編譯：陳康，編輯：小菌菌、江舜堯。
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背景與目的：腸道菌群失調(diào)與非酒精性脂肪肝疾?。?/span>NAFLD）有關(guān)。我們調(diào)查了益生菌與益生元相組合的合生元是否影響肝臟脂肪含量，NAFLD患者的肝纖維化以及糞便微生物組的組成。
方法：我們?cè)谟?guó)對(duì)104例NAFLD患者進(jìn)行了一項(xiàng)雙盲2期試驗(yàn)。參加者（平均年齡，50.8±12.6歲；男性為65％；37％為糖尿病患者）隨機(jī)分配給定合生元藥物（低聚果糖，4g兩次每天，加上Bifidobacterium animalis subs. Lacits BB-12;n = 55）或安慰劑（n = 49）持續(xù)10-14個(gè)月。在研究的開始和結(jié)束時(shí)，通過核磁共振光譜法（MRS）測(cè)量肝臟脂肪含量，肝纖維化是由經(jīng)過驗(yàn)證的生物標(biāo)志物評(píng)分系統(tǒng)以及振動(dòng)控制的瞬態(tài)彈性成像來確定。分別在研究的開始和結(jié)束收集糞便樣本，并通過16S rDNA測(cè)序分析了糞便微生物群。
結(jié)果：在實(shí)驗(yàn)開始（基線）和研究結(jié)束時(shí)，合生元組的脂肪含量百分比值分別為32.3％±24.8％和28.5％±20.1％；安慰劑組為31.3％±22％和25.2％±17.2％。在未經(jīng)參數(shù)校準(zhǔn)的情況下，我們沒有發(fā)現(xiàn)肝臟脂肪在兩組中有顯著差異（β= 2.8；95％CI，-2.2至7.8； P = 0.30）。在參數(shù)校準(zhǔn)后的回歸模型中（針對(duì)基準(zhǔn)肝臟脂肪加上年齡，性別，體重差異和基線體重），僅體重的減輕與肝臟脂肪減少有關(guān)（β= 2； 95％CI，1.5-2.6；P = 0.03）。接受合生元干預(yù)的患者的糞便樣本中與基線相比，糞便的Bifidobacterium 和Faecalibacterium的豐度上升，以及Oscillibacter和Alistipes豐度的減少；安慰劑組未觀察到這些變化。糞便微生物群的組成變化與肝臟脂肪含量或肝臟纖維化無關(guān)。
結(jié)論：在一項(xiàng)針對(duì)NAFLD患者的隨機(jī)試驗(yàn)中，1年內(nèi)給予合生元干預(yù)（益生菌和益生元）改變了糞便微生物群，但沒有改善肝臟脂肪含量或肝纖維化。
論文ID
原名：Synbiotic Alters Fecal Microbiomes, but not Liver Fat or Fibrosis, in a Randomized Trial of Patients With Non-alcoholic Fatty Liver Disease
譯名：在一項(xiàng)針對(duì)非酒精性脂肪肝患者的隨機(jī)試驗(yàn)中，“共生”改變了糞便微生物群，但不改變肝臟脂肪或纖維化
期刊：Gastroenterology
IF：19.233
發(fā)表時(shí)間：2020.1.25
通訊作者：Eleonora Scorletti
作者單位：Faculty of Medicine, University of Southampton and Division of Gastroenterology, University of Pennsylvania
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
104名已證明NAFLD的參與者被隨機(jī)分配至合生元干預(yù)組或安慰劑組，實(shí)驗(yàn)期為最少10個(gè)月，最多14個(gè)月（圖1）。對(duì)于實(shí)驗(yàn)期間抗生素的使用我們有規(guī)定以便實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)干預(yù)期最多允許患者進(jìn)行兩個(gè)療程的抗生素服用，在實(shí)驗(yàn)測(cè)量前的一個(gè)月不允許有抗生素的服用。55名參與者被隨機(jī)分配接受合生元治療，合生元包括果糖寡糖，聚合度<10，每袋4 g，每天兩次（兩袋一天，放入冷飲中攪拌服用）再加上Bifidobacterium animalis subsp. lactisBB-12，每天服用至少100億個(gè)CFU（每天1個(gè)膠囊），有49名參與者隨機(jī)接受安慰劑，每天兩次服用4克麥芽糖糊精（每天1粒膠囊每天加兩小包，攪拌成冷飲）。
結(jié)果
104個(gè)參與者中有89個(gè)完成了整個(gè)干預(yù)階段（58個(gè)男性，31個(gè)女性）表1顯示了，在基線上，合生元組和安慰劑組之間的肝臟指標(biāo)，雙歧桿菌豐度以及主要臨床和生化參數(shù)沒有差異。表2顯示了基線與實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)之間一些生理生化指標(biāo)的變化。在基線水平上，腸通透性測(cè)量（乳果糖/甘露醇）為：中位數(shù)= 0.11，四分位間距（IQR）= 0.25；平均值±標(biāo)準(zhǔn)差0.27±0.4（表2）。由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)象不是健康的對(duì)照組，我們將基線乳果糖/甘露醇比率與健康受試者的比率進(jìn)行了比較。值得注意的是，乳果糖/甘露醇比的平均值和中值比健康受試者大10倍，說明在NAFLD患者中腸道通透性改變。我們發(fā)現(xiàn)在合生元干預(yù)組和安慰劑組中在基線和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)腸道通透性都沒有變化。有趣的是，89位患者完成了實(shí)驗(yàn)后，通過MRS測(cè)量的肝臟脂肪含量總體減少了65％。關(guān)于LPS，在安慰劑組（p = 0.80）或治療組（p = 0.40）中基線與實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)之間都沒有差異。合生元的治療未影響LPS在血清的水平。在研究結(jié)束時(shí)，肝臟脂肪變化與LPS變化之間的沒有關(guān)聯(lián)（p = 0.80）。我們使用一個(gè)回歸模型來觀察合生元對(duì)糞便SCFA的影響，這個(gè)模型歸納了各個(gè)SCFA的差異，年齡，性別，組別以及基線的SCFA水平。我們發(fā)現(xiàn)合生元并未對(duì)SCFA產(chǎn)生影響（總SCFAp = 0.21；乙酸p = 0.23;丙酸p = 0.24;丁酸p = 0.40）。關(guān)于肝臟脂肪含量，我們采用肝臟脂肪含量差異作為回歸模型結(jié)果變量，對(duì)性別，年齡，體重差，基線體重，在基線的肝臟脂肪含量和SCFA的差異進(jìn)行校準(zhǔn)。我們發(fā)現(xiàn)SCFA的變化與肝臟脂肪百分比的變化沒有關(guān)系：SCFAs = 0.63；乙酸p = 0.62;丙酸p = 0.78；丁酸p = 0.73。
表3展示了基線水平和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的主要數(shù)據(jù)以及多元線性回歸模型。在合生元干預(yù)組，肝臟脂肪減少4% (p=0.08)，Bifidobacterium顯著增加(p<0.001)。合生元對(duì)肝臟脂肪減少?zèng)]有顯著的作用。在安慰劑組，肝臟脂肪顯著減少6%(p=0.01)，Bifidobacterium沒有變化(p=0.5)。在未進(jìn)行參數(shù)校準(zhǔn)的分析中，肝臟脂肪變化在兩組之間不顯著(β=2.8; 95%CI:-2.2, 7.8;p=0.3），在性別，年齡，體重差別，體重的基線水平，肝臟脂肪含量的基線水平進(jìn)行參數(shù)校準(zhǔn)后，合生元和安慰劑組剛好到達(dá)顯著水平(β=4.1; 95%CI:-0.02, 8.3; p=0.05)。
在多變量回歸模型中，體重減少是與肝臟脂肪顯著減少的唯一相關(guān)因素每公斤體重減輕與肝臟脂肪減少2％有相關(guān)性（β= 2.0; 95％CI：1.5，2.6; p = 0.03）（表3）。我們?nèi)缓笠愿闻K脂肪差異作為結(jié)果變量進(jìn)行回歸建模，體重變化（這里是體重減少）作為解釋變量。數(shù)據(jù)表明體重減少是與肝臟脂肪顯著減少密切相關(guān)（β= 1.9； 95％CI 1.4, 2.5；p ＜0.001）。我們使用了2個(gè)肝臟纖維化評(píng)分模型（即ELF和NAFLD纖維化評(píng)分），我們采用了與肝臟脂肪相同的回歸模型校準(zhǔn)了纖維化得分的基線結(jié)果以及年齡，性別，體重差異和基線體重。我們沒有發(fā)現(xiàn)肝纖維化評(píng)分與合生元治療相關(guān)（表3）。我們還測(cè)試了肝臟的硬度測(cè)量值（kPa）對(duì)合生元干預(yù)的反應(yīng)（由VCTE評(píng)估）。在包含基線和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的肝硬度數(shù)據(jù)差值作為結(jié)果變量的回歸模型中，對(duì)肝硬度基線測(cè)量值以及年齡，性別，體重差異和基線體重進(jìn)行參數(shù)調(diào)整后，發(fā)現(xiàn)合生元與肝硬度的變化無關(guān)（B系數(shù)= -0.78（95％CI -1.93，0.37），p = 0.18）。因此，這些數(shù)據(jù)表明，合生元不太可能影響肝臟脂肪或肝纖維化。體重減輕與肝臟纖維化和肝硬度改善有關(guān)：ELF（p = 0.039）和NAFLD纖維化評(píng)分（p = 0.027）（表3），以及肝硬度值（p = 0.025）有關(guān)。有趣的是，在合生元組內(nèi)，發(fā)現(xiàn)Bifidobacteriumspp.豐度的變化與肝臟脂肪的變化有負(fù)相關(guān)（Spearman rho =-0.36，p = 0.017）。但是，在對(duì)體重變化，年齡和性別進(jìn)行參數(shù)調(diào)整之后，不再有關(guān)聯(lián)了（Spearman的rho = -0.10，p = 0.51）。我們還測(cè)試了Bifidobacteriumspp.豐度的變化與研究結(jié)束時(shí)主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)聯(lián)，值得注意的是，我們沒有發(fā)現(xiàn)研究結(jié)束時(shí)Bifidobacteriumspp.豐度的變化和肝臟脂肪變化以及纖維化評(píng)分有關(guān)聯(lián)。而且，體重變化與合生元治療以及Bifidobacteriumspp. 豐度的變化之間沒有關(guān)聯(lián)。在一個(gè)使用Bifidobacteriumspp.豐度的變化作為結(jié)果變量的多變量回歸模型中，對(duì)分組，年齡，研究結(jié)束時(shí)的性別和體重差異進(jìn)行參數(shù)調(diào)整后，體重差異，年齡和性別與雙Bifidobacteriumspp.豐度變化無明顯關(guān)聯(lián)。
在基線時(shí)，兩組之間的糞便微生物組無差異。（表S4，表S5，圖S1），Sphingomonas 和 Sutterella與肝纖維化評(píng)分之間的有正相關(guān)，而Olsenella與MRS測(cè)量的肝臟脂肪之間有負(fù)相關(guān)。Clostridia和 Firmicutes與肝纖維化得分有負(fù)相關(guān)（表4）。總細(xì)菌含量不受合生元干預(yù)的影響（圖S2）。合生元治療與減少個(gè)體內(nèi)微生物豐富度多樣性（α-多樣性）有正相關(guān)（richness level），但在均勻度水平（evenness level）或均勻度和豐富度水平（evenness and richness levels）（表S4）上沒有關(guān)系，合生元可能與低豐度的菌種的消失有關(guān)。從β多樣性指數(shù)Morisita-Horn可以看到微生物群落之間的差異（圖2A，主坐標(biāo)分析）。觀察到的β多樣性分布主要是由于個(gè)體間的差異（解釋了總變化的86％，ANOSIM，1000 permutationtest，p = 0.001）。為了評(píng)估合生元治療與安慰劑治療相比是否對(duì)微生物群結(jié)構(gòu)有更大影響，我們比較了來自同一個(gè)個(gè)體的每一對(duì)樣本（基線和研究結(jié)束，通過β多樣性指數(shù)計(jì)算）（圖2B）。合生元組顯示出比安慰劑組更高的β多樣性值，表明合生素治療對(duì)腸道菌群的影響更大。當(dāng)觀察其他β-多樣性時(shí)，如Binary-Jaccard和Bray-Curtis獲得了相似的結(jié)果（圖2B）。按照這些觀察結(jié)果，與安慰劑相比，合生元治療促進(jìn)了Bifidobacterium 和Faecalibacterium 減少了 Oscillibacter 和 Alistipes（圖3，表S6），在其上一級(jí)分類中也有顯著意義。在門級(jí)（圖S3）或任何其他分類上都沒有顯著意義（表S7，圖S4）。通常與炎癥，肥胖和NAFLD有關(guān)的細(xì)菌沒有變化（圖S5）。令人驚訝的是，只有Oscillibacter 在分析調(diào)整模型后，與MRS測(cè)得的肝臟脂肪有負(fù)相關(guān)（β=-2.2; 95％CI：-4.3，-0.1； p = 0.04）。Bifidobacterium spp.增加了2.2倍，也通過qPCR確認(rèn)了這一點(diǎn)（圖S2）。
討論
我們的研究是第一個(gè)測(cè)試長(zhǎng)達(dá)12個(gè)月合生元治療療效的研究。我們測(cè)定了肝臟脂肪含量，NAFLD的纖維化評(píng)分（ELF和NAFLD纖維化評(píng)分），肝硬度測(cè)量，和腸道菌群的變化。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，我們沒有發(fā)現(xiàn)合生素和安慰劑組之間任何肝臟脂肪含量，纖維化評(píng)分和肝硬度測(cè)量值的差異。
我們發(fā)現(xiàn)了65％的參與者的肝臟脂肪總體減少僅與體重減少有關(guān)，從非標(biāo)準(zhǔn)化的β系數(shù)來看，體重減輕1 kg，肝臟脂肪百分比減少2％。體重減輕也與ELF和NAFLD纖維化評(píng)分和肝硬度的改善有關(guān)。大多數(shù)患者的肝臟脂肪含量均有改善，我們猜測(cè)與“臨床效應(yīng)”有關(guān)，即參與者將從參與臨床試驗(yàn)中受益。在參與試驗(yàn)期間我們給予了健康生活的指導(dǎo)。我們發(fā)現(xiàn)合生元組中腸道菌群的變化，并且合生元治療后顯著改變了腸道菌群的多樣性。Bifidobacterium 和Faecalibacterium的增加和Oscillibacter和Alistipes的減少。Bifidobacterium是已知對(duì)脂質(zhì)代謝和腸屏障有一些有益的作用。但是，我們找不到Bifidobacterium與肝臟脂肪變化（在調(diào)整了體重減輕之后）或腸道（調(diào)整年齡，性別和腸道基線測(cè)量值后的通透性滲透性（乳果糖/甘露醇比））上的變化有關(guān)。
據(jù)報(bào)道，抗炎細(xì)菌Faecalibacterium prausnitzii在NAFLD中降低，且不依賴于肥胖和胰島素抵抗，并且在攝入菊粉型果聚糖后會(huì)增加。Faecalibacterium prausnitzii也顯示與在肝臟門管區(qū)（portal tract）的淋巴細(xì)胞和Kupffer cells標(biāo)志物有負(fù)相關(guān)。相反，Alistipes spp已顯示與肝炎和氧化應(yīng)激正相關(guān)因此，我們可以推測(cè)Faecalibacteriumprausnitzii的增加Alistipes spp減少與合生素治療相關(guān)，可能會(huì)減輕炎癥。特別是，通常與炎癥，肥胖和NAFLD的細(xì)菌均未受到影響（圖S5）。Raman等人的最新研究，將NAFLD肥胖患者的糞便微生物群與健康對(duì)照組進(jìn)行了比較。這些作者表明，NAFLD患者的Oscillibacter明顯低于健康對(duì)照。因?yàn)槲覀冞@個(gè)研究沒有健康對(duì)照，所以我們與其他研究做了對(duì)比，對(duì)比發(fā)現(xiàn)Proteobacteria在NAFLD患者中高于健康人群2倍。
在這個(gè)研究中，我們選擇Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12作為益生菌是因?yàn)樗鼘?duì)宿主有益處以及有很好的定殖能力。聚合度小于10的果寡糖的選擇是基于其能夠刺激Bifidobacteria的增殖。與菊粉相比，果寡糖對(duì)我們的Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12益生菌很較強(qiáng)的親和力，并改善其在宿主中的存活和生長(zhǎng)。此外，我們還研究了使用經(jīng)過驗(yàn)證的體外糞便細(xì)菌培養(yǎng)系統(tǒng)來模擬病情，Bifidobacterium animalissubsp. lactis BB-12以及果寡糖在體外對(duì)人類腸道菌群的作用，表明，使用合生元或益生元與單獨(dú)的益生菌或陰性對(duì)照相比，細(xì)菌總數(shù)和bifidobacteria總數(shù)顯著增加，此外，合生元補(bǔ)充劑耐受良好。
在試驗(yàn)期間，僅一名患者經(jīng)歷了一些腸胃不適癥狀（腹脹和腸胃氣脹）。我們建議該參與者在一天中分次補(bǔ)充合生元，隨后沒有進(jìn)一步胃腸道不適進(jìn)而完成了實(shí)驗(yàn)。很多關(guān)于合生元干預(yù)NAFLD實(shí)驗(yàn)，都包括了個(gè)體正常藥物干預(yù)。我們的實(shí)驗(yàn)個(gè)體除合生元干預(yù)外，沒有其他的可能會(huì)減少肝臟脂肪的藥物的干預(yù)，很多研究都沒有考慮或者分析數(shù)據(jù)時(shí)沒有對(duì)混雜因子進(jìn)行校準(zhǔn)，例如鍛煉和體重變化。并且很多研究沒有提到樣本大小，不提供統(tǒng)計(jì)功效（Statistical power），樣本量不足會(huì)導(dǎo)致1類型的統(tǒng)計(jì)學(xué)錯(cuò)誤。這些都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。之前的研究了囊括了多菌種的合生元對(duì)NAFLD影響，對(duì)NAFLD有改善作用，可能是因?yàn)樘砑佣嘀鼐N比單獨(dú)一個(gè)菌種效果要好，因?yàn)槟軌蛴绊懜嗟哪c道細(xì)菌種類，而這僅僅我們的猜測(cè)，因?yàn)檫@個(gè)研究也包括了藥物的使用，并沒有對(duì)藥物的影響進(jìn)行消除。另外一個(gè)影響可能是每個(gè)個(gè)體對(duì)合生元的反應(yīng)是不一樣的。我們的研究沒有對(duì)腸道菌群在基線水平上進(jìn)行隨機(jī)區(qū)塊分組，所以我們也不知道哪些個(gè)體對(duì)合生元具有反應(yīng)。
這個(gè)研究我們既有優(yōu)勢(shì)也有劣勢(shì)。優(yōu)勢(shì)是：研究的安慰劑對(duì)照；長(zhǎng)時(shí)間的干預(yù)；對(duì)參與個(gè)體的充分了解；在回歸模型上對(duì)混雜因子進(jìn)行參數(shù)調(diào)整；我們之前用了體外模型進(jìn)行模擬。我們的劣勢(shì)是：第一，我們只選擇了一中益生菌，盡管Bifidobacterium animalissubspecies lactis (BB12)很容易定殖并有益于腸道以及果寡糖可以改善脂代謝。在腸道菌群失調(diào)情況下，革蘭氏陰性菌產(chǎn)生大量毒素，損害腸道，并通過血液循環(huán)達(dá)到肝臟從而損害肝臟。我們的理論是使用益生菌改善腸道菌群，從而減少腸道毒素對(duì)肝臟的危害。其次，該研究被設(shè)計(jì)為2期臨床試驗(yàn)，以測(cè)試此干預(yù)措施對(duì)肝臟脂肪的影響對(duì)肝臟脂肪的測(cè)量使用的是MRS而非肝臟活檢。已知NAFLD是一種“斑片”疾病和肝臟活檢是侵入性的，昂貴的，并且受樣品變異性的影響。因此，我們沒有實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中包括對(duì)肝活檢的要求。MRS是目前被認(rèn)為是用于精確測(cè)量肝臟脂肪改變百分比的非侵入性的金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，并具有出色的重現(xiàn)性和敏感性。另外，MRS是一種非常敏感的技術(shù)，肝臟脂肪信號(hào)高于背景噪聲水平0.2％以上，就可以得到測(cè)量。此外，由于合生元是安全，便宜的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，可廣泛獲得，我們還認(rèn)為，如果合生元在NAFLD的治療中占有一席之地，那么可能是在早期疾病發(fā)展過程中，對(duì)降低肝臟脂肪含量有作用。因此，我們的意圖是測(cè)試合生元干預(yù)對(duì)肝臟脂肪含量的影響，而不是評(píng)估NASH的組織學(xué)上的變化，NAFLD活動(dòng)評(píng)分的改善或改善肝纖維化。最后，我們沒有在實(shí)驗(yàn)過程中囊括病人的藥物干預(yù)，因?yàn)槲覀兊囊鈭D是測(cè)試單用合生素干預(yù)的效果，消除了這個(gè)混雜因子。
結(jié)論
總之，我們的雙盲，隨機(jī)的，對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，合生元治療，與安慰劑相比，（4 g聚合度<10的低聚果糖，每天兩次服用；再加上Bifidobacterium animalis subsp. lactisBB-12，每天至少100億個(gè)CFU，持續(xù)約12個(gè)月）可以有效改善NAFLD患者的腸道菌群。但是，這種治療方法無法降低的肝臟脂肪含量或改善肝纖維化評(píng)分或肝硬度值。有趣的是，合生元和安慰劑組都顯示出，體重減輕了1 kg，且體重每減輕1kg，肝臟脂肪含量就減少2％（有顯著的相關(guān)性）。體重減輕也與肝臟纖維化得分和肝硬度有關(guān)。因此，我們建議這種合生元對(duì)腸道菌群產(chǎn)生的影響可能不會(huì)對(duì)NAFLD患者肝臟中產(chǎn)生明顯的改變。這種合生元對(duì)已知與炎癥有關(guān)的特定微生物的改變需要我們對(duì)NAFLD中的炎癥/免疫相關(guān)參數(shù)進(jìn)行探究。
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