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1.使用新的亨廷頓疾病模型-BACHD大鼠，并提取BACHD大鼠的紋狀體和皮層。利用泛素化抗體富集和液相色譜質譜，分別對野生型大鼠和BACHD大鼠腦波紋體和皮層內泛素化蛋白進行檢測。

2.構建EGFP融合質粒，將大鼠皮質神經(jīng)元細胞內亨廷頓蛋白第6位和第9位賴氨酸突變?yōu)榫彼?，觀察亨廷頓蛋白的在細胞內的聚集情況并研究亨廷頓蛋白聚合物的溶解特性。

3.在HK293細胞中重復皮質神經(jīng)元內亨廷頓蛋白賴氨酸突變試驗，并檢測其對于細胞的損傷作用及致死性。

4.利用蛋白組技術對亨廷頓蛋白賴氨酸突變后的HK293細胞進行蛋白組變化檢測，分別探究10%SDS溶解條件下和NP-40溶解條件下，蛋白質組分的變化情況，并對差異蛋白進行生物信息學分析。

1. 亨廷頓疾病大鼠中亨廷頓蛋白突變體第6和9位賴氨酸特異性泛素化

亨廷頓疾病的動物模型對于闡明該疾病的重要途徑非常重要，該研究利用了一個新的亨廷頓疾病模型-BACHD大鼠，此模型克服現(xiàn)有小鼠模型的許多缺點。BACHD大鼠表達具有97個谷氨酰胺殘基的人全長亨廷頓蛋白，這些大鼠表現(xiàn)出早期亨廷頓疾病缺陷。為了檢測大鼠中亨廷頓突變蛋白的泛素化分布，對15個月齡BACHD大鼠的大腦切片（紋狀體和皮層）進行了蛋白質組學分析，并與相應野生型大鼠進行了比較（圖1A）。經(jīng)過泛素化抗體富集和質譜檢測，研究人員發(fā)現(xiàn)，在皮質和紋狀體組織中亨廷頓突變蛋白（mutanthuntingtin ，mHtt）的N末端結構域第6和第9位賴氨酸均高度泛素化，與野生型亨廷頓蛋白同源的兩個賴氨酸殘基形成鮮明對比（圖1B）。重要的是，在BACHD和野生型大鼠中，亨廷頓蛋白的N末端結構域的第15位賴氨酸殘基都沒有被泛素化修飾(圖1C)。

圖1 在亨廷頓疾病中亨廷頓突變蛋白外顯子1高度特異性泛素化

A.蛋白組檢測野生型和BACHD大鼠中泛素化修飾的流程。B.野生型和BACHD大鼠腦標本中差異表達泛素化肽段的火山圖。C.不同樣本中第6和9位賴氨酸上泛素化的亨廷頓蛋白N端肽段的強度以及總亨廷頓蛋白的測量值。

2. 亨廷頓突變蛋白的泛素化導致形成更多更大的可見聚集體

為了檢測亨廷頓突變蛋白特異性泛素化對聚集體形成的潛在作用，研究人員將兩個賴氨酸殘基替換為不能泛素化的精氨酸殘基，構建了編碼亨廷頓突變基因外顯子1的兩個質粒，其中含有134個谷氨酰胺殘基(圖2A)。兩個質粒分別為未突變賴氨酸(Htt134Q)表達蛋白質粒，和將賴氨酸6和9突變?yōu)榫彼?Htt134Qm)表達蛋白質粒。為了便于觀察聚集情況，在質粒末端同時插入含有熒光蛋白EGFP的片段。研究人員在原代培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元中，使用了長期成像技術跟蹤這兩種質粒表達蛋白的變化。結果顯示，與Htt134Qm細胞相比，表達含有兩個賴氨酸殘基蛋白的細胞(Htt134Q)中可見聚集物的數(shù)量和大小明顯更大(圖2B-E)。賴氨酸突變對于單個團聚體形成速率影響較小(圖2F)，在沒有賴氨酸6和9的情況下(大的)聚合成核速率較慢。

 圖2 Htt134Q:EGFP N端結構域的位點特異性泛素化影響聚集物的數(shù)量和大小，但不影響其生長動力學

A.質粒FU-Htt134Q:EGFP的結構示意圖。B.慢病毒轉染后皮質神經(jīng)元的延時圖像FU-Htt134Q:EGFP-Wm或FU-Htt134Qm:EGFP-Wm。C.轉染引起的聚集體總數(shù)量隨時間的變化(單個實驗中每個條件的一個感興趣的區(qū)域)。D.三種不同的實驗，轉染后聚集體的總數(shù)量隨時間的變化。在每個實驗中，聚合數(shù)被均一化為Htt134Q:EGFP在第11和12天的平均聚合計數(shù)。E.聚合熒光信號轉染后隨時間的變化。取三個獨立實驗的平均值。(F)單個團聚體的形成率。個體聚集被追溯到它們出現(xiàn)的那一刻。然后獲得每個聚集體隨時間變化的熒光值，并根據(jù)在聚集體出現(xiàn)之前測量的背景熒光值進行校正。

3. 泛素化的亨廷頓蛋白聚集物比其賴氨酸突變聚集物更少且更易溶解

為了研究泛素化對聚集物特性的影響，研究人員分別采用溫和裂解條件（NP-40）和更烈性的溶解條件(10%十二烷基硫酸鈉[SDS])溶解表達Htt134Q:EGFP、Htt134Qm:EGFP和Htt17:EGFP(具有17個谷氨酰胺重復的外顯子1)的HEK293細胞。從NP-40可溶性實驗可以看出，Htt134Q:EGFP比賴氨酸突變細胞在NP-40中溶解性更強（圖3A），蛋白質組學可溶性分析顯示，大量來源于Htt17Q:EGFP的肽完全溶解,來自Htt134Q:EGFP蛋白質或肽段少數(shù)溶解,以及來自Htt134Qm:EGFP的蛋白質多肽和肽極少溶解(圖3B)。10%SDS可溶性的點免疫分析顯示，大多數(shù)Htt134Qm:EGFP可溶(圖3C)。雖然在數(shù)量和大小上可見Htt134Qm:EGFP聚合物總量均明顯小于由Htt134Q: EGFP產(chǎn)生的聚合物(圖2C-E)，但從點免疫強度可以明顯看出，在Htt134Qm:EGFP表達細胞中病理蛋白的數(shù)量始終較高。

解釋這一現(xiàn)象的最合理原因是：Htt134Qm: EGFP總量遠遠大于那些Htt134Q:EGFP,但Htt134Qm大多數(shù)是看不見的，熒光顯微鏡檢查時由于方法的分辨率和靈敏度有限無法直接檢測出來(圖2C和D)。作者同樣發(fā)現(xiàn)，K6位點泛素化只在Htt134Q:EGFP變體中被發(fā)現(xiàn)，并且只出現(xiàn)在在其不可溶部分中(圖3D)。因此，泛素化似乎是唯一的不溶性聚集物，很可能是泛素化影響聚集形式，進而決定聚集物的大小和數(shù)量。

圖3 對不同突變細胞內聚集物特性的探究

(A)使用抗htt(i)或抗EGFP (ii)抗體對NP-40可溶性部分中的mHtt變體(17Q:EGFP,134Q:EGFP，和134Qm:EGFP)進行Westernblot分析。(B) NP-40可溶性組分的質譜分析:(i)基于質譜的對mHtt肽定量;(ii)基于質譜對所有EGFP多肽的定量。(C)NP-40不溶性和10% SDS可溶性餾分分析。(i)對三個獨立實驗的不溶性部分進行Dotblot分析；(ii) Htt134Q:EGFP和Htt134Qm:EGFP的平均強度。(D)基于質譜對NP-40可溶性和不可溶性中Htt-k6泛素化肽的定量(10%SDS可溶)。

4. Htt位點特異性泛素化可降低細胞死亡

為了研究賴氨酸6和9殘基泛素化的潛在病理生理效應，作者首先在HEK293細胞中重復在培養(yǎng)的神經(jīng)元中的結果。為此，使用了高含量成像系統(tǒng)分析大量表達Htt134Q:EGFP和Htt134Qm:EGFP(以及HttQ17: EGFP)的HEK293細胞。如圖4A所示，使用Htt134Qm:EGFP轉染后的HEK293細胞中可見聚集物數(shù)量低于Htt134Q:EGFP產(chǎn)生的聚集物數(shù)量，基本再現(xiàn)了原代神經(jīng)元中觀察到的現(xiàn)象(圖2C和D)。細胞計數(shù)(圖4B)和活/死標記(圖4C)結果顯示，與表達Htt134Q:EGFP的細胞相比，Htt134Qm:EGFP的表達導致活細胞數(shù)量的顯著減少及更高水平的細胞死亡。同時，在SH-SY5Y神經(jīng)母細胞瘤細胞中表達Htt134Q:EGFP和Htt134Qm:EGFP時也觀察到類似的現(xiàn)象（圖4C）。

圖4 Htt134Q:EGFP泛素化緩解mHtt的蛋白毒性作用

A.HEK293細胞過表達FU-Htt134Q:EGFP-Wm或FUHtt134Qm:EGFP-Wm用DNA結合染料NucBlue染色.(B)用FU-Htt134Q:EGFP-Wm或FU-Htt134Qm:EGFP-Wm轉染HEK293細胞。(C)用FU-Htt134Q:EGFP-Wm或FU-Htt134Qm:EGFP-Wm轉染HEK293和SH-SY5Y細胞。死亡細胞的百分比以PI陽性細胞相對于NucBlue陽性細胞的數(shù)量計算。(i)HEK293細胞的代表性圖像PI陽性(紅色)和NucBlue陽性（藍色）。(ii和iii)HEK293 (ii)和SH-SY5Y(iii)細胞的死亡細胞百分比。

5. 細胞內蛋白組變化與N末端泛素化位點消除有關

在Htt134Q:EGFP中，用精氨酸取代6和9位賴氨酸，使聚集體延遲出現(xiàn)、產(chǎn)生更多更小的可溶性聚集物、及導致更高的細胞死亡。為了闡明這些突變損害細胞活力的潛在機制，研究人員對表達Htt134Q:EGFP、Htt134Qm:EGFP或Htt17Q:EGFP的HEK293細胞進行了蛋白質組學分析。主要包括兩個類型的試驗：1.用10%的SDS溶解細胞，經(jīng)SDS/聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并對凝膠中積累的物質進行質譜分析。2.在較溫和的條件下提取細胞內容物(NP-40)，再用10%的SDS溶解，然后對每個部分進行蛋白質組分析。結果顯示，對不溶性部分的蛋白質組學分析反應Htt134Q:EGFP/Htt134Qm:EGFP和Htt17Q:EGFP之間、Htt134Q:EGFP和Htt134Qm之間的巨大差異。然而，并未發(fā)現(xiàn)表達不同蛋白質的細胞之間及兩種實驗之間有顯著差異。因此，許多蛋白質與mHtt聚集物相關聯(lián)，但這種關聯(lián)是相對非特異性的，不依賴于N端位點泛素化與否。

研究人員進一步分析發(fā)現(xiàn)，在表達Htt134Q:EGFP的細胞中有相當數(shù)量的蛋白質比那些表達Htt134Qm:EGFP的細胞更豐富，對這些蛋白的功能分析指出了多種生物過程存在顯著變化（圖5B）。受到影響最深的途徑包括RNA代謝、細胞內轉運、線粒體相關代謝和基因調控等。與之相反，對表達Htt134Qm的細胞中豐度增加的蛋白質進行類似的分析表明，這些通路的變化更小。以上分析表明，在賴氨酸位點被突變的細胞中，細胞對mHtt表達的反應較弱，這可能意味著應對蛋白毒性應激所需的誘導機制減少。

此外，為了進一步鑒定特異性蛋白以及探究蛋白在不同細胞內豐度變化，研究人員采取了更為嚴格限制條件：1.至少在四次實驗中重復鑒定到；2.最小變異系數(shù)位1.75；3.Htt134Qm:EGFP 組內p值小于0.05.經(jīng)過篩選共鑒定到12個差異表達的蛋白。這些差異蛋白一定程度上解釋了，表達mHtt外顯子1缺乏泛素化位點細胞存活率較低的原因。

圖5 Htt134Q:EGFP泛素化對細胞蛋白質組的影響

(A)相對于Htt134Qm:EGFP的細胞，在表達Htt134Q:EGFP細胞中上調的蛋白數(shù)，反之亦然。(B)使用STRING數(shù)據(jù)庫對A中顯示的差異表達蛋白進行生物過程富集，(i)從分析凝膠溶解蛋白得到的數(shù)據(jù);(ii)NP-40溶解蛋白的數(shù)據(jù)。

神經(jīng)退行性疾病(如阿爾茨海默病、帕金森氏癥和亨廷頓氏舞蹈病)的特征是在大腦不同區(qū)域產(chǎn)生聚合蛋白。這些大的聚集物來源于較小的、不可見的、可溶的低聚物/聚集物，并被認為與基本的細胞機制不同，所以導致疾病的發(fā)生。與之形成對比的是，許多途徑通過降解/捕獲小分子，進而抑制聚合物的形成。通常以降解蛋白為靶標的泛素化，在這一過程中發(fā)揮的作用尚不清楚。研究人員證實，泛素化的致病Htt是重要的，它可以降低有害性。抑制其泛素化導致產(chǎn)生大量的小的和不可見的聚集物，這些小的不可見的聚集物對細胞更加有害。這一發(fā)現(xiàn)闡明了泛素化在塑造mHtt聚集物的大小、數(shù)量、可能的形態(tài)方面的新作用，以及它可能通過何種方式減弱mHtt的致病性，該結論對于防治亨廷頓氏舞蹈病具有潛在作用。

在本文中，研究人員使用一種新的HD模型(細菌人工染色體HD[BACHD]大鼠)，對表達不同mHtts的神經(jīng)元進行長期成像，生化分析，以及蛋白質組學分析，以探究mHtt泛素化對其聚集和隨后的細胞反應的影響。結果顯示，mHtt第一個外顯子中的兩個賴氨酸殘基6和9位在BACHD大鼠的紋狀體和皮質腦區(qū)域特異性泛素化，而野生型(WT)大鼠則未出現(xiàn)。含有134個谷氨酰胺重復體的mHtt(含有EGFP標簽)外顯子1的細胞表達試驗證實，當這些泛素化位點發(fā)生改變時，可見聚集物的數(shù)量和大小顯著減少。然而，生化分析顯示賴氨酸突變后聚集物的可溶性更低，其數(shù)量明顯高于泛素化蛋白，而且其中許多聚集物體積很小，在光學上不可見，但在生物化學上可檢測到。重要的是，這些小的聚集物對細胞的傷害比它們的非突變同類更大，會導致更多的細胞死亡。與這些發(fā)現(xiàn)相關聯(lián)的是，蛋白質組學分析表明泛素化的mHtt可以更有效地誘導多種細胞反應，這可能是為了應對mHtt表達所帶來的細胞應激。相反，缺乏這些泛素化位點的mHtt變體只能誘發(fā)較弱的反應。