HSP90B1，CALR，CCT7，CANX，PPIA），細(xì)胞膜結(jié)合囊泡（ERP29，ATP6V1B2，P4HB，PPIB，CTSD，RAB7A，PDIA3，YWHAE，HSPA8，HSP90AA1，HSP90AB1，AHCY，HSPA5，ANXA2，CLTC，PDIA6，YWHAZ，HSP90B1，PRDX1，CANX），一氧化碳裂解酶（GLO1，ENO1，ENO2，ENO3，RPS3，GOT1，ALDOC，XRCC6，ALDOA，CA1，ACO2，HADHB，ACLY，HADHA）以及死亡編程調(diào)控的負(fù)調(diào)節(jié)因子（GSTP1，HSPA1A，GLO1，PRDX6，TF，HSPB1，CRYAB，PRDX2，CFL1，NEFL，HSPA9，HSPA5，ANXA5，HSPD1，YWHAZ，HSP90B1，ANXA1，XRCC5）。除了這些富集分析之外，與褪黑激素合成通路相關(guān)的蛋白也被檢測出來，例如ASMT，腎上腺素的受體復(fù)合物，G蛋白，腺苷酸環(huán)化酶以及cAMP依賴的蛋白激酶亞基。有趣的是，沒有任何β-腎上腺素受體或者AANAT，以及褪黑激素的限速酶的合成被檢測出來。

2. 人類松果腺白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析

為了研究與松果腺功能相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，我們采用了來自5個(gè)頂級(jí)GO基因簇的STRING PPI網(wǎng)絡(luò)（圖2）分析了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（PPI），其中3個(gè)不同的高度相互連接的網(wǎng)絡(luò)被進(jìn)行了描述，包括包含伴侶蛋白的TCP1復(fù)合物（CCT）蛋白（CCT2，CCT3，CCT5，CCT6A，CCT7，TCP1），這些蛋白輔助了初期多肽的折疊并需要ATP以幫助其發(fā)揮功能。第二個(gè)網(wǎng)絡(luò)包括熱休克蛋白家族（HSPA5，HSP90B1，HSPA8，HSP90AA1，HSP90AB1，HSPD1，HSPA1A，HSPA9），其主要作用是輔助蛋白質(zhì)的折疊，大多數(shù)應(yīng)激誘導(dǎo)的蛋白在細(xì)胞被暴露于應(yīng)激環(huán)境時(shí)發(fā)揮了重要作用。第三個(gè)網(wǎng)絡(luò)包括細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合的囊泡蛋白（PGK1，PKM，GAPDH，ENO2，ENO1，ENO3，GOT2，GPI，TPI1，PGAM1），這些蛋白在能量代謝過程中的糖酵解和糖質(zhì)新生發(fā)揮重要作用，一些蛋白質(zhì)參與到了諸如碳水化合物催化過程以及一氧化碳裂合酶的催化功能方面（ENO1，ENO2，ENO3，ALDOA，ALDOC，GOT1，HADHA，HADHB，ACLY），細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合的囊泡以及蛋白質(zhì)折疊（ERP29，HSP90AA1，HSP90AB1，PDIA6，PPIB，HSPA8，HSP90B1，CANX），細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合的囊泡以及細(xì)胞程序性死亡的負(fù)調(diào)節(jié)過程（HSPA5，YWHAZ），蛋白質(zhì)折疊的編程性死亡（HSPA1A，CRYAB，HSPA9，HSPD1）或者一氧化碳裂解和負(fù)調(diào)節(jié)編程性死亡（GLO1）。其他小的網(wǎng)絡(luò)包括兩種DNA互作的修復(fù)蛋白質(zhì)XRCC5和XRCC6，其他兩種來自線粒體功能性的蛋白質(zhì)復(fù)合物HADHA和HADHB催化脂肪酸的β氧化過程（我們同樣也檢測了β氧化周期中的其他成員LFQ > 25：ACAA2，ACAD9，ACADM，ACADVL，ACAT1和ECHS1）。最終，過氧化物酶類（PRDX2，PRDX5，和PRDX6）均為過氧化物酶家族成員，該家族是硫基特異性抗氧化酶的保守家族成員，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷。這些因子貢獻(xiàn)于多重信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，一些疾病包括癌癥發(fā)生，炎癥，II型糖尿病，視覺氧化損傷。 

圖1 在人類垂體腺中豐度最高蛋白的生物學(xué)功能

5種與蛋白質(zhì)相關(guān)的GO基因簇，LFQ Z評(píng)分 > 1。GO < 10或GO >1000的蛋白質(zhì)在運(yùn)行富集圖譜方法時(shí)從BINGO結(jié)果中被排除。顏色代表基因簇的基因大小。

3. 檢測蛋白晝夜節(jié)律的表達(dá)譜

有3種計(jì)算方法被用于鑒別晝夜節(jié)律中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)（圖3），由于JTK方法能夠檢測任何日間節(jié)律，而不僅僅是與白天的自然光完全吻合的那些光照，這使得更多受到調(diào)控的蛋白得以被鑒別（N = 782）。BGLS方法（見方法）限制在23到24小時(shí)之間，并鑒別出34種蛋白質(zhì)，最終，bootstrap程序比較了白天和夜間各種蛋白的豐度并鑒別出451種蛋白質(zhì)。通過多種方法鑒別出的蛋白質(zhì)用韋恩圖表示（圖3），我們還做出了以節(jié)律性模式存在的日間（如：AGRN和IGHG2）或者夜間（如：GFAP和CDH2）的蛋白質(zhì)譜（圖S4），其中的蛋白質(zhì)亞群通過Western blot進(jìn)行證實(shí)（e.g.，GFAP，B2M）。

圖2 人類松果腺的核心生物通路

采用STRING軟件對(duì)富集的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)分析。在不同蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)之間的連接線表明蛋白-蛋白互作（PPI）。圖1中的5個(gè)基因簇用虛線表示。

4. 晝夜節(jié)律中蛋白-蛋白互作

受到調(diào)控最多的日間和夜間蛋白質(zhì)PPI網(wǎng)絡(luò)見圖4，15個(gè)蛋白質(zhì)僅僅在日間松果腺中被檢測出來（LRBA，PIK3R4，JAK1，SUN1，PALLD，LMF2，SLC6A4，PDS5B，COG8，PLA2G4A，MT-CYB，CTNNA3，POLR2B，PTP4A2，PRR14L），23個(gè)蛋白質(zhì)僅在夜間被檢測出來（CHKB，CLIP2，NDUFB7，RFK，CLNS1A，SEC61B，B2M，SNW1，SLC30A9，PPM1G，HBSIL，MT-ATP6，HRAS，NFYB，NCAN，F(xiàn)GF2，MBP，NMRAL1，CLIP1，NUP155，IGTA7，F(xiàn)10，GLMAP4）還有33個(gè)蛋白在日間和夜間交替出現(xiàn)。Agrin（AGRN）是最在白天循環(huán)表達(dá)的蛋白質(zhì)中上調(diào)程度最高的，接著是SLC2A1，HRG，然后是ATP1A1，NID1，COL6A1，PRKDC，CUL3，F(xiàn)LNA，SLC25A4以及最終DPP7，LUM，COL6A2，TGM2，MYH9，AP2M1，AP2A1，HPX，NID2，HEXB，DYNC1H1，RPN1，CLTC，XPO1，MT-CO2，ATP6V0A1，PARP1，C3，LAMB1，COL18A1，SF3B3.采用相同的方法，我們發(fā)現(xiàn)兩種蛋白質(zhì)CDH2和UBE2L3在夜間上調(diào)表達(dá)。正如圖4所描繪的，大多數(shù)的上述蛋白質(zhì)（70%）之間相互交聯(lián)形成大的互作網(wǎng)絡(luò)，由44個(gè)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)和58條邊組成，其中71%為日間表達(dá)的蛋白，30%為夜間表達(dá)的蛋白；另外，還有兩個(gè)小的網(wǎng)絡(luò)（C3，HPX，HRG）以及（CUL3，UBE2L3）被檢測出來。CDH2通過FGF2與大的網(wǎng)絡(luò)連接，而其它夜間表達(dá)的蛋白UB2L3與日間表達(dá)的蛋白CUL3連接，其他蛋白質(zhì)在我們的結(jié)構(gòu)中沒有緊密的互作關(guān)系（10個(gè)日間表達(dá)，11個(gè)夜間表達(dá)）。

圖4 在日間和夜間調(diào)控的蛋白質(zhì)間的互作（僅針對(duì)對(duì)照組）

圖中列出日間和夜間受到調(diào)控最多蛋白之間的互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。在日間或者夜間豐度更高的蛋白質(zhì)由紅色或者藍(lán)色表示。而被調(diào)控的蛋白質(zhì)由圓圈表示，在日間或夜間觀察到的蛋白用方塊表示。

5. 自閉癥患者的松果腺

我們之前報(bào)道了患有自閉癥的個(gè)體亞群受到褪黑激素缺乏的困擾，這可能惡化了自閉癥癥狀并增加了之前在自閉癥中報(bào)道的睡眠/節(jié)律問題的風(fēng)險(xiǎn)。本研究中，我們調(diào)查了7位患自閉癥患者松果腺中蛋白質(zhì)的含量并且與在對(duì)照組中鑒別出的蛋白質(zhì)結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)共有101種蛋白在對(duì)照組中豐度更高，其中有80種蛋白甚至未在患自閉癥的個(gè)體中發(fā)現(xiàn)，而78種在患自閉癥的患者中豐度更高。有趣的是，僅有80種蛋白在對(duì)照組中被觀察到，但這些蛋白在自閉癥患者中都未被觀察到。

富集分析表明3種類型的生物學(xué)過程在與對(duì)照組相比的自閉癥組中發(fā)生了改變（圖5；對(duì)于詳細(xì)的PPI見表6）；細(xì)胞學(xué)過程可響應(yīng)細(xì)胞凋亡、與糖類和醇類相關(guān)的催化過程，囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。而大多數(shù)相關(guān)的生物學(xué)通路在自閉癥患者中下調(diào)，有趣的是一些在自閉癥患者中具有較高表達(dá)量的蛋白也參與了上述過程（例如：凋亡的抑制）。 

圖5 松果腺中的自閉癥相關(guān)蛋白

圓圈代表富集的GO條目，包括上調(diào)/下調(diào)表達(dá)的蛋白。連接線代表GO條目間共享的蛋白。

在具有較高豐度的對(duì)照組所檢測到的蛋白中，15種列于SFAR1數(shù)據(jù)庫中，該數(shù)據(jù)庫列出了與自閉癥相關(guān)的基因/蛋白，其中，CNTNAP2，一種與自閉癥相關(guān)的細(xì)胞聯(lián)結(jié)蛋白在18個(gè)對(duì)照組個(gè)體中7個(gè)的松果腺中被檢測出來，但在7個(gè)患自閉癥個(gè)體的松果腺中未被檢測出來。之前采用的度量ASMT酶活性樣本被用于研究松果體樣本，但我們?cè)诒狙芯恐邪l(fā)現(xiàn)，盡管之前報(bào)道了低的ASMT酶活性（圖S7），大多數(shù)患自閉癥和缺乏ASMT酶的個(gè)體具有正常水平的ASMT蛋白，表明ASMT的數(shù)量在這些患者中并未導(dǎo)致酶或者褪黑素的缺乏。

1. 在人體松果腺中可能的能量產(chǎn)生的節(jié)律代謝的影響

我們的富集分析在代謝通路中鑒別出一些與糖酵解、三羧酸循環(huán)、五碳糖磷酸化通路、脂肪酸氧化過程有關(guān)的蛋白。我們觀察到，在這些之中，存在的一些非交替表達(dá)的蛋白包括糖酵解通路中GPI，PGK，PKM，TPI1，ALDOC以及PGAM1，三羧酸循環(huán)中的MDH1，以及來源于脂肪酸β氧化過程中的HADHA和HADHB，更有趣的是，一些豐度較高的代謝過程中的蛋白質(zhì)在夜間表達(dá)上調(diào)包括ENO1，LDHB，6PGD以及ATP5O。烯醇化酶是包括在糖酵解和糖質(zhì)新生過程中的酶類，在ATP供應(yīng)方面發(fā)揮重要作用。與我們結(jié)果一致的是，ENO1之前在夜間大鼠的松果腺中表現(xiàn)為上調(diào)。LDH為包括在NADH到NAD+循環(huán)中無氧糖酵解過程中的末端轉(zhuǎn)移酶，6PGD包括在產(chǎn)生NADPH的磷酸戊糖通路過程中，其功能是在應(yīng)激條件下對(duì)維持氧化還原作用的平衡，ATP5O是在線粒體呼吸鏈中與ATP產(chǎn)生相關(guān)的線粒體ATP合酶。在此通路中，之前的研究表明夜間較高水平的線粒體呼吸鏈酶水平，但是我們也鑒別出幾種糖酵解酶類，這些酶類包括PFKM，GAPDH和HK1，它們?cè)诎滋毂磉_(dá)量上調(diào)，表明這些基因可能會(huì)影響白天松果腺中幾種代謝通路的活性?？傊@些結(jié)果表明在松果腺中的能量產(chǎn)生在白天和夜間是協(xié)調(diào)進(jìn)行的。其中一些蛋白的夜間上調(diào)表明夜間ATP產(chǎn)生的增加，這些蛋白可能對(duì)于松果腺中褪黑激素的夜間合成是需要的。

2. 松果腺作為抗氧化和伴侶蛋白的來源

有大量的證據(jù)表明松果腺在抗氧化和炎癥方面的作用，褪黑素本身被報(bào)道是抗炎和抗氧化的制劑。數(shù)據(jù)分析同樣也顯示了酶的存在，這些酶類在保護(hù)細(xì)胞免受ROS的破壞作用方面起到作用，比如超氧化歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶，以及過氧化物酶。

幾種不同的在糖酵解過程中也具有抗氧化活性，包括6PGDH，NADPH，HKI，包括在NADPH抗氧化劑產(chǎn)生過程中的GOTs，以及GOT1，這種物質(zhì)被報(bào)道參與了抗氧化代謝過程，這些酶類阻止了ROS的過度產(chǎn)生，并阻礙了細(xì)胞死亡。

我們鑒別出幾種急性期蛋白（APPs），這些蛋白為響應(yīng)炎性反應(yīng)改變了其在血清中的濃度，包括結(jié)合珠蛋白，血液結(jié)合素，2α-巨球蛋白，α-1-抗凝乳蛋白酶，α-1-抗胰蛋白酶以及血球蛋白相關(guān)的蛋白。我們并沒有假設(shè)松果腺細(xì)胞本身分泌出這些因子，最有可能的情況是松果腺中的“腸道松果腺細(xì)胞”是這些因素的來源，但是，不論哪種類型的細(xì)胞可產(chǎn)生APPs，我們的數(shù)據(jù)指出松果腺的作用是響應(yīng)炎癥反應(yīng)的急性期“分泌組”的來源。我們所檢測的胃促胰酶以及組織蛋白酶G表明肥大細(xì)胞在炎癥反應(yīng)和宿主抵抗方面發(fā)揮了重要作用，并且被報(bào)道在松果體鈣化增加的過程中表現(xiàn)出上升。

我們也鑒別出了幾種伴侶蛋白，諸如在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中大量表達(dá)的蛋白質(zhì)二硫異構(gòu)酶（PDI）家族，以及熱休克蛋白（HSPs），這種蛋白在應(yīng)激發(fā)生過程中作為一種分子伴侶。

大多數(shù)PDIs具有氧化還原酶的活性和功能作為分子伴侶對(duì)于正確的蛋白質(zhì)折疊通過催化蛋白質(zhì)的形成、裂解以及二硫鍵在未折疊或者錯(cuò)誤折疊的蛋白中的重新組合。例如，ERP29在處理ER內(nèi)部的分泌蛋白中起到重要作用；PDIA3和PDIA6介導(dǎo)蛋白質(zhì)的折疊并且作為一個(gè)分子伴侶阻止了蛋白質(zhì)的聚合。在與CANX的互作過程中，同樣人類松果腺中豐度較高的蛋白，調(diào)節(jié)了新合成的糖蛋白的折疊。

人類松果腺中HSPs中的主要成員包括HSPA1A，HSPA5，HSPA8，HSPA9，HSPB1，HSPD1，HSP90B1，HSP90AA1以及HSP90AB1。這些蛋白最可能在最初的多肽鏈合成過程中對(duì)應(yīng)激反應(yīng)提供保護(hù)，主要的方面是適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)折疊方式以及消除錯(cuò)誤折疊的蛋白。

除了PDI和HSPs，我們也檢測除了抗氧化酶類中的一類過氧化物酶家族的成員（PRDX5和PRDX6），這兩種蛋白在應(yīng)答上升的ROS水平的過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用，還有一類應(yīng)答的分子伴侶蛋白，被稱為CCT；包含分子伴侶的無尾復(fù)合物多態(tài)1（TCP1）包括CCT2，CCT3，CCT5，CCT7，CCT6A以及TCP1。這些蛋白輔助了鄰近蛋白的折疊并需要ATP輔助其發(fā)揮作用。

有趣的是，幾種蛋白包括在蛋白折疊和伴侶蛋白功能方面的蛋白在人類松果腺中表現(xiàn)出顯著的晝夜節(jié)律，例如，HK1，GLO1，PDIA6，TF以及HSPB1在日間表現(xiàn)出上調(diào)，而PRDX5和PRDX6在夜間上調(diào)。這些結(jié)果表明人體的松果腺對(duì)抗氧化應(yīng)激和蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊方面具有抗氧化以及分子伴侶機(jī)制，一些生物通路中的成員可能表現(xiàn)出晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)，這可能對(duì)調(diào)控松果腺的動(dòng)態(tài)平衡起到作用，而不同的抗氧化物在日間達(dá)到峰值，其他的激素，如褪黑激素，在夜間達(dá)到峰值。

3. 調(diào)節(jié)褪黑激素在人類松果腺中合成的蛋白

在松果腺中發(fā)現(xiàn)的最為重要的蛋白中，AANAT和ASMT（HIOMT）是兩種在褪黑素合成通路上最后的兩種酶。有趣的是無論在我們的研究中，還是最近發(fā)表的人體松果體蛋白組研究中，都沒有發(fā)現(xiàn)與之對(duì)應(yīng)的多肽片段。ASMT，從另一方面來講以及ASMTL，一種AMST樣蛋白，比ASMT具有較寬的表達(dá)譜，在兩個(gè)研究中都被鑒別出來。不僅如此，色氨酸羥化酶1（TPH1）以及芳香化酶脫羧酶（AADC），催化從色氨酸到5-羥色胺重要反應(yīng)步驟中的酶類也被檢測到，因此，所有的來自色氨酸合成褪黑激素的必要組分在人類松果腺蛋白組數(shù)據(jù)庫中被發(fā)現(xiàn)，除了AANAT。一個(gè)缺乏AANAT的可能的原因是其半衰期非常短，僅有8分鐘（在嚙齒類動(dòng)物中），其穩(wěn)定性通過蘇氨酸31-磷酸化以及14-3-3結(jié)合而達(dá)到。但是，AANAT酶的活性以及褪黑激素的含量可通過生化方法進(jìn)行度量，并且在人類中夜間會(huì)升高，到目前為止，對(duì)于此發(fā)現(xiàn)沒有任何解釋可以提供。除了對(duì)于一般生化過程廣泛存在的蛋白之外，14-3-3蛋白被認(rèn)為與AANAT是雜合二聚體因此對(duì)于其活性和穩(wěn)定性都是必要的。在當(dāng)前的人類蛋白組研究和以往發(fā)表的數(shù)據(jù)集中，對(duì)于14-3-3蛋白最常見的形式是在松果腺中。值得注意的是，我們之前發(fā)現(xiàn)ASMT酶活性在晝夜間不斷循環(huán)。但在本篇文章中，ASMT蛋白的水平在晝夜間保持穩(wěn)定，這表明這些酶活性的調(diào)節(jié)不是由不同的蛋白質(zhì)水平造成的，最有可能是由其它轉(zhuǎn)錄后機(jī)制比如磷酸化或者二聚化造成的，有趣的是，該機(jī)制可能在患自閉癥群體中調(diào)節(jié)失常。

除了需要合成褪黑激素的酶類之外，我們檢測到很多褪黑激素合成中關(guān)鍵組分的存在。II型PKAα和β在松果體細(xì)胞中占主導(dǎo)的現(xiàn)象已經(jīng)在牛和大鼠中得到證實(shí)。這里所提供的人類松果腺蛋白組數(shù)據(jù)證實(shí)了PKA調(diào)控II型亞基α和β在人類松果體切片中也占主導(dǎo)作用，這進(jìn)一步受到AKAP亞型8樣受體，9,10,11,12和13亞型所支持，轉(zhuǎn)錄后共激活因子如CRTC-1，CAP-1，CAP-2，β-抑制蛋白，光傳感因子，光傳感因子樣蛋白以及光傳感樣因子蛋白-3，以及該通路上的其他組分。

與上述cAMP依賴的通路平行的通路中，松果腺中的腎上腺素受體可被PKC所激活，有絲分裂原蛋白激酶通路中很多具有差異的，之前描述的組分在這里被鑒別出來。最終，所有蛋白質(zhì)磷酸化通路導(dǎo)致當(dāng)前研究中磷酸化蛋白調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)磷酸化酶受到調(diào)控，被稱為PP-1a，包括轉(zhuǎn)錄因子CREB去磷酸化過程中蘇氨酸-133磷酸化過程。

夜間松果腺合成褪黑激素的的機(jī)制獲得了很好的記錄，但是在日間，該機(jī)制阻止的褪黑激素的水平并未被描述。我們假設(shè)在日間來自副交感神經(jīng)支配的乙酰膽堿（ACh）信號(hào)阻止了AANAT和終末褪黑激素產(chǎn)生的日間活性，也有證據(jù)表明cAMP-獨(dú)立的谷氨酸鹽對(duì)于褪黑激素產(chǎn)生的抑制效果。在日間，Ach激活褪黑激素細(xì)胞中煙堿養(yǎng)膽堿受體（nAChR）可導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化，具有后續(xù)細(xì)胞間Ca2+增加的開放性電壓門控的Ca2+通道（VGCC），能夠最終的激發(fā)谷氨酸鹽的釋放引發(fā)自分泌谷氨酸鹽信號(hào)。結(jié)合mGluR3可降低cAMP的水平導(dǎo)致AANAT活性和褪黑激素合成的下降，但是，大多數(shù)此類研究在嚙齒動(dòng)物中進(jìn)行，因此該機(jī)制對(duì)松果腺褪黑激素合成的影響在人類中仍然有待確定。

本篇文章中，我們觀察到AGRN是一種在人類松果腺中高度循環(huán)的蛋白，主要在日間出現(xiàn)。AGRN是一種硫化肝素蛋白多糖最初是由于其引發(fā)ACh受體（AChR）的聚合在神經(jīng)肌肉連接處（NMJ）被發(fā)現(xiàn)，AGRN在各種基底組織中分泌包括松果腺或者神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜上。正如在大鼠松果腺中所觀察到的，我們也檢測到了人類松果腺中的AGRN受體，以及松果腺中的Na+/K+-ATP酶離子泵（ATP1A3），但是卻缺乏明顯的節(jié)律調(diào)節(jié)特征。該受體在構(gòu)建膜神經(jīng)元靜息電位的過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用，AGRN阻止了ATP1A3離子泵的活性并導(dǎo)致了細(xì)胞膜的極化以及增加潛在的活性頻率。

總之，基于我們的觀察，我們能夠推測出一個(gè)AGRN褪黑激素通路，主要在白天表達(dá)，和Ach一起與其受體ATP1A3互作，作為一種日間信號(hào)終結(jié)NE的夜間節(jié)律并且加快日夜轉(zhuǎn)換的節(jié)律。考慮到該過程的復(fù)雜性以及各種參與其中的蛋白，我們不能確定哪種精確的機(jī)制發(fā)生以及哪種特定的通路包括在內(nèi)。

4. 自閉癥人體松果腺的作用

我們分析了7個(gè)自閉癥患者的松果腺。自閉癥在臨床和遺傳水平上是各種各樣的，因此相對(duì)少量的人大體上排除了我們發(fā)現(xiàn)中任何的泛泛而論，然而，褪黑素的產(chǎn)生在大部分的患自閉癥的病人中缺乏，常被報(bào)道有睡眠問題。我們之前報(bào)道了對(duì)照組中第10百分位數(shù)的閾值，大量的（74%）自閉癥病人顯示出下降的血小板ASMT活性，但是該機(jī)制仍然未知。我們的研究還顯示出褪黑激素是具有高度遺傳性的，但是與松果腺的大小無關(guān)聯(lián)性。對(duì)于患者群體，我們可鑒別出惡性的ASMT突變功能上與ASMT活性和低褪黑素水平缺失有關(guān)，但是這些罕見的突變不能解釋相對(duì)大比例個(gè)體的表現(xiàn)，本篇文章中，我們實(shí)驗(yàn)表明具有低ASMT活性的自閉癥個(gè)體與對(duì)照組相比表現(xiàn)出相似的蛋白水平，其低水平的ASMT酶活性因此并非出現(xiàn)低水平ASMT蛋白的原因，但是在白天ASMT活性表現(xiàn)出生理學(xué)的下降（盡管ASMT蛋白長期以來保持穩(wěn)定），因此我們假設(shè)白天在對(duì)照組中ASMT活性降低的機(jī)制在夜間病患中表現(xiàn)異常導(dǎo)致了褪黑激素的缺乏，而進(jìn)一步的工作可鑒別出ASMT酶活性的調(diào)節(jié)可能會(huì)提供給我們一些在自閉癥患者中褪黑激素缺乏的機(jī)制。

我們的蛋白組分析主要目標(biāo)是一些代謝酶類、抗氧化物、以及伴侶蛋白質(zhì)分子富集在人類的松果腺中，其中一些蛋白質(zhì)發(fā)揮了節(jié)律調(diào)節(jié)作用，表明與這些蛋白相關(guān)的松果腺中適應(yīng)白天和夜間生理學(xué)功能蛋白的生物學(xué)功能。我們的研究同樣也提供了自閉癥患者松果腺蛋白組的特征，表明在病人群體中ASMT的缺乏通常是由缺乏ASMT蛋白所導(dǎo)致的，而我們進(jìn)一步的工作是去了解ASMT活性在白天的下調(diào)在夜間異?；钴S，并導(dǎo)致這類人群中嚴(yán)重的褪黑激素缺乏的原因。較大的樣本含量也提供了年齡對(duì)于睡眠的影響以及對(duì)于死亡和蛋白組潛在影響的清晰圖景，而一個(gè)對(duì)于蛋白質(zhì)伴侶的分析以及潛在的轉(zhuǎn)錄后修飾的分析可能也對(duì)理解人類松果腺提供了重要的線索。