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1. 前言

A.線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的重要性

線粒體是真核細(xì)胞中高度特化的細(xì)胞器，具有重要的生物學(xué)功能。線粒體功能障礙與許多疾病有關(guān)，包括癌癥、糖尿病、衰老、肌肉營養(yǎng)不良、帕金森病、阿爾茨海默病和亨廷頓病。在過去的幾十年里，研究為各種癌癥中線粒體功能的改變提供了新的前沿，以識別線粒體相關(guān)的信號通路，從而深入了解線粒體在腫瘤發(fā)生中的機(jī)制，確定用于診斷和預(yù)后評估的生物標(biāo)志物，并發(fā)現(xiàn)有效治療的治療靶點。除了細(xì)胞核(細(xì)胞的chomosomal DNA)，線粒體是唯一含有獨立線粒體DNA (mtDNA)的細(xì)胞器。mtDNA編碼37個基因，包括2個核糖體RNA (rRNAs)， 13個線粒體肽亞基和22個轉(zhuǎn)運RNA。大量證據(jù)表明mtDNA對腫瘤進(jìn)展易感性和腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞功能的影響。線粒體有外膜、內(nèi)膜、膜間空間和基質(zhì)四種結(jié)構(gòu)間隔。多種重要的生物過程(BPs)發(fā)生在線粒體的不同區(qū)域，包括氨基酸代謝、丙酮酸氧化、細(xì)胞死亡敏感性、脂肪酸氧化、Krebs循環(huán)、線粒體活性氧(mtROS)的產(chǎn)生、類固醇代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和三磷酸腺苷(ATP)的產(chǎn)生。之前的一項基于質(zhì)譜(MS)的線粒體蛋白組學(xué)研究使用了體內(nèi)pull-down酶聯(lián)標(biāo)記的方法分離了人類線粒體亞區(qū)，發(fā)現(xiàn)了495個定位在線粒體基質(zhì)中的蛋白質(zhì)。

癌癥中線粒體蛋白及其翻譯后修飾(PTMs)的鑒定可能為了解是什么導(dǎo)致癌細(xì)胞失控提供有價值的信息。自1998年首次用MS分析人類胎盤線粒體蛋白質(zhì)組以來，亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)包括線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)取得了很大的成就。目前對mossPhyscomitrella患者的線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究提醒人們要發(fā)展線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)，從系統(tǒng)的角度了解蛋白質(zhì)庫存、修飾和功能改變的進(jìn)化差異。概述線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的現(xiàn)狀將有助于了解線粒體蛋白質(zhì)組的作用，準(zhǔn)確評估線粒體蛋白譜，線粒體蛋白相關(guān)信號通路網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)診斷和治療生物標(biāo)志物，并探索線粒體癌的分子機(jī)制。

B. 人類卵巢癌(OCs)的定量線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的病理生理學(xué)基礎(chǔ)

婦科癌癥起源于卵巢、陰道、子宮頸和子宮。OC是一種常見的致命性癌癥，全球女性死亡率最高。其主要危險因素包括年齡較大、基因突變、家族史、化學(xué)物質(zhì)(苯)、生育史、節(jié)育、不孕或生育治療、子宮內(nèi)膜異位癥、乳腺癌(陽性BRCA1或BRCA2基因)和肥胖。OC的確切分子機(jī)制尚不清楚。許多檢查已經(jīng)被開發(fā)用來幫助診斷OC，包括血液測試(碳水化合物抗原125)，成像測試(超聲波、計算機(jī)體層攝影或磁共振成像)、腹腔鏡、結(jié)腸鏡檢查、腹部液體抽吸和活組織檢查。然而，提高OCs的早期診斷率仍有非常重要的臨床意義，因為OC患者的預(yù)后取決于他們的早期診斷，有助于5年總生存率提高94%。因此，發(fā)現(xiàn)新的腫瘤生物標(biāo)志物以提高OC的早期診斷率。

既往研究表明，線粒體功能障礙與OC密切相關(guān)。線粒體負(fù)責(zé)mtDNA突變、能量代謝、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、動力學(xué)、線粒體-細(xì)胞核互動、鈣超載、耐藥性、自噬和免疫過程(圖1)。掃描電鏡觀察到OC細(xì)胞胞漿內(nèi)線粒體形態(tài)的改變，線粒體松散，有蟲蛀的外觀。此外，失調(diào)的線粒體動力學(xué)在OC中發(fā)揮關(guān)鍵作用，例如，改變線粒體裂變動力學(xué)影響上皮OC細(xì)胞亞群的表型。此外，線粒體在OC中是多功能的細(xì)胞器，包括能量代謝、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、線粒體自噬、耐藥性、免疫過程，以及在腫瘤微環(huán)境中與其他細(xì)胞器互動或代謝靈活性。特別是，一些線粒體蛋白已被報道為治療靶點，用于抑制OC中的線粒體相關(guān)通路，如Bcl‐2、p53和galectin‐3，可見線粒體功能障礙與OC發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。然而，分子機(jī)制、新的早期診斷生物標(biāo)志物和新的治療靶點仍然有限，有必要發(fā)展基于MS的線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)(比較線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)及其PTMs)，以有效管理人類OCs。

圖1 線粒體在卵巢癌中的重要作用

一種基本觀點認(rèn)為，OC起源于正常卵巢，線粒體在卵巢癌發(fā)生中起重要作用。因此，定量線粒體蛋白質(zhì)組的變化將闡明OC中任何線粒體介導(dǎo)的病理生理變化。多種定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法已被開發(fā)用于分離線粒體、定量線粒體蛋白質(zhì)和定量線粒體磷酸化蛋白，包括細(xì)胞培養(yǎng)中氨基酸的穩(wěn)定同位素標(biāo)記(SILAC)、同位素編碼親和標(biāo)記(ICAT)，等壓標(biāo)簽的相對和絕對定量(iTRAQ)、串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽(TMT)和label-free法(圖2)。

圖2 基于質(zhì)譜的線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)策略在人類卵巢癌中的應(yīng)用

本文將總結(jié)人類OC中基于MS的線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)，包括定量線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的再現(xiàn)性，線粒體蛋白質(zhì)組的定量的參考圖，人類OC與對照組織線粒體蛋白組的差異，線粒體磷酸化蛋白質(zhì)組，線粒體多組學(xué)數(shù)據(jù)的綜合分析(線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)、整個組織的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù))，分子網(wǎng)絡(luò)變化，蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)、生物標(biāo)志物和治療靶點。此外，僅監(jiān)測線粒體蛋白質(zhì)組成的改變是不夠的；鑒定它們的PTMs和線粒體蛋白形態(tài)是必要的。線粒體多組學(xué)數(shù)據(jù)的整合將極大地促進(jìn)OC的研究。此外，參與鑒定線粒體蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)和分子通路可為OC的系統(tǒng)生物學(xué)研究提供基礎(chǔ)。

2. 線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)方法

A.OCs線粒體樣本的制備

高純度的線粒體樣品是線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)分析的關(guān)鍵問題。許多方法被用于從細(xì)胞或組織中分離和純化線粒體樣本，包括自由流動電泳、試劑盒方法、差速離心、使用蔗糖、Nycodenz、Percoll?或甲泛葡胺的密度梯度離心。就分離的線粒體的濃度、活性和污染而言，在實際應(yīng)用中，每種線粒體分離方法都有其優(yōu)缺點。利用pH梯度樣品注射的循環(huán)自由流動等電聚焦技術(shù)從兔肝中分離線粒體。膜電位測量和蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，循環(huán)自由流動等電聚焦是制備完整線粒體的有效方法，提供了高度純化的線粒體。然而，由于特殊設(shè)備的限制和低產(chǎn)量，自由流動電泳技術(shù)在線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究中面臨挑戰(zhàn)。試劑盒方法產(chǎn)生的線粒體蛋白濃度較高，操作簡單、快速，然而提取線粒體的工具很昂貴。差速離心往往導(dǎo)致分離的線粒體純度較低，有必要優(yōu)化實驗條件。密度梯度離心在高產(chǎn)量、高純度和功能線粒體方面具有巨大的優(yōu)勢。差速離心和不連續(xù)滲透密度的密度梯度離心相結(jié)合，已成功地用于從大鼠前腦和大腦中制備線粒體樣本，這種方法非常適合從小組織樣本中分離線粒體。因此，聯(lián)合方法是可靠的，以獲得高純度的線粒體組分，用于線粒體蛋白質(zhì)組研究。

幾個研究小組已經(jīng)使用不同的方法從OC細(xì)胞和組織中分離出線粒體樣本。對于OC細(xì)胞模型，Dai等人率先在鉑敏感OC細(xì)胞(SKOV3和A2780)和鉑耐藥OC細(xì)胞(SKOV3/CDDP, SKOV3/CBP, A2780/CDDP,A2780/CBP)之間進(jìn)行了直接的線粒體蛋白質(zhì)組比較。Chen等人在Dai等人的基礎(chǔ)上改進(jìn)了線粒體分離程序，即他們使用重復(fù)差速離心和不連續(xù)密度梯度離心從OC細(xì)胞中獲得高質(zhì)量的線粒體部分。簡單地說，6個細(xì)胞系(SKOV3、A2780、SKOV3/CDDP、SKOV3/CBP、A2780/CDDP、A2780/CBP)離心(800g, 5分鐘, 4℃)，洗滌(冰‐冷磷酸鹽緩沖鹽[PBS])三次。細(xì)胞顆粒重懸于10容量勻漿緩沖液(70 mM蔗糖、0.5 mM乙二醇雙(2‐氨基乙醚)四乙酸(EGTA)、1.5 mM MgCl2、210 mM甘露醇、10 mM氯化鉀(KCl)、1 mM乙二胺四乙酸(EDTA)、蛋白酶抑制劑、50 mM Tris‐HCl、pH7.4)中，并用玻璃脈沖均化器均化。將OC細(xì)胞勻漿離心(1000 g, 10 min, 4℃)，勻漿緩沖液洗滌2次。將上清液離心(10000 g, 3次, 4℃)，收集粗線粒體片段。通過密度梯度離心(52000g, 90 min, 4℃)與Nycodenz聯(lián)合對線粒體樣本進(jìn)行純化，包括5個從底部到頂部的Nycodenz密度梯度34%、30%、25%、23%、20% v/v (5/8/12/8/3 mL)。離心后，在25-30%部分得到線粒體片段。用5體積勻漿緩沖液稀釋線粒體部分，離心(15000 g, 20 min,4℃)后獲得純化的線粒體制備品。對于人類OC組織模型，Zhan等人首次在相對于對照組織(常見良性婦科疾病)的上皮OC組織中鑒定了線粒體表達(dá)蛋白(mtEPs)。線粒體分離緩沖液含100 mM KCl, 70 mM蔗糖，210 mM甘露醇，1 mM EDTA, 0.1 mMEGTA, 1 mM苯甲磺酰氟蛋白酶抑制劑，2 mM原釩酸鈉(V)， 50 mM Tris‐HCl, 0.2%牛血清白蛋白，pH 7.4。將1.5 g上皮OC組織完全切碎成1 立方毫米的片，用含0.2 mg/mL Nagarse的13.5 mL線粒體分離緩沖液勻漿(2 min, 4℃)。下面的從OC細(xì)胞中制備線粒體的過程與上述步驟相似。然而，用上述方法很難從對照卵巢組織中分離出良好的線粒體。若要制備對照卵巢組織線粒體，需對上述方案進(jìn)行修改：對照卵巢組織需在8 mL緩沖液(PBS溶液中加入0.05%胰蛋白酶/20 mM EDTA)中充分切碎，消化(30 min, 室溫)，然后勻漿。使用Nycodenz分為六個密度梯度，在一個管中從下到上梯度為38%，34%，30%，25%，23%和20% v/v(8/5/8/12/8/3 mL)，得到的線粒體在梯度25-30%到梯度34-38%之間。另一種方案與OC組織的方案相同。

一些研究人員還使用商業(yè)線粒體分離試劑盒(Thermo FisherScientific, Rockford, IL)從OC細(xì)胞(A2780‐和A2780‐CP20)分離和純化線粒體。Thermo Fisher Scientific用于培養(yǎng)的細(xì)胞的線粒體分離試劑盒(線粒體分離試劑A、B和C)能夠從胞質(zhì)組分中分離完整的線粒體。線粒體分離試劑盒是一種使用商業(yè)試劑一次處理多個樣品的獨特方案，并依靠差速離心機(jī)分離線粒體和使用臺式微離心機(jī)分離細(xì)胞質(zhì)組分。2×107個細(xì)胞被離心(850g, 2 min, 4℃)。用線粒體分離試劑A重懸細(xì)胞微球，并用冰孵育2 min，再加入10 μL線粒體分離試劑B，靜置冷凍孵育5 min。加入800 μL線粒體分離試劑C體積，離心(700g, 10min, 4℃)，上清再離心(12000g, 5min, 4℃)。再將500 μL的線粒體分離試劑C加入沉淀物中，離心(12000 g, 5 min)，丟棄上清以獲得線粒體片段。

B. 分析方法

基于質(zhì)譜的線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)由于其靈敏度和速度，已廣泛應(yīng)用于線粒體蛋白質(zhì)組的大規(guī)模鑒定和定量。例如，mtDNA表達(dá)的維持對細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)很重要，基于MS的線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)已用于分析應(yīng)激誘導(dǎo)的人類線粒體蛋白質(zhì)的變化，以顯示線粒體轉(zhuǎn)錄拯救因子1，可防止線粒體轉(zhuǎn)錄本丟失，在細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時升高?；诙S液相色譜(2DLC)串聯(lián)質(zhì)譜分析(MS/MS)檢測成年大鼠抑郁模型中線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)，發(fā)現(xiàn)丙咪嗪治療后九個線粒體蛋白質(zhì)(mtDEPs)差異表達(dá)，表明線粒體可能在治療人類疾病中是一個至關(guān)重要的藥物治療靶點。液相色譜常與質(zhì)譜聯(lián)用，為多維蛋白鑒定技術(shù)(MudPIT)提供了重要發(fā)展。為了增加肽的數(shù)量和肽分離的能力，MudPIT集成了強(qiáng)陽離子交換(SCX)預(yù)分選和反相高效液相分離。MudPIT采用序列蛋白水解和多重提取的方法來增加肽的鑒定，它規(guī)避了許多問題，包括強(qiáng)疏水性肽、PTMs、極端等電點和跨膜蛋白質(zhì)聚集的傾向?；谫|(zhì)譜的線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)可以通過label-free和穩(wěn)定同位素標(biāo)記策略來定量蛋白質(zhì)。

基于MS的label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)是基于質(zhì)譜信號強(qiáng)度或肽譜計數(shù)。樣品制備簡單，不需要昂貴的同位素標(biāo)記。幾乎所有種類的蛋白質(zhì)都可以用基于MS的label-free蛋白質(zhì)組學(xué)分離和識別。當(dāng)研究大的和全局的蛋白質(zhì)時，相對定量信息可以同時比較多個生物樣本。然而，對液相色譜分離和label-free質(zhì)譜/質(zhì)譜鑒定的穩(wěn)定性和再現(xiàn)性的要求是嚴(yán)格的，需要充分的技術(shù)重復(fù)來驗證結(jié)果的可靠性。每個樣品單獨分析，導(dǎo)致低通量。此外，與穩(wěn)定同位素標(biāo)記策略相比，有許多因素影響label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性。一些研究人員已經(jīng)使用優(yōu)化的label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)來分析組織特異性線粒體蛋白質(zhì)組。例如，label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)在線粒體蛋白質(zhì)組分析中得到了優(yōu)化和改進(jìn)，包括使用多種酶消化過濾輔助樣品制備方案，而不是使用單一蛋白酶的標(biāo)準(zhǔn)過濾輔助樣品制備方案，從而提高了序列的覆蓋率，顯著提高了蛋白質(zhì)的鑒定總數(shù)。FreeQuant的開發(fā)結(jié)合了無標(biāo)簽定量和功能分析，以充分利用MS為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)。新策略在準(zhǔn)確評價異構(gòu)體豐度和有效完成復(fù)雜蛋白的功能分析方面具有很大的優(yōu)勢。FreeQuant定量分析方法在人心臟、小鼠心臟和小鼠肝臟線粒體蛋白質(zhì)組的分析中表現(xiàn)出較好的性能和可用性。

以穩(wěn)定同位素標(biāo)記為基礎(chǔ)的線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)主要包括ICAT、SILAC、iTRAQ或TMT，外加基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間‐MS (MALDI-TOF-MS)或者LC-MS/MS。不同樣品中的蛋白質(zhì)用含氨基酸殘基的化學(xué)等效微分質(zhì)量標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記，并通過穩(wěn)定同位素標(biāo)記策略進(jìn)行定量比較分析。這些方法，如ICAT、SILAC、iTRAQ或TMT，各有優(yōu)缺點。ICAT可以通過比較含半胱氨酸肽的同位素譜的LC-MS峰面積來量化最多兩個樣品。ICAT可以簡化復(fù)雜的胰酶肽段混合物，只標(biāo)記含半胱氨酸的肽。然而，沒有半胱氨酸的蛋白質(zhì)和多肽不能用這種方法定量，并且在ICAT技術(shù)中會丟失一些PTMs位點。iTRAQ是一種高通量、短周期技術(shù)，可使用多路等壓標(biāo)記試劑對2-8個樣品進(jìn)行標(biāo)記。定量信息是通過比較4個MS/MS報告離子(m/z, 114至117)或8個MS/MS報告離子(m/z, 113-119和121)的強(qiáng)度來獲得的。然而，iTRAQ的局限性在于，隨著樣本數(shù)量的增加，量化信息會逐漸減少，系統(tǒng)誤差會逐步增加。與基于SILAC標(biāo)簽的定量相比，iTRAQ在定量信息的豐度和準(zhǔn)確性方面相對較低。TMT方法類似于iTRAQ方法。SILAC在細(xì)胞培養(yǎng)中標(biāo)注氨基酸，最多可以比較兩到三個樣本。細(xì)胞在相同條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含有重鏈同位素氨基酸(如L‐精氨酸[13C6, 15N4]和L‐賴氨酸[13C6, 15N2])或輕鏈同位素氨基酸。因此，細(xì)胞中新合成的蛋白質(zhì)經(jīng)過5 ~ 6代培養(yǎng)后被同位素標(biāo)記，酶解后，用質(zhì)譜將輕鏈標(biāo)記和重鏈標(biāo)記的肽段清晰區(qū)分，進(jìn)行定量分析。在樣品制備和處理過程中，以SILAC為基礎(chǔ)的定量方法最不容易受到樣品間電位變化的影響，從而有助于減少系統(tǒng)誤差，提高定量精度。此外，這種多路復(fù)用策略增加了MS通量。然而，SILAC僅適用于細(xì)胞培養(yǎng)樣品，以限制其在癌癥組織中基于MS的線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用。

Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)和大多數(shù)同位素標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)都有潛在的局限性，如樣品制備的復(fù)雜性、增加的時間、有限的線性動態(tài)范圍和增加的質(zhì)譜復(fù)雜性。此外，同位素標(biāo)記策略也受到標(biāo)記試劑昂貴的影響。在這里，我們總結(jié)了不同的穩(wěn)定同位素標(biāo)記方法和label-free策略的優(yōu)缺點(表1)。

表1 幾種定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的優(yōu)缺點

幾個研究團(tuán)隊已經(jīng)使用不同的基于質(zhì)譜的線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)方法來研究人類OCs的線粒體蛋白質(zhì)組。Dai等人、Chappell等人和Chen等人對人類OC細(xì)胞鉑耐藥細(xì)胞(SKOV3/CBP、SKOV3/CDDP、A2780/CDDP和A2780/CBP)，順鉑 (CDDP)耐藥細(xì)胞(A2780‐CP20)和紫杉醇耐藥細(xì)胞(SKOV3‐TR和A2780‐TR)中分別進(jìn)行了線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究。對于人類OC細(xì)胞及其鉑耐藥細(xì)胞的線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)，在凝膠電泳中使用2‐DE和2D差異(DIGE)來分離和量化線粒體蛋白。對于DIGE，每個線粒體蛋白樣品在緩沖液(7 M尿素，40 mM Tris, 4% w/v CHAPS, 2 M硫脲，pH 8.0)中使用Cy3或Cy5染料進(jìn)行標(biāo)記。將每個樣品等量混合，用Cy2染料(內(nèi)標(biāo))標(biāo)記。每個來自人類OC細(xì)胞系的線粒體蛋白樣本，包括化療敏感細(xì)胞(SKOV3和A2780)和化療耐藥細(xì)胞系(SKOV3/CBP、SKOV3/CDDP、A2780/CDDP和A2780 /CBP)分別用2‐DE凝膠分離。利用DeCyder v.5.0軟件對2‐DE凝膠的熒光圖像進(jìn)行定量和統(tǒng)計，獲取相對蛋白水平。感興趣的蛋白點從2‐DE凝膠中切割下來，用胰蛋白酶進(jìn)行消化，用MALDI‐MS對純化的胰酶肽段進(jìn)行鑒定。但也要考慮到基于2D凝膠的方法的局限性，如線粒體疏水性蛋白檢測困難，動態(tài)范圍有限，以及任何具有極端分子量和pI值的蛋白。因此，LC-MS可以表征和量化OC細(xì)胞及其CDDP耐藥細(xì)胞的線粒體蛋白。胰酶肽段用nanoflow LC (Easy‐nLC)耦合LTQ‐Orbitrap Velos MS (Thermo Fisher Scientific)進(jìn)行分析。用于人類OC細(xì)胞及其紫杉醇耐藥細(xì)胞的線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究，一種LC雜交線性離子阱傅里葉變換離子回旋共振(FT‐ICR)質(zhì)譜也用于表征和量化線粒體蛋白。在這種方法中，賴氨酸殘基的e-氨基被胍化以阻止多個標(biāo)簽的加入。實驗組用2H6‐乙酸酐標(biāo)記SKOV3‐TR和A2780‐TR細(xì)胞的線粒體蛋白，對照組用1H6‐乙酸酐標(biāo)記SKOV3和A2780細(xì)胞的線粒體蛋白。使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離這些細(xì)胞系(SKOV3、A2780、SKOV3‐TR和A2780‐TR)的線粒體蛋白懸液。通過檢查MALDI‐MS光譜，可以對用不同同位素標(biāo)記的肽段進(jìn)行相對定量。近期，Zhan等人對人類OC與對照卵巢組織進(jìn)行了iTRAQ定量線粒體蛋白組學(xué)研究。在這種方法中，上皮細(xì)胞OC和對照組織線粒體蛋白的肽段用6‐plex iTRAQ試劑標(biāo)記。標(biāo)記的肽段混合物經(jīng)過SCX預(yù)分餾，然后LC‐MS/MS分析鑒定了5115個mtep。

綜上所述，線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的分離和定量方法各不相同，各有優(yōu)缺點。根據(jù)實驗設(shè)計和目的，在給定的線粒體蛋白質(zhì)組分析中推薦一種組合的、優(yōu)化的多方法策略。

3. 人類OCs線粒體蛋白質(zhì)組的概況

A. 定量線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)在人類OCs中的重現(xiàn)性

最大重現(xiàn)性是準(zhǔn)確量化線粒體蛋白質(zhì)組的首要前提，涉及到整個實驗過程，包括線粒體的制備、線粒體蛋白質(zhì)的提取、胰蛋白酶消化、iTRAQ‐標(biāo)記、SCX‐分離、LC‐MS/MS分析以及數(shù)據(jù)庫搜索和定量計算。首先，需要獲得高質(zhì)量的線粒體樣本。我們的研究發(fā)現(xiàn)OC與對照組的卵巢組織制備線粒體的方法差異如上所述。在我們優(yōu)化的實驗方案下，采用差速離心和密度梯度離心相結(jié)合的方式制備了高質(zhì)量的線粒體樣品。電鏡(EM)分析表明，制備的線粒體樣品除少量過氧化物酶體外，主要細(xì)胞器為OCs和對照卵巢內(nèi)的線粒體；與對照卵巢相比，外周卵巢的線粒體形態(tài)變化更明顯。Western blot (WB)分析表明，在制備的線粒體樣品中，除了少量過氧化物酶體外，主要成分為線粒體。WB結(jié)果與EM結(jié)果一致。在制備的線粒體中含有過氧化物酶體是合理的，因為線粒體與過氧化物酶體有廣泛的相互作用，反映線粒體功能的完整性。這些結(jié)果表明制備的線粒體樣品質(zhì)量高。第二，獲得足夠數(shù)量的線粒體蛋白樣本。一般來說，iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)至少需要600 μg蛋白質(zhì)(每次iTRAQ標(biāo)記200 μg蛋白質(zhì)，三次重復(fù))。我們的研究結(jié)合了分別從7個OC組織和11個對照卵巢組織制備的線粒體樣本。我們的研究分別結(jié)合了7個OC組織和11個對照卵巢組織制備的線粒體樣本，從OC組織中共獲得2409 μg線粒體蛋白，從對照組卵巢組織中共獲得4440 μg線粒體蛋白，這些量對于iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析是足夠的。第三，應(yīng)該通過iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)來達(dá)到定量蛋白的最大數(shù)量，以便對人類OC中線粒體進(jìn)行深入研究。與對照組卵巢組織的線粒體相比，我們的研究檢測、鑒定和量化了來自O(shè)C組織的線粒體樣本中的5115個蛋白質(zhì)，包括2,565(50.14%)上調(diào)蛋白(癌與對照比率>1)和2,550(49.86%)下調(diào)蛋白(癌與對照比率< 1)。第四，變異系數(shù)(CV)，相關(guān)系數(shù)(r)和定量5115個蛋白質(zhì)的fold‐change進(jìn)行了計算，以反映基于iTRAQ的線粒體定量蛋白質(zhì)組學(xué)的重現(xiàn)性(表2)。99.10%蛋白質(zhì)的CV <30%，5115個蛋白的平均CV為6.53% (CV范圍，0-75%)。它們的平均r為0.94(范圍為0.93-0.96)，其中99.24% (n = 5,076)蛋白的fold‐change <1.5。因此，該基于iTRAQ的定量蛋白質(zhì)組分析系統(tǒng)具有很高的可重復(fù)性。因此，截止值(fold‐change<1.5和fold‐change>1.5)加上統(tǒng)計學(xué)顯著性p < 0.05可以代表OC和對照線粒體之間的真實生物變化，因此，相對于對照組卵巢組織，OC組織中測定了1198 mtDEPs。

表2 5115個被量化的線粒體蛋白的CV、相關(guān)系數(shù)(r)和fold‐change

B. 人類OCs線粒體蛋白質(zhì)組的定量參考圖

建立了人OC線粒體蛋白質(zhì)組在卵巢癌細(xì)胞和組織中的定量參考圖譜。對于CDDP敏感(A2780)和CDDP耐藥(A2780‐CP20)的人類OC細(xì)胞的線粒體蛋白質(zhì)組參考圖，使用LC‐MS/MS對蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。從A2780細(xì)胞系中共鑒定出1,960個蛋白(8,945個獨特肽序列)，從A2780‐CP20細(xì)胞系中鑒定出1,680個蛋白(8,624個獨特肽序列)。GO分析表明，這些鑒定的蛋白質(zhì)大部分位于線粒體。還應(yīng)注意，線粒體蛋白質(zhì)組參考圖常不可避免地包括來自其他細(xì)胞間隔的蛋白質(zhì)，如細(xì)胞質(zhì)、核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體和溶酶體蛋白質(zhì)。然而，我們不能否認(rèn)線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的可靠性，因為它涉及許多因素。例如，構(gòu)成線粒體外膜的復(fù)雜的線粒體-細(xì)胞質(zhì)界面在線粒體和細(xì)胞質(zhì)成分之間有許多連接。此外，大約15%的線粒體蛋白是雙定位的。此外，通過IPA分析鑒定的典型通路和網(wǎng)絡(luò)為CDDP耐藥的OC細(xì)胞的線粒體蛋白質(zhì)組提供了潛在的功能系統(tǒng)探索，并且進(jìn)一步驗證了線粒體中四個豐富的典型通路網(wǎng)絡(luò)蛋白(Nestin、AKAP12、ALCAM和SOD)。其中，nestin被報道在高級別漿液性O(shè)C中與nestin相關(guān)的微血管密度、總生存時間和無疾病生存時間相關(guān)，可能被認(rèn)為是一種新的抗血管生成藥物。AKAP12在紫杉醇耐藥的高級別漿液性O(shè)C中升高，并與較差的無進(jìn)展?fàn)顟B(tài)和總體生存時間有關(guān)。單因素分析和多因素分析均表明過表達(dá)A KAP12是一個重要的危險因素。這些發(fā)現(xiàn)提供了CDDP敏感細(xì)胞(A2780)和CDDP耐藥細(xì)胞(A2780‐CP20)的線粒體蛋白質(zhì)組參考圖，并突出了它們的分子細(xì)胞功能特征。

對于人類OC組織的線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)特征，我們使用6‐plex iTRAQ方法研究OC組織與對照卵巢中的mtEPs。從準(zhǔn)備的人類OC組織線粒體樣本中，總共定量了5,115個mtEPs。將mtEPs與TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)(轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)，n = 419例OC患者)整合后，發(fā)現(xiàn)262個mtEPs與OC患者的總生存率顯著相關(guān)。本研究首次提供了人類OC中大規(guī)模定量組織線粒體蛋白質(zhì)組分析。對這些mtEPs的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)了許多潛在的生物標(biāo)志物和人類OCs的重要信號通路，這將促使更多的研究開發(fā)新的生物標(biāo)志物并探索其關(guān)鍵機(jī)制。通路分析(70個信號通路)和GO富集分析為OC中線粒體蛋白質(zhì)組分析提供了完整的注釋(圖3)。對定位于線粒體和重要途徑的5個mtEPs進(jìn)行詳細(xì)的介紹，包括異檸檬酸脫氫酶[NADP] (IDH2)、GLDC、PCK2、HMGCS2和肉堿棕櫚基轉(zhuǎn)移酶II (CPT2)。結(jié)果與其他腫瘤發(fā)生的研究一致。例如，CPT2分布在線粒體內(nèi)膜中，在長鏈脂肪酸的氧化中起作用。CPT2活性缺陷是導(dǎo)致癌癥惡病質(zhì)的主要原因。HMGCS2蛋白是HMG‐CoA合成酶家族的成員，催化酮生成的第一個反應(yīng)。在癌中抑制HMGCS1表達(dá)可以降低細(xì)胞內(nèi)乙酰乙酸水平，降低BRAF與MEK1的結(jié)合，抑制MEK1的激活。

圖3 iTRAQ鑒定的蛋白的網(wǎng)絡(luò)分析

(a)根據(jù)PANTHER的細(xì)胞成分，共有5115種蛋白質(zhì)被分類。(b) KEGG通路分析將鑒定的蛋白映射到70個信號通路

C. 人類OCs和對照組之間線粒體蛋白質(zhì)組的差異概況

人類卵巢癌細(xì)胞和組織中線粒體蛋白組與對照組的差異也進(jìn)行了研究。對于人類OC細(xì)胞與鉑耐藥細(xì)胞中的線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)，我們比較了鉑耐藥細(xì)胞系與相應(yīng)的化療敏感細(xì)胞系之間的線粒體蛋白DIGE圖譜。mtDEPs的確定采用了兩倍的匹配點強(qiáng)度差加上p<0.05，在鉑耐藥細(xì)胞中，共有128個凝膠點體積增加，108個凝膠點體積減少。從236個凝膠點中僅選取11個差異凝膠點(組間差異明顯)進(jìn)行MALDI‐TOFMS分析。五種蛋白質(zhì)，包括抑制性蛋白(PHB)、PRDX3、ETF、ATP‐a和ALDH通過MS鑒定為DEPs，并通過免疫印跡驗證。一些已鑒定的鉑耐藥相關(guān)蛋白在多種人類癌癥中發(fā)揮重要作用，包括OC。如PHB在進(jìn)化上保守，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，在抑制人類腫瘤和細(xì)胞衰老中發(fā)揮作用。PHB的抗增殖活性可能定位在3′未翻譯區(qū)域，并被報道為一種反作用調(diào)控RNA。免疫組織化學(xué) (IHC)和TaqMan?實時基因表達(dá)檢測60名卵巢腫瘤患者和20名健康志愿者中PHB的表達(dá)。數(shù)據(jù)顯示，OC組織中PHB明顯升高，其PHB的活性可能通過轉(zhuǎn)化生長因子β介導(dǎo)。PRDX3編碼產(chǎn)物是一種線粒體蛋白，可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激，并與細(xì)胞增殖、抗氧化和分化功能的調(diào)節(jié)有關(guān)。PRDX3 mRNA顯示較差的總生存率，是OC患者化療的可靠預(yù)后指標(biāo)。此外，對于人類OC細(xì)胞及其紫杉醇耐藥細(xì)胞之間的線粒體比較蛋白質(zhì)組學(xué)，LC雜交線性離子阱FT‐ICR MS鑒定到542個蛋白，包括SKOV3‐TR/SKOV3細(xì)胞中的328個蛋白和A2780‐TR/A2780細(xì)胞中的454個蛋白。根據(jù)差異比率、高肽匹配評分以及所涉及的生物功能，我們進(jìn)一步研究了14‐3‐3ζ/δ和mimitin蛋白。OC細(xì)胞的紫杉醇耐藥指數(shù)隨著siRNA干擾14‐3‐3ζ/δ和mimitin蛋白而顯著改變。這些結(jié)果與OC患者的化療敏感性和耐藥性的臨床和病理特征一致。這些研究提供了對化療敏感的人卵巢細(xì)胞和對化療耐藥的人卵巢細(xì)胞之間的線粒體蛋白組的差異，并證明了線粒體缺陷對OC細(xì)胞的化療耐藥的貢獻(xiàn)。

對于人類OC組織的線粒體蛋白質(zhì)組，使用iTRAQ的定量蛋白質(zhì)組來定量相對于對照組織的人類OC組織中的mtDEPs，共鑒定出1198個mtDEPs。OC中一系列與能量代謝途徑相關(guān)的酶，包括丙酮酸脫氫酶E1組成亞基β(PDHB)、丙酮酸激酶(PKM)、PFKM、檸檬酸合成酶(CS)、IDH3B、IDH3A、IDH2、2-氧化戊二酸脫氫酶(OGDHL)、ND5、ND2、輔酶細(xì)胞色素c還原酶鉸鏈蛋白(UQCRH)和細(xì)胞色素b還原酶1(CYB)，這些蛋白質(zhì)中大部分在OC的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中是至關(guān)重要的。例如，PKM2在OC組織中過表達(dá)，并通過免疫組化檢測。增加的PKM2通過上調(diào)CCND1和下調(diào)DKN1A影響細(xì)胞周期，在OC的生長、增殖和存活中發(fā)揮作用。許多研究證明PKM2可能是OC的治療靶點。UQCRH基因編碼線粒體鉸鏈蛋白，該蛋白在各種癌細(xì)胞系中滅活。兩株OC細(xì)胞系也檢測了UQCRH無表達(dá)。此外，在OC細(xì)胞OAW42中脫甲基劑5‐azacytidine可恢復(fù)UQCRH的表達(dá)。在1198個線粒體DEPs中，還有許多其他的重要蛋白質(zhì)具有高變化率(tumor/control ratio <0.30 or >3)，需要進(jìn)一步研究，如COL2A1, NSPN, SUN2, PUM1, UbC, XIRP1,COX4I2, HIST2H2AB, COL10A1, COL5A2, MAPK4, H2AFZ, NCAM1, SAG, FBN1, APCS,COL1A2, EMILIN3, COL3A1, COMT, COL1A1, GNG4, AIG1, PTTG1IP, S100A14, AGMAT,NMES1, TSPAN1, TGM1, HLA‐DPA1, C1orf53和HLA‐A。綜合定量蛋白質(zhì)組學(xué)和TCGA轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析及臨床數(shù)據(jù)(n=419例患者)發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA (lncRNA) SNHG3可調(diào)控EIF4AIII和miRNAs，EIF4AIII和miRNAs可在糖酵解途徑中靶向PKM，在糖酵解通路中靶向IDH2和PDHB以及UQCRH在氧化磷酸化(OXPHOS)途徑中的作用(圖4)。在1198個mtDEPs的基礎(chǔ)上，建立了一種7個樞紐分子的特征模型(ALB、HIST1H2BK、RRAS2、RPS20、HIBCH、RPL23A和EIF3E)來預(yù)測OC的生存風(fēng)險。因此，大規(guī)模線粒體比較蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合大規(guī)模TCGA轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)是建立可靠的樞紐分子和構(gòu)建OC預(yù)后模型的寶貴資源。研究人員還建議結(jié)合多中心數(shù)據(jù)來篩選新的、有效的分子，因為構(gòu)建的預(yù)后模型需要通過大樣本的臨床調(diào)查來驗證。

圖4 SNHG3與能量代謝在卵巢癌調(diào)控中的潛在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制示意圖

D. 人類OCs線粒體磷酸化蛋白組學(xué)研究

PTM參與多種BPs，包括蛋白降解、蛋白生物合成、細(xì)胞分化、細(xì)胞生長、信號傳導(dǎo)和調(diào)控過程、蛋白間相互作用和基因表達(dá)調(diào)控。有許多類型PTMs，包括磷酸化、棕櫚酰化、二甲基化、糖基化、泛素化、乙酰化、硝化、亞甲基化、甲基化和脫羧。這些PTMs可以通過FT‐ICR MS或LTQ OrbiTrap XL的“top‐down” 和“bottom‐up”分析進(jìn)行識別和量化。蛋白磷酸化是一種常見的PTM，三分之一的哺乳動物蛋白可能被磷酸化。隨著MS蛋白組學(xué)的重大發(fā)展，線粒體蛋白磷酸化譜已被鑒定，以了解病理生理條件下的分子機(jī)制。

Zhan等人提供了一種非常穩(wěn)健和定量的人類卵巢癌線粒體磷酸化蛋白譜分析。將從OC和對照卵巢組織中純化的線粒體用胰酶消化，并用iTRAQ試劑標(biāo)記，并用優(yōu)化的TiO2珠子富集iTRAQ標(biāo)記的磷酸肽段，再進(jìn)行LC‐MS/MS分析。兩個MS/MS圖譜鑒定磷酸化肽段和磷酸化位點(圖5)。與對照組相比，OC組織線粒體中共鑒定了67個具有124個磷酸化位點的線粒體磷酸化蛋白(mtPPs)，包括48個具有84個磷酸化位點的線粒體差異磷酸化蛋白(mtDPPs)(圖6)。本研究首次提供了OC患者的大規(guī)模線粒體磷酸化蛋白組分析。一定數(shù)量的人OC的磷酸化蛋白和相關(guān)信號通路將有助于進(jìn)一步研究開發(fā)新的生物標(biāo)志物和探索關(guān)鍵機(jī)制。一些mtPPs被認(rèn)為是蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中的樞紐分子，包括EIF2S2、RPLP2、cofilin1 (CFL1)、VDAC3、MYH10、RPLP0、HSP90、HSPD1、TMX1、VDAC2、TOMM22、PSMA3和TOMM20。mtPPs中磷酸化位點和功能域的關(guān)系也為線粒體蛋白磷酸化及其在OCs中的潛在作用提供了新的見解(圖7)。其中一些磷酸化位點在其他OC磷酸化蛋白的研究中也有報道。例如，磷酸化的cofilin 1(p‐CFL1)在紫杉醇耐藥OC細(xì)胞中高表達(dá)。此外，p‐CFL1在原發(fā)性人類OC組織的化學(xué)耐受病例中表達(dá)較多，而在化學(xué)敏感性病例中表達(dá)較少。根據(jù)細(xì)胞系和臨床數(shù)據(jù)顯示，p‐CFL1與人OC中紫杉醇耐藥密切相關(guān)。據(jù)報道，磷酸化Cav1 (p‐Cav1)與galectin‐3相互作用，而galectin晶格有助于局灶粘連中局灶粘附激酶的穩(wěn)定性。因此，Cav1可能調(diào)節(jié)局灶黏附動力學(xué)、癌細(xì)胞遷移和癌細(xì)胞運動。在新輔助治療前后，乳腺癌組織和癌旁組織中均發(fā)現(xiàn)磷酸化的PGRMC1，這可能與治療反應(yīng)有關(guān)。治療后的手術(shù)標(biāo)本中pPGRMC1水平較低，提示PGRMC1可能在人腫瘤的治療耐藥中起重要作用。另一項研究表明，MARCKS和phospho‐MARCKS在高侵襲性肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)較高。具體來說，磷酸化標(biāo)記可能在癌細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移中具有潛在的功能。許多研究表明磷酸化作用對腫瘤細(xì)胞蛋白功能活性的重要性，利用相關(guān)的磷酸化肽段治療腫瘤是可能的。線粒體磷酸化蛋白質(zhì)組分析，包括潛在的生物標(biāo)志物、信號通路、GO、蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)、蛋白結(jié)構(gòu)域和上游調(diào)控將有助于確定OC中線粒體磷酸化的作用。

圖6 鑒定線粒體磷酸化蛋白的實驗流程圖，包括18個之前鑒定的線粒體磷酸化蛋白

圖7 線粒體磷酸化蛋白的磷酸化位點和蛋白結(jié)構(gòu)域的鑒定

E. 在人類OCs中整合線粒體蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)、全組織蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

OC的發(fā)生和發(fā)展是一個具有連續(xù)復(fù)雜變化的慢性過程。所有的研究都證明了OC是多種因素相互作用的結(jié)果，涉及到各種過程。癌癥是一種全身疾病，其多重后果會導(dǎo)致非常復(fù)雜和危險的情況。預(yù)測、預(yù)防和個性化醫(yī)學(xué)(PPPM)是未來癌癥領(lǐng)域的發(fā)展方向。內(nèi)源性和外源性致癌物導(dǎo)致基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、肽組、代謝組和放射組等一系列分子改變，它們相互作用，在腫瘤生物系統(tǒng)中發(fā)揮作用。因此，在人類OCs中整合線粒體蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)(1,198 mtDEPs)、全組織蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)(205 DEPs)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(419 OC樣本中的20,115個基因)(圖8)。在本研究中，在有氧糖酵解、Krebs循環(huán)和PXPHOS途徑中發(fā)現(xiàn)了能量代謝相關(guān)酶的上調(diào)，如PFKP、PKM、CS、PDHB、IDH2、OGDHL和UQCRH。綜合分析顯示了OCs的代謝靈活性和能量代謝異質(zhì)性。OC細(xì)胞中存在Warburg效應(yīng)和反向Warburg效應(yīng)，調(diào)節(jié)能量代謝重編程。傳統(tǒng)的Warburg效應(yīng)認(rèn)為，即使在有氧條件下，癌細(xì)胞也更傾向于通過糖酵解途徑產(chǎn)生ATP。長期以來，Warburg效應(yīng)在癌細(xì)胞能量代謝的科學(xué)觀點中占據(jù)主導(dǎo)地位。近年來，隨著能量代謝研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)，Warburg效應(yīng)在解釋癌細(xì)胞能量代謝重編程方面明顯存在局限性和過時性。一些證據(jù)表明糖酵解為婦科癌細(xì)胞提供不到50%的ATP，而OXPHOS是產(chǎn)生能量的主要來源。此外，糖酵解抑制劑并沒有獲得足夠的證據(jù)表明糖酵解抑制劑治療比其他治療更有效。然而，糖酵解抑制劑的一些不令人滿意的療效被認(rèn)為是一個更困難的問題，如強(qiáng)烈的副作用或耐藥性?；|(zhì)細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分之一，在腫瘤發(fā)生中起著致瘤作用?！胺聪騑arburg效應(yīng)”模型與腫瘤細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的能量代謝重編程過程有關(guān)。癌癥細(xì)胞通過有氧糖酵解和OXPHOS來依賴能量。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)是腫瘤微環(huán)境中的一種基質(zhì)細(xì)胞，癌細(xì)胞釋放的活性氧(ROS)可在氧化應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生CAFs。在這個過程中，CAFs向細(xì)胞外間質(zhì)分泌豐富的營養(yǎng)物質(zhì)。這些營養(yǎng)物質(zhì)可以被癌細(xì)胞通過增加Krebs循環(huán)和OXPHOS來產(chǎn)生ATP。因此，人們應(yīng)該更新癌癥細(xì)胞能量代謝重編程的概念，認(rèn)為Warburg效應(yīng)和反向Warburg效應(yīng)是互補的。

在真核生物基因組中，ncRNAs (microRNAs和lncRNAs)可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)、細(xì)胞生物過程和基本生物功能。最近的研究表明，lncRNA在OCs中起著至關(guān)重要的作用。整合人類OCs中的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，揭示了RNA和蛋白質(zhì)之間的調(diào)控關(guān)系，并發(fā)現(xiàn)LncRNA SNHG3通過靶向線粒體相關(guān)通路(Krebs 循環(huán)和OXPHOS)與能量代謝相關(guān)。LncRNAs協(xié)調(diào)線粒體的功能，代表了基于多組學(xué)對卵巢腫瘤發(fā)生的全新理解。 

圖8 卵巢癌1198 mtDEPs、205 DEPs和20115 TCGA數(shù)據(jù)的整合分析實驗流程圖，以揭示能量代謝異質(zhì)性及其分子機(jī)制。

F. 人類OCs的分子網(wǎng)絡(luò)改變

在人類OC細(xì)胞和組織中發(fā)生分子網(wǎng)絡(luò)改變。為了研究改變的線粒體蛋白質(zhì)組和人類CDDP敏感細(xì)胞(A2780)和CDDP耐藥細(xì)胞(A2780‐CP20)的CDDP耐藥性之間的關(guān)系，通過鑒定的線粒體蛋白揭示信號通路和分子網(wǎng)絡(luò)。比如notch信號、凋亡途徑、死亡受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、干擾素調(diào)節(jié)因子通路的激活和細(xì)胞存活趨勢明顯與A2780‐CP20亞型相關(guān)，但與A2780無關(guān)。這些結(jié)果表明，線粒體蛋白質(zhì)組的改變可能與CDDP耐藥OC的細(xì)胞凋亡、侵襲性和轉(zhuǎn)移性有關(guān)。為了研究線粒體蛋白質(zhì)組改變與人類OCs發(fā)病機(jī)制的關(guān)系，我們構(gòu)建了基于已鑒定的mtDEPs的分子網(wǎng)絡(luò)和通路變化。1198 mtDEPs的1174個鑒定標(biāo)志在OC和對照組織中通過IPA進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)和通路分析。基于上述1174個鑒定標(biāo)志，蛋白‐蛋白相互作用(PPIs)提供了這些鑒定的mtDEP與綜合評分>0.4的相關(guān)性(圖9)。以PPIs為基礎(chǔ)，鑒定了102個樞紐分子，并用于構(gòu)建7個樞紐分子特征模型(ALB、HIST1H2BK、HIBCH、RRAS2、EIF3E、RPL23A和RPS20)用于監(jiān)測OC生存風(fēng)險。此外，通路網(wǎng)絡(luò)分析揭示了人類OCs中25個具有統(tǒng)計學(xué)意義的網(wǎng)絡(luò)和192個典型通路。52個典型通路在癌癥發(fā)病過程中被激活或抑制。這25個mtDEP富集網(wǎng)絡(luò)顯示了廣泛的基因功能，如基因表達(dá)(復(fù)制、重組、DNA修復(fù)、蛋白質(zhì)合成、PTM和蛋白質(zhì)折疊)、小分子生物化學(xué)代謝(核酸代謝、藥物代謝和氨基酸代謝)、細(xì)胞功能(細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞運動、細(xì)胞組裝和組織、細(xì)胞損傷、細(xì)胞死亡和存活)、組織發(fā)育(結(jié)締組織紊亂、機(jī)體損傷和異常)以及與癌癥相關(guān)的系統(tǒng)性疾病。這些在每個網(wǎng)絡(luò)中上調(diào)或下調(diào)的樞紐mtDEPs為基因網(wǎng)絡(luò)中mtDEPs的相互作用機(jī)制和功能提供了線索。在這些被識別的網(wǎng)絡(luò)中，許多樞紐mtDEP在OC之前已經(jīng)被報道過，包括來自于GenCLip3的功能相關(guān)基因PIK3CA、CDKN2A、FOLR1、VIM、NTRK1、HMGA1、KRT19、H2AFX、KRT8、NCL、EPHB2、C1QBP、FBN1、PDLIM7、AIFM1、FLNA、XRCC6、HYOU1、SNAP29、EIF3C、PNKD、ELN、FLNB、LGALS3BP和PDIA6 (http://ci.smu.edu.cn/genclip3)。

圖9 在卵巢癌組織中發(fā)現(xiàn)了中樞分子

根據(jù)豐富的信號通路系統(tǒng)和線粒體的多功能，這些重要的典型通路與各種癌癥相關(guān)的BPs相關(guān)。進(jìn)一步篩選192個有統(tǒng)計學(xué)意義的典型途徑后，52個有統(tǒng)計學(xué)意義的典型途徑可能在癌癥中被激活或抑制。對這52條被激活或被抑制的典型途徑與癌癥生物學(xué)之間關(guān)系的進(jìn)一步分析揭示了29條與癌癥相關(guān)的途徑，包括抗原遞呈途徑、線粒體功能障礙、谷胱甘肽介導(dǎo)的解毒作用、EIF2信號、GP6信號通路、α腎上腺素能信號、CREB信號、神經(jīng)元中的cXCR4信號、EIF4和p70S6K信號的調(diào)節(jié)、內(nèi)皮素信號、ephrin受體信號、脂肪酸β氧化I、中性粒細(xì)胞中的FLMP信號、G β‐γ通路、Gaq信號、GNRN信號、IGF‐1信號、IL2信號、IL‐8信號、整合素信號、mTOR信號、OC信號、OXPHOS、P2Y purigenic受體信號通路、磷脂酶c信號、Rho家族GTPases信號、生長抑素信號的抗增殖作用、TEC kinse信號和凝血酶信號。本文重點綜述了近年來腫瘤研究的熱點途徑，如OC信號通路、線粒體功能障礙、能量代謝(糖代謝通路和脂代謝通路)、線粒體自噬通路、凋亡信號通路、氧化應(yīng)激、免疫過程和腫瘤微環(huán)境的改變。在1,198個mtDEPs中，OC信號通路中顯著富集的蛋白為BCL2、CDKN2A、DVL1、EDNRA、FGFR4、FZD7、GJA1、PRKACA、PRKACB、PRKAR2B、TGS1、PTPN11、RRAS、RRAS2、WNT4、WNT10A、WNT2B和WNT5B。這些被鑒定的蛋白可能與OC的發(fā)生密切相關(guān)，是進(jìn)一步研究的可靠數(shù)據(jù)。線粒體功能障礙通路中顯著富集的蛋白有ACO1、AIFM1、ATP5MC1、ATPAF1、ATPAF2、BCL2、COX17、COX4I1、COX4I2、COX6C、COX7A2、COX7A2L、CYB5A、CYC1、CYCS、GPD2、GPX7、HTRA2、MAOB、MT‐ATP6、MT‐CO2、MT‐CO1、MT‐ND2、MT‐CYB、MT‐ND5、OGDH、PRDX5、TXN2、UQCRH和VDAC1。線粒體功能障礙與人類癌癥領(lǐng)域的潛在相關(guān)性已經(jīng)被多次報道。線粒體在許多信號通路中具有重要的功能和生物活性，包括OC中的線粒體功能障礙。近十年來，能量代謝重編程引起了很大的爭議，至今仍未得出一致的結(jié)論。mtDEPs富含能量代謝，包括糖代謝途徑(克雷布斯循環(huán)和OXPHOS)和脂代謝途徑(脂肪酸降解、脂肪酸代謝、丁酸代謝和丙酸代謝)，為OC與對照組織相比的能量代謝改變提供了生物標(biāo)志物。隨著腫瘤免疫學(xué)的發(fā)展，炎癥和免疫已成為抗腫瘤免疫治療的重要組成部分。凋亡信號通路中顯著富集的蛋白包括AIFM1、BCL2、BCL2L1、BIRC6、CAPN2、CAPN6、CAPNS1、CYCS、ENDOG、HTRA2、LMNA、PRKCA、RRAS、RRAS2、SPTAN1?；钚晕镔|(zhì)主要包括一氧化氮自由基、脂類自由基和ROS，是代謝反應(yīng)的產(chǎn)物。在癌細(xì)胞中，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)需要高濃度的反應(yīng)性物質(zhì)，并產(chǎn)生反應(yīng)性物質(zhì)。氧化應(yīng)激和自由基清除系統(tǒng)在癌癥治療中具有重要意義。其他相關(guān)途徑也顯著富集1198個mtDEPs，包括谷胱甘肽氧化還原反應(yīng)II途徑、谷胱甘肽氧化還原反應(yīng)I途徑、NRF介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)途徑、巨噬細(xì)胞中NO和ROS的產(chǎn)生途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑。

本文還對腫瘤微環(huán)境中線粒體蛋白的改變與宿主細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的關(guān)系進(jìn)行了綜述。近年來，有報道稱線粒體功能障礙與腫瘤微環(huán)境中的多種細(xì)胞密切相關(guān)。用1,198mtDEPs鑒定了與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)的大量通路，包括對基質(zhì)金屬蛋白酶途徑的抑制，整合素，腫瘤通路中的組織因子信號傳導(dǎo)，gap連接和緊密連接。

OCs中基于線粒體的分子通路和網(wǎng)絡(luò)研究對我們更好地理解卵巢腫瘤的發(fā)生具有重要意義，并為OCs的治療提供了新的生物標(biāo)志物和方法。

G. 人類OCs的生物標(biāo)記物和治療靶點

癌癥生物標(biāo)志物可以分為兩種類型:第一種類型的生物標(biāo)志物有助于預(yù)測、診斷和預(yù)后，第二種類型的生物標(biāo)志物有助于機(jī)制和治療靶點。用于評估的生物標(biāo)志物需要具有良好的敏感性和特異性，根據(jù)定量變化容易檢測到。機(jī)制和治療靶點的生物標(biāo)志物需要與癌癥的發(fā)生/進(jìn)展密切相關(guān)。這類生物標(biāo)志物在網(wǎng)絡(luò)中一直起著關(guān)鍵作用或樞紐基因的作用。在已公布的數(shù)據(jù)中，單因素模型對癌癥的影響仍然處于領(lǐng)先地位。然而，癌癥是多基因、多期參與的。人們已經(jīng)構(gòu)想了PPPM在癌癥中的多參數(shù)系統(tǒng)策略。

以iTRAQ為基礎(chǔ)的OC線粒體定量蛋白質(zhì)組在OC和對照組織中定量5115 mtEPs。結(jié)合TCGA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床信息，發(fā)現(xiàn)262個蛋白與OC患者的生存預(yù)后顯著相關(guān)。通過GenCLiP3網(wǎng)站(http://ci.smu.edu.cn/genclip3/analysis.php)檢索的63個mtEP被報道為OC的潛在生物標(biāo)志物。這些蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)是人類OC的首個組織線粒體蛋白質(zhì)組參考圖。這些發(fā)現(xiàn)有助于建立人類線粒體蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫，并為臨床實踐提供有用的生物標(biāo)志物。此外，利用分子復(fù)合檢測方法對1198個mtDEPs和102個樞紐分子進(jìn)行了識別，并利用多元回歸建立了樞紐分子的特征模型。多元回歸推導(dǎo)出的7個樞紐分子特征模型(ALB、HIST1H2BK、HIBCH、RRAS2、RPS20、EIF3E、RPL23A)可評估OC的生存風(fēng)險。這些識別出的mtEPs、mtDEPs，特別是模式生物標(biāo)志物，可用于OCs的預(yù)測、診斷和預(yù)后評估；然而，它們?nèi)匀恍枰M(jìn)一步的臨床實踐來驗證。

通過不同的治療方法來靶向線粒體而治療癌癥已經(jīng)有報道，其中包括靶向ROS，線粒體代謝，線粒體外膜通透性，通透性過渡孔復(fù)合物，線粒體靶向光動力的治療方法。以線粒體為靶點作為OC治療策略的最相關(guān)藥物包括可活化的納米顆粒、波斯灣海洋軟體動物的提取物、裂解肽(YX-1)、多功能腫瘤靶向納米超聲造影劑、阿霉素、氯硝柳胺、FDA批準(zhǔn)的抗生素、ABT737、印黃酮、甘草次酸羅丹明B芐酰胺35、TEMPO、復(fù)合體1‐AMP、linTT1、接骨木凝集素、槲皮素、渡金屬化合物、外泌體miRNAs、重組腺病毒Cre/loxP調(diào)控系統(tǒng)、來自入侵植物的代謝物、PTC‐209、2,2′‐dipyridyl‐N,N‐dimethylsemicarbazone (Dp44mT)、硫咪脲鐵螯合劑三嗪、AMRI‐59、RY‐2f、PENAO、一種混合藥物二氯乙酰鉑(II)、優(yōu)化的以線粒體為目標(biāo)的氯硼化合物、[Pt(BDI(QQ))]、SW III‐123、埃博霉素、STX140和STX641、Flex‐Het、胡椒堿、尼羅替尼 (AMN)、棕矢車菊素、鹽霉素、二甲雙胍、doxycycline、elesclomol sodium、ABT‐263和AT‐101/CDDP。本文總結(jié)了以線粒體為靶點并涉及OC機(jī)制的線粒體抑制劑(表3)。

靶向線粒體分子的癌癥治療的發(fā)展需要考慮藥物選擇性，包括特異性識別和選擇性積累。識別癌細(xì)胞特異性靶點和正常細(xì)胞之間的細(xì)微差別有助于發(fā)現(xiàn)具有選擇性作用的分子。這表明比較線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)和線粒體磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)在OCs中的研究具有重要意義。一項基于線粒體的研究可能為OC的藥物作用靶點和分子機(jī)制提供新的見解。

4. 展望

A. 線粒體蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫的擴(kuò)展和改善

許多研究在努力開發(fā)線粒體蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫，其中包括已報道的大規(guī)模線粒體蛋白質(zhì)組，以提供有關(guān)線粒體蛋白質(zhì)的信息和參考圖。一些線粒體相關(guān)數(shù)據(jù)庫已經(jīng)發(fā)布(表4)，包括人類線粒體蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，Human MitoCarta 2.0, Mitomap, MPIC, MitoMiner,Mitoproteome, InterMitoBase, MITOP2, MitoRes, MitoInteracto, the MitochondrialProtein Atlas和Proteome Comparison of human mitochondria。到目前為止，總共大約已經(jīng)鑒定出3700個線粒體蛋白。在我們的研究中，在人類OCs中鑒定出5115個mtEPs，表明在一個線粒體蛋白質(zhì)組中存在更多的線粒體蛋白。本研究有助于線粒體蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫的擴(kuò)展和完善，而這項定量線粒體蛋白質(zhì)組研究增加了聚焦于OC生物標(biāo)志物和分子機(jī)制的內(nèi)容。由于多種蛋白質(zhì)與線粒體外膜相互作用，在線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)其他細(xì)胞成分是合理和常見的。盡管蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)取得了巨大進(jìn)步，但獲取高質(zhì)量的線粒體蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)仍然是一個挑戰(zhàn)。最基本的需要是嚴(yán)格控制線粒體蛋白的分離和純化。此外，謹(jǐn)慎處理已識別的線粒體蛋白質(zhì)，并用多種方法實驗驗證線粒體蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)也很重要。此外，以目前的線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)方法，還沒有識別出所有的線粒體蛋白質(zhì)，也有必要開發(fā)高靈敏度的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來識別OC線粒體蛋白質(zhì)組中的所有成分，以進(jìn)一步擴(kuò)大和完善線粒體蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。

表4 線粒體蛋白質(zhì)組相關(guān)數(shù)據(jù)庫

B. 人類OCs的線粒體修飾蛋白組學(xué)

隨著線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PTMs，如乙?；?、泛素化、羰基化、磷酸化、氧化過程、亞硝基化或糖基化，被證明與控制線粒體功能和多種病理狀態(tài)密切相關(guān)。近年來在人類OCs中發(fā)現(xiàn)了線粒體PTMs。例如，與其他化合物(細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核)相比，線粒體蛋白質(zhì)組具有高度乙?；膬A向，關(guān)鍵相關(guān)蛋白的乙?；?去乙酰化在調(diào)節(jié)線粒體適應(yīng)性和生物學(xué)的基本方面發(fā)揮著重要作用。組蛋白去乙?；敢种苿┛梢源龠M(jìn)細(xì)胞凋亡，這一點可以通過線粒體跨膜電位的喪失以及OC細(xì)胞中p16、p27KIP1、p21WAF1和cyclin A表達(dá)的改變來證實。蛋白質(zhì)泛素化也被認(rèn)為是主要調(diào)控因子，如泛素特異性肽酶13，它通過上調(diào)氧化戊二酸脫氫酶和ATP檸檬酸裂解酶來驅(qū)動OC代謝。這兩種關(guān)鍵的酶是線粒體呼吸途徑的重要成員。羰基化是一種不可逆的損傷修飾，可以作為氧化損傷的指標(biāo)來衡量。惡性漿液性卵巢樣本具有明顯較高的反應(yīng)性羰基含量，這表明羰基化與氧化應(yīng)激下的OC有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)線粒體中存在蛋白磷酸化并發(fā)揮作用。利用人磷酸化激酶陣列分析信號通路的激活，如大蒜素誘導(dǎo)JNK磷酸化并觸發(fā)SKOV3中線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號通路。盡管與其他CCs相比，線粒體中的磷蛋白很少，可逆磷酸化在細(xì)胞過程的調(diào)控中發(fā)揮更廣泛的作用。線粒體磷酸化蛋白及其它們涉及潛在的細(xì)胞過程是人類OCs線粒體修飾蛋白組學(xué)的重要組成部分，迫切需要形成參考圖譜以供進(jìn)一步研究。與對照組相比，已在人類OC組織線粒體中鑒定出來自67 mtDPPs的85個磷酸肽中的124個磷酸化位點，其中包括來自48 mtDPPs的57個差異磷酸化肽中的84個磷酸化位點。這些數(shù)據(jù)提供了關(guān)于人OC全面的分析和線粒體磷蛋白信息。我們堅信這些線粒體PTM研究只是線粒體PTMs的一個窗口，因為在人體中至少有400個PTMs。此外，闡明這些PTMS之間的競爭效應(yīng)和協(xié)同效應(yīng)，以調(diào)節(jié)人類OCs中的線粒體功能，也是非常必要的。因此，有必要擴(kuò)大更多的PTMs的研究，闡明競爭性和協(xié)同效應(yīng)在調(diào)控蛋白質(zhì)和線粒體功能中的作用。

C. 人類OCs中的線粒體蛋白質(zhì)形態(tài)

直到最近，大多數(shù)研究者仍然認(rèn)為每個人類蛋白質(zhì)編碼基因都被相應(yīng)地轉(zhuǎn)錄和翻譯成單個蛋白質(zhì)。然而，蛋白質(zhì)形態(tài)或蛋白質(zhì)種類的概念正在改變原有的傳統(tǒng)模型——每個蛋白質(zhì)被定義為一組來自一個基因的蛋白質(zhì)形態(tài)，一個蛋白質(zhì)被定義為一個蛋白質(zhì)序列+ PTMs +位置+空間構(gòu)象+輔助因子+一個功能。據(jù)估計，人類蛋白質(zhì)組是由一百萬種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)形式組成的。大量的研究表明了蛋白質(zhì)形態(tài)的可能性和重要性，是蛋白質(zhì)組學(xué)概念創(chuàng)新之一。例如，每個雙向凝膠電泳(2DGE)點通常被認(rèn)為只含有一到兩種蛋白質(zhì)。然而，隨著基于高靈敏度質(zhì)譜儀的2DGE分辨率的發(fā)展，使用LC Orbitrap Velos MS分析，每個考馬斯藍(lán)染色2DGE點平均至少鑒定出50或數(shù)百個蛋白樣。本研究證明了蛋白形態(tài)的存在，并顯示了2DGE‐MS分離大規(guī)模蛋白種類或蛋白形態(tài)的能力。此外，蛋白質(zhì)形式的鑒定也有助于了解個體分子譜和疾病的表型。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)方法的進(jìn)展，新的生物標(biāo)志物的識別有望根據(jù)與各種疾病表型相關(guān)的異常蛋白形式。復(fù)雜系統(tǒng)中蛋白質(zhì)形態(tài)的識別是蛋白質(zhì)組學(xué)的關(guān)鍵挑戰(zhàn)，如線粒體。目前的研究已經(jīng)使用自頂向下的質(zhì)譜分析完整的蛋白質(zhì)，以確定和量化小鼠線粒體蛋白形式。這一策略增強(qiáng)了蛋白形態(tài)的鑒定，表明將傳統(tǒng)的自頂向下質(zhì)譜和完整的質(zhì)量蛋白整合來鑒定蛋白形態(tài)是可行的。雖然自頂向下蛋白質(zhì)組學(xué)是一種準(zhǔn)確的方法來鑒定和量化蛋白質(zhì)，但其吞吐量是有限的。Zhan等發(fā)現(xiàn)2DGELC質(zhì)譜/質(zhì)譜具有大規(guī)模研究蛋白質(zhì)譜的能力，將在OCs線粒體蛋白形態(tài)分析中發(fā)揮重要作用。人類OCs的線粒體蛋白質(zhì)形態(tài)尚未得到研究；該研究將是闡明人類OC線粒體蛋白樣家族的一個重要領(lǐng)域，具有重要的科學(xué)價值。

D. 人類OCs中線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)與其他組學(xué)數(shù)據(jù)的整合

線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)與多組學(xué)的結(jié)合，如基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、脂組學(xué)、代謝組學(xué)和放射組學(xué)，可以有助于全面理解線粒體蛋白質(zhì)的功能。對透明細(xì)胞OCs和卵巢子宮內(nèi)膜樣癌進(jìn)行RNA測序和質(zhì)譜分析。為了評估ARID1A突變引起的蛋白質(zhì)組學(xué)變化，我們使用外顯子組測序來鑒定ARID1A突變，使用MALDI TOF MS來確定ARID1A突變的DEPs。使用多變量回歸分析ARID1A突變與蛋白磷酸化之間的關(guān)系。蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)的整合將闡明基因組異常與癌癥表型的潛在關(guān)聯(lián)，并發(fā)現(xiàn)更可靠的新的候選生物標(biāo)志物用于診斷和治療，這可以用靶向的MS方法進(jìn)行驗證。大規(guī)模協(xié)同精準(zhǔn)醫(yī)療項目和數(shù)據(jù)庫(如TCGA)被用于收集豐富的多組數(shù)據(jù)，包括人類OC中的體細(xì)胞突變、DNA甲基化、拷貝數(shù)改變、基因表達(dá)、miRNAs、lncRNAs和蛋白表達(dá)。例如，通過整合線粒體蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)和TCGA轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG3可以調(diào)節(jié)OC的能量代謝，262個mtEPs與OC患者的總體生存顯著相關(guān)，63個mtEPs是OC發(fā)生發(fā)展的潛在生物標(biāo)志物。結(jié)合線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)和其他組學(xué)技術(shù)，為全面闡明線粒體在OCs中的生物學(xué)作用提供了機(jī)會，并將有利于OC精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的預(yù)測、診斷和治療。

E.人類OCs中基于分子通路網(wǎng)絡(luò)的生物標(biāo)記物和治療靶點

目前，雖然在人類OCs中已經(jīng)積累了大量的線粒體比較蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，但線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)仍面臨許多問題和困境；例如，如何研究已鑒定的未評論線粒體蛋白的生物功能，如何構(gòu)建線粒體特定信號網(wǎng)絡(luò)，如何分離和分析線粒體蛋白-蛋白相互作用如整個復(fù)合物或超級復(fù)合體，和如何選擇可靠且關(guān)鍵的生物標(biāo)志物來構(gòu)建包含一系列分子的數(shù)據(jù)模型。生物信息學(xué)應(yīng)該有助于回答這些問題。例如，信號通路網(wǎng)絡(luò)通過IPA分析進(jìn)行挖掘，樞紐分子被識別并用于開發(fā)樞紐分子特征模型，以評估OC生存風(fēng)險。利用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析建立共表達(dá)基因模塊，尋找臨床性狀相關(guān)分子。選擇與臨床性狀相關(guān)的基因共表達(dá)模塊，并利用共表達(dá)模塊中的樞紐基因進(jìn)一步建立基因簽名的預(yù)后模型。此外，根據(jù)OC的糖代謝通路，lncRNA SNHG3被認(rèn)為是靶向OC糖代謝通路的潛在治療靶點。多種分析方法的整合將為基于分子通路網(wǎng)絡(luò)的人類OCs生物標(biāo)志物和治療靶點提供多視角特征選擇。隨著多組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展，癌癥實踐中必須從單因素模型向多參數(shù)系統(tǒng)模型轉(zhuǎn)變。分子通路網(wǎng)絡(luò)是實現(xiàn)這種模式改變的重要途徑，而基于分子通路網(wǎng)絡(luò)的生物標(biāo)志物和治療靶點將在癌癥治療中更加可靠、有效。在此，我們推薦并強(qiáng)調(diào)分子通路網(wǎng)絡(luò)在識別可靠而有效的人類OCs生物標(biāo)志物和治療靶點方面的高度科學(xué)價值。

5. 結(jié)論

線粒體在影響腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、生長、轉(zhuǎn)移、血管生成和生存等生物學(xué)行為方面具有非常復(fù)雜的功能。除了積極產(chǎn)生能量代謝外，線粒體還具有廣泛的影響癌細(xì)胞的生物學(xué)功能，如mtDNA突變、有絲分裂、轉(zhuǎn)錄和信號網(wǎng)絡(luò)、生物發(fā)生和循環(huán)、氧化應(yīng)激、裂變和融合動力學(xué)、耐藥性、細(xì)胞凋亡和死亡、干性和代謝重編程。此外，越來越多的證據(jù)表明，線粒體可以通過一些未知的過程進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)非編碼RNA。近年來有關(guān)RNA導(dǎo)入線粒體的功能影響和分子機(jī)制的研究進(jìn)展，使線粒體生物學(xué)的研究更加復(fù)雜和豐富。線粒體也與其他細(xì)胞器(過氧化物酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng))和細(xì)胞核通過囊泡運輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和膜接觸位點進(jìn)行通信。線粒體生物學(xué)的相互作用導(dǎo)致了人類癌癥中一個復(fù)雜的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。線粒體的靈活性和可塑性也可用于解決腫瘤免疫逃逸機(jī)制、多藥耐藥和輻射敏感性等癌癥治療問題。因此，在慢性阻塞性肺疾病的聯(lián)合治療中，必須考慮將靶向線粒體作為一種治療干預(yù)手段。

多組學(xué)為闡明OC中線粒體的多種生物學(xué)功能提供了重要的潛力。我們建立了人類OC與對照卵巢組織的線粒體蛋白質(zhì)組分析，構(gòu)建了基于線粒體蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的分子通路網(wǎng)絡(luò)，以探索OC的分子機(jī)制并發(fā)現(xiàn)OC的生物標(biāo)志物和治療靶點。此外，線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)已被用于分析OC細(xì)胞的相關(guān)藥物敏感性、耐藥性和輻射耐藥性。另外，線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)和其他組學(xué)數(shù)據(jù)的整合有助于全面理解線粒體在OC中的生物學(xué)功能，并有助于有效和精確地治療卵巢病變。在這里，我們進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)，線粒體功能障礙和能量缺乏是癌癥的標(biāo)志，包括OC和乳腺癌。線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)與其他組學(xué)的結(jié)合將是了解癌癥生物學(xué)、發(fā)現(xiàn)新的癌癥治療靶點、為患者分層和個性化治療識別有效的生物標(biāo)志物的有效方法。本文提出了這種在OC中基于MS的線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)與其他組學(xué)技術(shù)相結(jié)合，是使患者受益的一流研究和實施的極具吸引力的策略，這是原理模型的證明，該模型可輕松應(yīng)用于其他類型的癌癥，尤其是最具侵襲性的乳腺癌伴有線粒體功能障礙/能量缺乏。